ГОСТ 32631-2014. Межгосударственный стандарт. Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Почвенные микроорганизмы. Испытание на трансформацию азота
(введен в действие Приказом Росстандарта от 24.09.2014 № 1212-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 1 июня 2015 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 сентября 2014 г. № 1212-ст
МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЙ ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
ПОЧВЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ. ИСПЫТАНИЕ НА ТРАНСФОРМАЦИЮ АЗОТА
Testing methods for chemicals of environmental hazard. Soil microorganisms. Nitrogen transformation test
Дата введения 1 июня 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила, рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Подготовлен Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ» (ФГУП «ВНИЦСМВ») и Техническим комитетом по стандартизации ТК 339 «Безопасность сырья, материалов и веществ» Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии.
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт).
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2014 г. № 67-П).
4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 сентября 2014 г. № 1212-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32631-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2015 г.
5. Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD Test No. 216:2000 Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test (Почвенные микроорганизмы: Испытание на трансформацию азота).
Перевод с английского языка (en).
Степень соответствия — идентичная (IDT).
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения воздействия исследуемого вещества на процессы микробиологической трансформации азота в почве.
2. Термины и определения
В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями:
2.1. Трансформация азота: окончательная минерализация азотсодержащих органических соединений почвенными микроорганизмами посредством процессов аммонификации и нитрификации до соответствующих неорганических нитратов.
2.2. ECx (эффективная концентрация): концентрация исследуемого вещества в почве, которая приводит к X%-му ингибированию трансформации азота в нитраты в течение установленного периода воздействия.
2.3. EC50 (средняя эффективная концентрация): концентрация исследуемого вещества в почве, которая приводит к 50%-му ингибированию трансформации азота в нитраты в течение установленного периода воздействия.
3. Общие сведения
Изучение воздействия химического вещества на деятельность почвенных микроорганизмов может потребоваться, когда необходимы сведения о потенциальных побочных эффектах средств защиты растений на почвенную микрофлору или когда на почвенные микроорганизмы могут оказывать воздействие химические вещества, не являющиеся средствами защиты растений. С целью определения такого воздействия проводится исследование трансформации азота в почве. При тестировании агрохимикатов (например, средств защиты растений, удобрений, лесных химикатов) одновременно проводят исследования трансформации азота и углерода. При тестировании прочих химических веществ достаточно проводить только исследование трансформации азота. Однако, если значение EC50 в исследовании трансформации азота для таких химических веществ попадает в диапазон, определенный для существующих ингибиторов нитрификации (например, нитрапирина), то для получения дополнительной информации может проводиться также исследование трансформации углерода.
Почва состоит из живых и неживых компонентов, которые существуют в виде комплексных и гетерогенных смесей. Микроорганизмы играют важную роль в разрушении и трансформации органического вещества в плодородных почвах, поскольку на различные аспекты плодородия почв оказывают влияние различные виды микроорганизмов. Любое долгосрочное вмешательство в такие биохимические процессы потенциально может препятствовать круговороту питательных веществ, что в свою очередь может вызвать изменения плодородия почв. Трансформация углерода и азота происходит во всех плодородных почвах. Несмотря на то, что микробные сообщества, отвечающие за протекание данных процессов, отличаются в зависимости от почвы, пути трансформации по сути остаются одинаковыми.
Метод, представленный в настоящем стандарте, предназначен для обнаружения долгосрочного побочного воздействия вещества на процесс трансформации азота в аэробной поверхности почвы. Метод также позволяет оценить воздействие вещества на трансформацию углерода почвенной микрофлорой. Образование нитратов происходит непосредственно после разрыва связей углерод — азот. Таким образом, если в тестируемых и контрольных почвах обнаруживают равные скорости образования нитратов, то весьма вероятно, что основные пути деградации углерода не затрагиваются и остаются функциональными. Субстрат, выбранный для проведения тестирования (порошкообразная люцерновая мука), имеет благоприятное соотношение содержания углерода к азоту (обычно между 12/1 и 16/1). Вследствие этого углеродное голодание в ходе тестирования снижается, и если в результате воздействия химического вещества микробные сообщества повреждаются, то они смогут восстановиться в течение 100 дней.
Настоящий метод, главным образом, предназначен для веществ, для которых известно ожидаемое количество поступления в почву. Это касается, например, средств защиты растений, для которых известны нормы внесения в почву.
Для агрохимикатов достаточно проводить тестирование двух доз, соответствующих ожидаемой или прогнозируемой норме внесения в почву. Тестирование агрохимикатов можно проводить в виде активных ингредиентов (АИ) или в виде готовых смесей.
Тестирование также может проводиться для прочих химических веществ. При изменении количества исследуемого вещества, вносимого в почву, а также способа оценки данных тест может также использоваться для химических веществ, для которых ожидаемое количество поступления в почву неизвестно. Для таких химических веществ определяется воздействие нескольких концентраций на трансформацию азота. Данные тестирования используются для построения кривой доза — отклик (тестируемая концентрация — ингибирование трансформации азота) и расчета значения ECx, где x определяется как процент воздействия.
4. Принцип теста
Просеянную почву, в которую вносится порошкообразный субстрат, обрабатывают исследуемым веществом или оставляют без обработки (контрольная проба). При тестировании агрохимикатов рекомендуется использовать как минимум две тестируемые концентрации, которые должны быть выбраны в зависимости от наиболее высокой ожидаемой дозы внесения в почву. По прошествии 0-го, 7-го, 14-го и 28-го дней инкубации тестируемые и контрольные пробы почвы экстрагируют растворителем и определяют количество нитратов в экстрактах. Скорость образования нитратов в тестируемой пробе сравнивают со скоростью в контрольной пробе и рассчитывают процент отклонения от контрольного значения. Тест выполняется как минимум в течение 28 дней. Если на 28-й день отклонение между тестируемой и контрольной пробой равно или больше 25%, то тест продолжают в течение не более 100 дней. При тестировании прочих химических веществ исследуемое вещество в различных концентрациях добавляют в пробы почвы и по прошествии 28 дней инкубации измеряют количество нитратов, образовавшихся в тестируемой и контрольной пробах. Проводят статистическую обработку результатов тестирования нескольких концентраций с помощью регрессионной модели и вычисляют значения ECx (например EC50, EC25 и (или) EC10).
5. Достоверность теста
Оценка результатов тестирования агрохимикатов основана на относительно небольших отклонениях (среднее значение составляет +/- 25%) в концентрации нитратов в тестируемой и контрольной пробах почвы, поэтому большие различия в концентрации нитратов в параллельных контрольных пробах могут привести к получению ложных результатов. Таким образом, различия в концентрации нитратов в параллельных контрольных пробах должно быть менее +/- 15%.
6. Описание теста
6.1 Оборудование
6.1.1. При тестировании используются контейнеры, изготовленные из химически инертного материала. Контейнеры должны быть подходящего размера для проведения процедуры инкубации почвы. Инкубация может проводиться либо для одной большой партии почвы, либо для серии индивидуальных проб почвы (п. 24). При тестировании следует уделять внимание тому, чтобы минимизировать потери воды и обеспечить газообмен между почвой и атмосферой (например, контейнеры могут быть покрыты перфорированной полиэтиленовой пленкой). При тестировании летучих веществ необходимо использовать герметичные и газонепроницаемые контейнеры. Контейнеры должны быть такого размера, чтобы проба почвы занимала примерно одну четвертую их объема.
6.1.2 При тестировании используют лабораторное оборудование стандартного назначения, в том числе:
- устройство для перемешивания: механический шейкер или аналогичное оборудование;
- центрифугу (3000g или 30000 м/с2) или устройство для фильтрации (с использованием фильтровальной бумаги, не содержащей нитраты);
- оборудование с достаточной чувствительностью и воспроизводимостью для проведения аналитического определения нитратов.
6.2 Выбор и количество почв
6.2.1 При тестировании используется только одна почва. Рекомендации относительно характеристик тестируемой почвы:
- содержание песка: не менее 50% и не более 75%;
- pH: 5,5 — 7,5;
- содержание органического углерода: 0,5 — 1,5%;
- микробная биомасса должна быть измерена и содержание углерода в ней должно быть не менее 1% от содержания общего органического углерода в почве [1, 2].
6.2.2. В большинстве случаев почва, обладающая такими характеристиками, представляет собой наихудший образец для тестирования, поскольку адсорбция исследуемого вещества будет минимальной, а его доступность для микрофлоры — максимальной. Следовательно, тестировать другие почвы, как правило, нет необходимости. Тем не менее, при определенных обстоятельствах, например, когда исследуемое вещество будет, главным образом, использоваться для определенных типов почв, таких как кислые лесные почвы, или при тестировании электрически заряженных химических веществ, необходимо использовать дополнительные пробы почв.
7. Сбор и хранение проб почвы
7.1 Сбор
7.1.1. Должна быть доступна подробная информация о месте сбора пробы почвы. Такая информация включает точное местоположение, сведения о растительном покрове, даты обработки средствами защиты растений, даты внесения органических и неорганических удобрений, даты добавления биологического материала или попадания случайного загрязнения. Для сбора почвы должно быть выбрано одно место, откуда можно отбирать пробы почвы в течение длительного времени. Подходящими местами для сбора почвы являются постоянные пастбища, поля для культивирования годовых зерновых культур (кроме кукурузы) или поля, засеянные сидератом. Выбранное место отбора проб не должно обрабатываться средствами защиты растений как минимум в течение одного года перед планируемым отбором проб. Кроме того, органические удобрения не должны были применяться как минимум в течение шести месяцев. Использование минеральных удобрений является приемлемым только в случае, если соответствует требованиям к выращиванию сельскохозяйственной культуры и если проба почвы будет отбираться как минимум по прошествии трех месяцев после внесения удобрений. Следует избегать использования почвы, обработанной удобрениями с известными биоцидными эффектами (например, цианамидом кальция).
7.1.2. Отбор проб не рекомендуется проводить во время или сразу же после длительного (более 30 дней) периода засухи или подтопления. Для распаханных почв пробы необходимо отбирать из глубины от 0 до 20 см. Для луга (пастбища) или других почв, вспашка которых не производится в течение длительного периода (по крайней мере один вегетационный сезон), максимальная глубина выборки может быть немного больше 20 см (например, до 25 см).
7.1.3. Пробы почвы необходимо перевозить в контейнерах и при температурных условиях, при которых исходные свойства почвы существенно не изменятся.
7.2 Хранение
7.2.1. Наиболее предпочтительным является использование свежеотобранных проб почвы. При необходимости пробы почвы хранят в темноте при температуре 4 +/- 2 °C в течение не более трех месяцев. Во время хранения необходимо обеспечить аэробные условия. Если пробы почвы отбирают из районов, где почва замерзает как минимум на три месяца в год, хранение можно осуществлять в течение шести месяцев при температуре минус 18 °C до минус 22 °C. Микробная биомасса в пробе почвы измеряется перед каждым тестированием, содержание углерода в биомассе должно быть не менее 1% от содержания общего органического углерода (п. 6.3).
7.3 Обработка и подготовка почвы для теста
7.3.1 Предварительная инкубация
Если осуществлялось хранение проб почвы (п. 7.2), то рекомендуется проводить предварительную инкубацию от 2-х до 28-ми дней. Условия предварительной инкубации по температуре и влажности должны быть близки к условиям тестирования (п. 7.3.2 и 25).
7.3.2 Физико-химические характеристики почвы
Пробу почвы вручную очищают от больших объектов (например, камней, частей растений и т.д.), а затем влажную пробу просеивают через сито, не допуская излишнего высушивания, до размера частиц <= 2 мм. Содержание влаги в пробе почвы должно быть скорректировано путем добавления дистиллированной или деминерализованной воды до величин от 40% до 60% от максимально возможного содержания воды.
7.3.3 Добавление органического субстрата
В пробы почвы необходимо добавлять подходящий органический субстрат, например, порошкообразную люцерновую муку (основной компонент — Medicago sativa) с соотношением C/N от 12/1 до 16/1. Рекомендуемое соотношение люцерна — почва составляет 5 г люцерны на килограмм почвы (из расчета на сухой вес).
7.3.4 Подготовка исследуемого вещества для внесения в почву
Как правило, исследуемое вещество вносят в почву с использованием носителя. В качестве носителя может использоваться вода (для растворимых в воде веществ) или твердый инертный носитель, такой как мелкий кварцевый песок (размер частиц от 0,1 — 0,5 мм). Следует избегать использования жидких носителей, за исключением воды (например, органических растворителей, таких как ацетон, хлороформ), поскольку они могут повредить микрофлору. Если в качестве носителя используется песок, то его покрывают исследуемым веществом, растворенным или суспендированным в определенном растворителе. В таких случаях перед смешиванием с почвой растворитель должен быть удален путем испарения. Для достижения оптимального распределения исследуемого вещества в почве рекомендуется использовать соотношение 10 г песка на 1 кг почвы (в расчете на сухой вес). Контрольные пробы обрабатывают только эквивалентным количеством воды и (или) кварцевого песка.
При тестировании летучих химических веществ необходимо предотвращать потери исследуемого вещества вследствие испарения, а также обеспечивать однородное распределение исследуемого вещества в почве (например, исследуемое вещество следует вносить в почву в нескольких местах).
7.3.5 Тестируемые концентрации
При тестировании агрохимикатов необходимо использовать как минимум две тестируемые концентрации. Наименьшая концентрация должна соответствовать максимальному количеству исследуемого вещества, которое может поступить в почву в реальных условиях, наибольшая концентрация должна быть кратна наименьшей концентрации. Концентрацию исследуемого вещества для внесения в почву рассчитывают, предполагая, что исследуемое вещество равномерно распределяется в почве на глубину 5 см и плотность почвы составляет 1,5 г/см3. Для агрохимикатов, которые вносят непосредственно в почву, или для химических веществ, для которых может быть предсказано количество поступления в почву, в качестве тестируемых концентраций рекомендуется использовать максимальную прогнозируемую концентрацию в окружающей среде (PEC) и концентрацию, равную пяти PEC. Для веществ, которые вносят в почву несколько раз в течение одного сезона, наименьшая тестируемая концентрация рассчитывается путем умножения PEC на максимальное ожидаемое число внесений. Наибольшая тестируемая концентрация не должна превышать десятикратную дозу внесения.
При тестировании прочих веществ используется геометрическая прогрессия как минимум из пяти тестируемых концентраций. Тестируемые концентрации должны лежать в диапазоне для определения значения ECx.
8. Отбор образцов почвы для анализа
8.1 График отбора образцов почвы
8.1.1. При тестировании агрохимикатов анализ образцов почвы на содержание нитратов проводят на 0-й, 7-й, 14-й и 28-й дни. При большей продолжительности теста дополнительные измерения проводят после 28-го дня с 14-дневным интервалом.
8.1.2. При тестировании прочих веществ используют как минимум пять тестируемых концентраций и анализ образцов почвы на содержание нитратов проводят в начале (0-й день) и по окончании теста (28-й день). При необходимости можно проводить дополнительное измерение на 7-й день. Данные, полученные на 28-й день, используют для определения значения ECx. Данные о содержании нитратов в контрольных пробах на 0-й день могут использоваться для оценки исходного количества нитратов в почве.
8.2 Анализ образцов почвы
Количество нитратов, образующихся во всех тестируемых и контрольных пробах, определяется для каждого времени отбора образцов. Нитраты извлекают из почвы путем встряхивания образцов с подходящим экстрагентом, например, 0,1 М раствором хлорида калия. Рекомендуется использовать соотношение 5 мл раствора хлорида калия на 1 г сухого веса эквивалентного образца почвы. Для оптимизации экстракции контейнеры, содержащие почву и экстрагент, должны быть заполнены менее чем наполовину. Смесь встряхивают в шейкере в течение 60 минут на скорости 150 об/мин. Смеси центрифугируют или фильтруют, и жидкую фазу анализируют на содержание нитратов. Жидкая фаза может храниться до анализа при температуре минус 20 +/- 5 °C в течение не более шести месяцев.
9. Данные и отчет о проведении теста
9.1 Данные
9.1.1. При тестировании агрохимикатов количество нитратов, образующихся в каждой параллельной пробе почвы, должно быть зарегистрировано, и средние значения для всех параллельных проб должны быть представлены в табличной форме. Скорости трансформации азота должны быть оценены приемлемым статистическим методом (например, с помощью F-теста с 5%-ным уровнем значимости). Количество образующихся нитратов выражается в мг нитратов на кг сухого веса почвы в сутки. Скорость образования нитратов в каждой тестируемой пробе сравнивают со скоростью в контрольной пробе и рассчитывают отклонение от контрольного значения в %.
9.1.2. При тестировании прочих веществ определяют количество нитратов, образующихся в каждой параллельной пробе, и строят кривую доза — отклик (тестируемая концентрация — ингибирование) для оценки значения ECx. Количество нитратов (т.е. мг нитратов на кг сухого веса почвы), определенное в тестируемой пробе по прошествии 28 дней, сравнивается с аналогичным количеством в контрольной пробе. Используя эти данные, рассчитывают ингибирование (%) для каждой тестируемой концентрации. Строят график зависимости ингибирования (%) от концентрации, а затем рассчитывают значения ECx с использованием статистических процедур. Доверительные интервалы (p = 0,95) для расчета ECx также определяются с помощью стандартных процедур.
9.1.3. Исследуемые вещества, содержащие большое количество азота, могут способствовать увеличению количества нитратов, образующихся при тестировании. Если эти вещества тестируют в высокой концентрации (например, химические вещества, которые предполагается вносить в почву повторно), то необходимо проводить дополнительное контрольное тестирование (т.е. почва с добавлением исследуемого вещества, но без добавления питательных веществ). Данные такого тестирования должны учитываться при расчете значений ECx.
9.2 Интерпретация результатов
Если при оценке результатов тестирования агрохимикатов отличие в скорости образования нитратов в пробе с наименьшей концентрацией (т.е. максимальной прогнозируемой концентрацией) и контрольной пробой равно или меньше 25% в любое время отбора образцов по прошествии 28-го дня, то исследуемое вещество может оцениваться как не оказывающее долгосрочного влияния на трансформацию азота в почве. По оценке результатов тестирования прочих веществ рассчитывают значения EC50, EC25 и (или) EC10.
9.3 Отчет о проведении теста
Отчет о проведении теста должен содержать следующую информацию о:
полной идентификации тестируемой почвы:
- географические координаты места отбора пробы почвы (широта, долгота);
- сведения об истории места отбора пробы почвы (т.е. растительный покров, обработка средствами защиты растений, обработка удобрениями, заражение и т.д.);
- тип почвы (например, сельскохозяйственные почвы, леса и т.д.);
- глубина отбора пробы (см);
- содержание песка/ила/глины (в % из расчета на сухой вес);
- pH (в воде);
- содержание органического углерода (в % из расчета на сухой вес);
- содержание азота (в % из расчета на сухой вес);
- начальная концентрация нитратов (мг нитратов/кг сухого веса);
- катионобменная емкость (ммоль/кг);
- микробная биомасса в % от содержания общего органического углерода;
- информация о методах, используемых для определения каждого параметра;
- информация относительно сбора и хранения проб почвы;
- подробная информация о предварительной инкубации проб почвы, если такая инкубация проводилась;
- физическая природа и физико-химические свойства;
- данные о химической идентификации, в том числе структурная формула, чистота (например, для средств защиты растений содержание в % активного ингредиента), содержание азота;
- источник субстрата;
- состав (например, люцерновая мука);
- содержание углерода, азота (в % из расчета на сухой вес);
- размер сита (мм);
- подробные сведения о внесении органического субстрата в почву;
- количество тестируемых концентраций исследуемого вещества и обоснование выбранных концентраций;
- подробные сведения о внесении исследуемого вещества в почву;
- температура инкубации;
- влажность почвы в начале и в ходе теста;
- используемый метод инкубации почвы (т.е. в виде одной общей пробы или в виде серии индивидуальных проб);
- количество параллельных проб;
- время отбора образцов для анализа;
- метод, используемый для экстракции нитратов из почвы.
- аналитические процедуры и оборудование, используемые для аналитического определения нитратов;
- индивидуальные и средние значения содержания нитратов в образцах почвы, представленные в табличной форме;
- различия между параллельными измерениями для тестируемых и контрольных проб;
- обоснования поправок в расчетах;
- отклонения в скорости образования нитратов в % для каждого времени отбора образцов или значение EC50 с 95%-ным доверительным интервалом, прочие ECx (т.е. EC25 или EC10) с указанием доверительных интервалов и график кривой доза — отклик (тестируемая концентрация — ингибирование);
- статистическая обработка результатов;
- вся информация и наблюдения, необходимые для интерпретации результатов.