ГОСТ 32031-2012. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes
(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 № 309-ст)
Внимание
Документ утратил силу с 01.01.2023 в связи с изданием Приказа Росстандарта от 13.10.2022 № 1133-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 32031-2022. Документ утратил силу с 01.01.2023 в связи с изданием Приказа Росстандарта от 13.10.2022 № 1133-ст. Взамен введен в действие ГОСТ 32031-2022. Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.11.2022 № 188). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень стандартов (п.п. 345, 449, 537), содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 81). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 6, 2019. Документ введен в действие с 01.07.2014.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ 7702.2-74"]:::rst n1["ГОСТ Р 50396.5-92"]:::rst n2["ГОСТ 7702.2.5-93"]:::rst click n2 "https://bukva.ai/docs/gost-7702-2-5-93" "ГОСТ 7702.2.5-93. Межгосударственный стандарт. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы выявления и определения количества листерелл (введен в действие Постановлением" n3["ГОСТ Р 51921-2002"]:::rst click n3 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-51921-2002" "ГОСТ Р 51921-2002. Государственный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes (принят и введен в действие Поста" n4["ГОСТ 32031-2012"]:::rst click n4 "https://bukva.ai/docs/gost-32031-2012" "ГОСТ 32031-2012. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes (введен в действие Приказом Росстандарта от 28.06.2013 N 309-ст)" n5["ГОСТ 32031-2022"]:::doc click n5 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-32031-2022" "ГОСТ 32031-2022. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.) (введен в действие Приказом" n4 --> n5 n3 --> n4 n2 --> n3 n0 --> n2 n1 --> n2 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
от 28 июня 2013 г. № 309-ст
МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ LISTERIA MONOCYTOGENES
Food products. Methods for detection of Listeria monocytogenes
(ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004, NEQ)
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Разработан Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности имени В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им В.М. Горбатова Россельхозакадемии).
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 226).
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 3 декабря 2012 г. № 54-П).
4. Настоящий стандарт соответствует международному стандарту ISO 11290-1:1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 1: Detection method (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 1. Метод обнаружения) и изменения к нему ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 1: Detection method — Amendment 1: Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета микроорганизмов Listeria monocytogenes. Часть 1. Метод обнаружения. Изменение 1. Модификация разделительной среды и определение гемолитической активности, а также включение показателей прецизионности).
Степень соответствия — неэквивалентная (NEQ).
Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 51921-2002.
5. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 июня 2013 г. № 309-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32031-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает методы выявления бактерий Listeria monocytogenes.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ ISO 11133-1-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории
ГОСТ ISO 11133-2-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 2. Практические руководящие указания по эксплуатационным испытаниям культуральных сред
ГОСТ ISO 16140-2011 Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Протокол валидации альтернативных методов
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов
ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1. Бактерии рода Listeria: микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и являются грамположительными неспорообразующими короткими палочками, иногда почти коккоподобными, располагающимися одиночно или короткими цепочками, реже образующие длинные нити.
3.2. Listeria monocytogenes: микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на плотных селективных средах и идентифицируемые по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.
Примечание. Описание и методы определения морфологических, культуральных и биохимических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.
3.3. Выявление Listeria monocytogenes: определение наличия или отсутствия Listeria monocytogenes в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.
4. Сокращения
В настоящем стандарте используют следующие сокращения:
ALOA — агар Listeria по Оттавиани и Агости;
ИФА — иммуноферментный анализ;
ПАЛ — питательный агар для выделения листерий;
ПБЛ — питательный бульон для выделения листерий;
ПЦР — полимеразная цепная реакция;
TSYEB — триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом.
5. Сущность метода
Метод выявления бактерий L. monocytogenes в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех последовательных этапов (см. 5.1, 5.2, 5.3, 5.4 и Приложение А).
5.1. Первичное обогащение анализируемой пробы в жидкой среде со сниженной концентрацией селективных компонентов (полуконцентрированный бульон Фразера) при температуре 30 °C в течение 24 ч.
Примечание. Бактерии рода Listeria в продукте могут находиться в небольшом количестве, очень часто на фоне значительного количества микроорганизмов других родов. Поэтому для выявления небольшого количества бактерий рода Listeria, а также «поврежденных» клеток в пробе необходим этап селективного обогащения на среде с пониженной концентрацией селективных компонентов.
5.2. Вторичное обогащение посевного материала, полученного по 5.1, в жидкой среде с полной концентрацией селективных компонентов (бульон Фразера) при температуре (37 +/- 1) °C в течение 48 ч.
5.3. Пересев посевного материала, полученного по 5.1 и 5.2, параллельно на две плотные селективные среды:
а) первая среда (обязательная): ALOA;
б) вторая среда: одна из плотных селективных сред, на выбор лаборатории, дополнительно к агару по 5.3 (а), такие как Оксфорд агар, Палкам агар или ПАЛ.
Посевы на ALOA культивируют при температуре (37 +/- 1) °C и просматривают через (24 +/- 3) ч, а при необходимости еще через (24 +/- 3) ч, контролируя наличие роста характерных для L. monocytogenes колоний.
Посевы на второй селективной среде культивируют при соответствующей температуре и просматривают на наличие роста колоний с характерным для бактерий рода Listeria ростом после определенного времени.
5.4 Идентификация отобранных колоний
Пересев колоний, полученных по 5.3, с характерным ростом для бактерий рода Listeria и вида Listeria monocytogenes на плотные питательные среды и культивирование при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч и их идентификация по соответствующим морфологическим, культуральным и биохимическим признакам.
6. Питательные среды, тест-системы и реактивы
6.1 Общие требования
Состав и приготовление питательных сред и реактивов — в соответствии с Приложением Б.
6.2 Селективные среды первичного обогащения
В качестве селективных сред первичного обогащения могут быть использованы следующие среды.
6.2.1 Бульон Фразера полуконцентрированный — по Б.1.1.
6.2.2 Селективный накопительный бульон UVM — по Б.1.2.
6.2.3. Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I) — по Б.1.3.
6.3 Селективные среды вторичного обогащения
В качестве селективных сред вторичного обогащения могут быть использованы следующие среды.
6.3.1 Бульон Фразера — по Б.2.1.
6.3.2. Селективный накопительный бульон (UVM II) — по Б.2.2.
6.3.3. Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II) — по Б.2.3.
6.4 Селективные плотные среды
6.4.1. Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA) — по Б.3.1.1.
6.4.2. Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar) — по Б.3.1.2.
В качестве второй среды необходимо использовать одну из следующих:
6.4.3 Оксфорд агар — по Б.3.2.1.
6.4.4 Палкам агар — по Б.3.2.2.
6.4.5. Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ) — по Б.3.2.3.
6.5 Питательные среды для изучения культурально-морфологических свойств бактерий рода Listeria
6.5.1 Плотные питательные среды
6.5.1.1. Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) — по Б.4.1.1.
6.5.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA) — по Б.4.1.2.
6.5.1.3 Мясопептонный агар (МПА) — по Б.4.1.3.
6.5.2 Жидкие питательные среды
6.5.2.1. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) — по Б.4.2.1.
6.5.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB) — по Б.4.2.2.
6.5.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ) — по Б.4.2.3.
6.6 Среды и реактивы для идентификации бактерий рода Listeria
6.6.1. Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% — по ГОСТ 10444.1.
6.6.2. Растворы и реактивы для окраски по Граму — по ГОСТ 10444.1.
6.6.3. Коммерческие наборы для окраски по Граму — согласно инструкции изготовителя.
6.6.4. Среда для определения подвижности бактерий — по Б.8.
6.6.5. Среда для определения лецитиназной активности — по Б.10.1 и Б.10.2.
6.7 Среды и реактивы для идентификации бактерий вида Listeria monocytogenes
6.7.1 Среда и реактив для определения \beta - \text{гемолитической} активности
6.7.1.1 Кровяной агар — по Б.5.
6.7.1.2 Суспензия из эритроцитов барана — по Б.6.
6.7.2 Буфер фосфатно-солевой — по Б.11.
6.7.3 Среда для проведения КАМП теста — по Б.9.
6.7.4. Среды для определения ферментативных свойств культуры — по Б.7.1 и Б.7.2.
6.7.5 Углеводы — по Б.7.1.2.
6.7.5.1 Рамноза.
6.7.5.2 Ксилоза.
7. Средства измерений, аппаратура, посуда, материалы и тест-штаммы
Аппаратура и материалы по ГОСТ 10444.1 и ГОСТ ISO 7218 со следующими дополнениями.
pH-метр с точностью измерения +/- 0,1 ед. pH.
Шкаф сушильный стерилизационный для сухой стерилизации или автоклав для влажной стерилизации.
Термостат, поддерживающий температуру между (25 +/- 1) °C и (50 +/- 1) °C.
Термостаты, поддерживающие температуры: (25 +/- 1) °C, (30 +/- 1) °C, (37 +/- 1) °C.
Баня водяная, поддерживающая температуру 44 °C — 47 °C.
Петля, игла из платиново-иридиевого или никель-хромового сплава или пластиковая диаметром около 3 мм.
Шпатели стеклянные формы хоккейной клюшки.
Колбы и флаконы необходимой вместимости.
Дозаторы автоматические переменного объема.
Наконечники одноразовые стерильные для дозаторов.
Чашки Петри стеклянные или пластиковые диаметром от 90 до 100 мм.
Микроскоп для фазово-контрастной микроскопии.
Примечание. Допускается применение средств измерений, аппаратуры с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.
8. Отбор проб
Отбор проб — по ГОСТ 26668.
Проба должна быть представительной, а также без повреждений и изменений при транспортировании и хранении.
9. Подготовка проб
Подготовка проб — по ГОСТ 26670.
10. Проведение испытания
Схема проведения испытания приведена в Приложении А.
10.1. Проба для анализа и исходная суспензия
Анализируемую пробу X (г или см3) вносят в селективную среду первичного обогащения исходя из соотношения продукта и среды 1:9.
10.2. Первичное обогащение
Исходную суспензию (см. 10.1) культивируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.
10.3. Вторичное обогащение
10.3.1. Посевной материал, полученный по 10.2 в объеме 0,1 см3, пересевают в пробирку, содержащую 10 см3 среды обогащения (см. 6.3).
10.3.2. Посевы (см. 10.3.1) культивируют в течение (48 +/- 2) ч при температуре (37 +/- 1) °C.
10.4. Пересев на плотные селективные среды
10.4.1. Из пробирок с посевами (см. 10.2) после культивирования с помощью петли или шпателя (см. 7.5) проводят пересев на поверхность первой плотной селективной среды (см. 6.4.1) так, чтобы получить хорошо изолированные колонии.
Аналогичным образом проводят пересев и на вторую плотную селективную среду (см. 6.4.2 или 6.4.3, или 6.4.4).
10.4.2. С посевным материалом, выращенным на среде обогащения (см. 10.3.2), повторяют процедуру, приведенную в 10.4.1.
10.4.3. Чашки с посевами на первой плотной селективной среде (см. 10.4.1 и 10.4.2) культивируют вверх дном в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 ч.
Чашки с посевами на второй плотной селективной среде инкубируют согласно инструкции производителя питательных сред.
10.4.4. Через (24 +/- 3) ч или (48 +/- 2) ч [если после (24 +/- 3) ч отмечен слабый рост культуры или его отсутствие] культивирования на первой и второй плотной селективной средах (10.4) учитывают наличие колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.
10.4.4.1. На первой селективной плотной среде бактерии вида L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria также растут в виде сине-зеленых колоний, без ореола.
1. Некоторые штаммы L. monocytogenes могут давать очень слабый ореол вокруг колонии или вовсе не иметь его. Это характерно для «поврежденных» клеток L. monocytogenes (например, вследствие воздействия кислот).
2. Некоторые штаммы L. monocytogenes характеризуются пониженной фосфатидилинозитол-фосфолипазной C активностью. Для выявления таких штаммов требуется более продолжительное культивирование.
10.4.4.2. Посевы на второй плотной селективной среде просматривают на наличие колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria.
На Палкам агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром.
На Оксфорд агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие сероватые колонии, окруженные черным ореолом.
На ПАЛ все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом.
10.4.4.3. При отсутствии роста характерных колоний бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes на первой и второй плотных селективных средах исследования прекращают и делают заключение об отсутствии в исследуемой пробе продукта бактерий Listeria monocytogenes.
10.5. Идентификация выделенных культур до рода Listeria
10.5.1 Выбор колоний для подтверждения
10.5.1.1. С каждой чашки с плотной селективной средой (см. 10.4.4.1 и 10.4.4.2) отбирают по пять колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.
Если на чашке выросло менее пяти типичных колоний, отбирают их все.
10.5.1.2. Отобранные колонии пересевают на поверхность подсушенного триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.1.1) или другого плотного питательного агара (см. 6.5.1.2 - 6.5.1.3) так, чтобы получить изолированные колонии.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч до появления видимого роста.
На триптон-соевом агаре с дрожжевым экстрактом бактерии рода Listeria растут в виде выпуклых, бесцветных и непрозрачных колоний в диаметре от 1,0 до 2,0 мм.
Для подтверждения принадлежности выделенной культуры к бактериям рода Listeria проводят следующие тесты.
10.5.2 Реакция на каталазу
Берут изолированную колонию, выделенную по 10.5.1.2, и вносят в каплю 3%-ного раствора перекиси водорода (см. 6.6.1). Мгновенное образование пузырьков газа указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
10.5.3 Окраска по Граму
Культуры, выделенные по 10.5.1.2, окрашивают по Граму (по ГОСТ 30425) и микроскопируют.
Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими, короткими палочками.
10.5.4 Определение подвижности
Культуру, выделенную по 10.5.1.2, пересевают в триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) или в другую жидкую питательную среду (см. 6.5.2.2 - 6.5.2.3).
Посевы культивируют при температуре (25 +/- 1) °C от 8 до 24 ч до появления мутности в бульоне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло и накрывают сверху покровным стеклом и микроскопируют.
В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими движениями.
При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25 +/- 1) °C подвижность бактерий не наблюдается.
В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев культуры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).
Посевы культивируют в термостате при температуре (25 +/- 1) °C в течение 48 ч.
Бактерии рода Listeria подвижны при температуре (25 +/- 1) °C, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый, необходимо культивировать еще пять суток с ежедневным просмотром посевов.
10.5.5 Характеристика бактерий рода Listeria
Бактерии рода Listeria — это грамположительные короткие тонкие палочки, каталазоположительные, подвижные при температуре не выше (25 +/- 1) °C.
10.6 Идентификация бактерий рода Listeria (см. 10.5.5) до вида
Культуры, полученные по 10.5.1.2 и соответствующие 10.5.5, идентифицируют следующими методами.
10.6.1. Определение бета-гемолитической активности
10.6.1.1 С использованием кровяного агара
Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры, отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуемых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положительный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.
Зона \beta - \text{гемолиза} на кровяном агаре у культуры L. monocytogenes — в виде узкой, чистой, светлой зоны; L. innocua — нет зоны гемолиза вокруг укола; L. seeligeri — слабая зона гемолиза; L. ivanovii — широкая, четко обозначенная зона гемолиза.
После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируемых и контрольных культур.
Примечание. Зона \beta - \text{гемолиза} более четко видна при удалении колонии с поверхности агара вокруг места посева.
10.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана
В 0,15 см3 триптон-соевого бульона с дрожжевым экстрактом (см. 6.5.2.1) необходимо внести одну колонию культуры, полученную по 10.5.1.2 и соответствующую 10.5.5.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Затем добавляют 0,15 см3 суспензии эритроцитов барана (см. 6.7.1.2) и продолжают культивирование при температуре (37 +/- 1) °C от 15 до 60 мин, с последующим охлаждением при температуре (3 +/- 2) °C около 2 ч.
При наличии у культуры гемолитической активности жидкость окрашена в соломенно-коричневый цвет, и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.
При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.
Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре (3 +/- 2) °C на 24 ч.
10.6.2. Определение лецитиназной активности
Поверхность лецитин-агара с активированным углем (см. 6.6.5) и без угля (см. 6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериальной петлей колонию культуры, отобранной с триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом (см. 10.5.1.2). На каждую чашку с лецитин-агаром с активированным углем и без угля, кроме исследуемых культур, должен быть посеян контрольный штамм L. monocytogenes (положительный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 2) ч.
Культура L. monocytogenes дает плотную зону помутнения шириной 3,0 — 6,0 мм на лецитин-агаре с активированным углем за счет гидролиза лецитина.
Культура L. monocytogenes не дает плотную зону помутнения на лецитин-агаре без активированного угля.
10.6.3. Определение ферментативных свойств L. monocytogenes
У культур, полученных по 10.5.1.2 и соответствующих требованиям 10.5.5, определяют ферментативные свойства.
Для этого используют суточную культуру.
Посевы следует культивировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение пяти суток.
Положительную реакцию в отношении углеводов определяют по изменению окраски среды в желтый цвет за счет образования кислоты. Изменение цвета среды происходит, как правило, в течение 24 — 48 ч.
В таблице 1 приведены биохимические свойства различных видов бактерий рода Listeria.
Примечание. Для изучения биохимических свойств выделенных по 10.5.1.2 колоний можно использовать следующие коммерческие тест-системы: Listeria ID MID-67, Microbact 12L, api Listeria.
10.6.4. КАМП тест
Допускается для подтверждения гемолитической активности как вспомогательный тест использовать КАМП тест.
Двухсуточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi высевают на кровяной агар, как показано на рисунке 1.
Рисунок 1. Посев и интерпретация КАМП теста
Между вертикальными линиями Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают параллельными линиями исследуемые культуры на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных линий — 0,5 см.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
Для положительного контроля рекомендуется провести посев тест-штамма Listeria monocytogenes 766 аналогично посеву исследуемых культур.
После культивирования посевов отмечают изменение (расширение и просветление) зоны гемолиза в зонах, соседствующих с вертикальными штрихами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.
Listeria monocytogenes дает положительную реакцию (расширение и просветление зоны гемолиза) около штриха Staphylococcus aureus и отрицательную (отсутствие изменений в зоне гемолиза) — около штриха Rhodococcus equi (см. табл. 1).
Культуры микроорганизмов S. aureus, R. equi, L. monocytogenes, L. innocua и L. ivanovii для целевого использования, выращенные на скошенной плотной питательной среде (см. Б.4.1) при температуре (37 +/- 1) °C, необходимо хранить при температуре (3 +/- 2) °C.
10.6.5. Характеристика бактерий Listeria monocytogenes
К бактериям Listeria monocytogenes относятся грамположительные короткие тонкие палочки, каталазоположительные, подвижные при температуре (25 +/- 1) °C и характеризующиеся признаками, описанными в таблице 1.
10.7. Ускоренная идентификация бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes с использованием различных тестов и тест-систем
Допускается проведение ускоренной идентификации выделенных микроорганизмов (см. 10.5.1.2) с использованием валидированных и сертифицированных по ГОСТ ISO 16140 тестов и тест-систем, в том числе следующих.
10.7.1 Идентификация выделенных бактерий до рода Listeria
10.7.2 Идентификация выделенных бактерий до вида Listeria monocytogenes
VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO2).
BAX System PCR assay for L. monocytogenes.
TaqMan Listeria monocytogenes Detection Kit и PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent.
Foodproof Listeria monocytogenes Detection Kit, 5'nuclease.
10.8. Штаммовая идентификация
По эпидемиологическим показаниям штаммы, идентифицированные как L. monocytogenes, направляют в референс лаборатории для серотипирования и/или генотипирования.
11. Обработка результатов испытаний
Обработку результатов проводят в соответствии с ГОСТ ISO 7218 и отмечают наличие или отсутствие бактерий L. monocytogenes в исследованной пробе с указанием массы в граммах или объема в см3.
Примечание. Если были изолированы другие виды бактерий рода Listeria, допускается отмечать эту информацию в протоколе испытания, если это предварительно согласовано между заинтересованными сторонами.
12. Оформление протокола испытания
В протоколе испытания необходимо указать метод испытания и полученные результаты. В нем должны быть также упомянуты все процедуры, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как дополнительные, а также сведения о любых случаях, вероятно повлиявших на результаты.
В протокол испытаний должна быть включена вся информация, необходимая для точной идентификации образца.
13. Требования безопасности
Требования к безопасности при выполнении работ и квалификации оператора — по ГОСТ ISO 7218.
Для защиты здоровья лабораторного персонала настоятельно рекомендуется проводить работу, связанную с выявлением бактерий Listeria monocytogenes, в хорошо оснащенных лабораториях квалифицированным микробиологом и соблюдать особую осторожность при работе с зараженным материалом. В частности, не рекомендуется беременному персоналу работать с бактериями Listeria monocytogenes.
(обязательное)
Примечание. Первичное селективное обогащение необходимо для восстановления поврежденных клеток, а также для ингибирования роста посторонней микрофлоры.
СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ
Б.1. Селективные среды первичного обогащения
Б.1.1. Полуконцентрированный бульон Фразера (Half Fraser broth)
триптон (ферментативный гидролизат казеина) 5,0 г мясной экстракт 5,0 г дрожжевой экстракт 5,0 г хлорид натрия 20,0 г натрий фосфорнокислый двухзамещенный 12,0 г калий фосфорнокислый однозамещенный 1,35 г эскулин 1,0 г дистиллированная вода 1000 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве, необходимом для проведения анализа (см. 10.1), и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Примечание. Раствор хлорида лития и раствор налидиксовой кислоты могут быть добавлены в основу до стерилизации.
Б.1.1.2. Растворы селективных добавок
Б.1.1.2.1. Раствор хлорида лития
хлорид лития 3,0 г дистиллированная вода 10,0 см3
Хлорид лития растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Предупреждение — Необходимо принимать все меры предосторожности при растворении хлорида лития в воде, так как реакция является экзотермической. Раствор хлорида лития раздражает слизистую оболочку.
Б.1.1.2.2. Раствор натриевой соли налидиксовой кислоты
натриевая соль налидиксовой кислоты 0,1 г 0,05 моль/дм3 раствор гидроксида натрия 10,0 см3
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в растворе гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.3. Раствор акрифлавина гидрохлорида
акрифлавин гидрохлорида 0,25 г дистиллированная вода 100 см3
Акрифлавин гидрохлорида растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.4. Раствор цитрата аммонийного железа (III)
цитрат аммонийного железа (III) 5,0 г дистиллированная вода 100 см3
Цитрат аммонийного железа (III) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
основа среды (см. Б.1.1.1) 100 см3
раствор хлорида лития (см. Б.1.1.2.1) 1,0 см3
раствор натриевой соли налидиксовой кислоты (см. Б.1.1.2.2) 0,1 см3
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.1.1.2.3) 0,5 см3
раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.1.1.2.4) 1,0 см3
В основу среды добавляют четыре раствора селективных добавок непосредственно перед использованием.
Б.1.2. Селективный накопительный бульон (UVM)
триптоза 10,0 г мясной экстракт 5,0 г дрожжевой экстракт 5,0 г хлористый натрий 20,0 г фосфорнокислый натрий двузамещенный 12,0 г калий фосфорнокислый однозамещенный 1,35 г эскулин 1,0 г налидиксовая кислота 20,0 мг акрифлавин гидрохлорида 12,0 мг дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в колбы или во флаконы соответствующего объема в количестве 225 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3. Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I)
гидролизат казеина ферментативный 10,0 г пептон мясной ферментативный 15,0 г гидролизат дрожжей автолизованных 2,0 г хлорид натрия 3,5 г хлорид лития 3,0 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают среду в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3.2. Раствор селективной добавки
налидиксовая кислота 10 мг акрифлавин 5 мг полимиксин B сульфат 5 мг стерильная дистиллированная вода 10 см3
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин B сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
основа среды (см. Б.1.3.1) 1000 см3
раствор селективной добавки (см. Б.1.3.2) 4,44 см3
В основу среды добавляют раствор селективной добавки. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.2. Селективные среды вторичного обогащения
Б.2.1. Бульон Фразера (Fraser broth)
мясной пептон (пептический перевар животной ткани) 5,0 г триптон (ферментативный гидролизат казеина) 5,0 г мясной экстракт 5,0 г дрожжевой экстракт 5,0 г хлорид натрия 20,0 г натрий фосфорнокислый двухзамещенный 12,0 г калий фосфорнокислый однозамещенный 1,35 г эскулин 1,0 г хлорид лития 3,0 г натриевая соль налидиксовой кислоты 0,1 г дистиллированная вода 1000 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая ее при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве, необходимом для проведения анализа, и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.2.1.2. Растворы селективных добавок
Б.2.1.2.1. Раствор акрифлавина гидрохлорида
Согласно Б.1.1.2.3.
Б.2.1.2.2. Раствор цитрата аммонийного железа (III)
Согласно Б.1.1.2.4.
В пробирки с 10 см3 основой среды (см. Б.2.1.1) добавляют по 0,1 см3 раствора акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.1.2.1) и раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.2.1.2.2) непосредственно перед использованием.
Б.2.2. Селективный накопительный бульон (UVM II)
Согласно Б.1.2.
Б.2.2.2. Раствор акрифлавина гидрохлорида
акрифлавин гидрохлорида 13 мг стерильная дистиллированная вода 10 см3
Акрифлавин гидрохлорида растворяют в стерильной дистиллированной воде.
основа среды (см. Б.2.2.1) 1000 см3
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2) 4,44 см3
К 1000,0 см3 основы среды (см. Б.2.2.1) добавляют раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2).
Б.2.3. Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II)
Согласно Б.1.3.
Б.2.3.2. Раствор селективной добавки
налидиксовая кислота 10 мг акрифлавин гидрохлорида 5 мг полимиксин B сульфат 5 мг стерильная дистиллированная вода 5 см3
Налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорида и полимиксин B сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
основа среды (см. Б.2.3.1) 1000 см3
раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) 4,44 см3
В основу среды (см. Б.2.3.1) добавляют раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) и разливают в стерильные пробирки по 10 см3. Среду хранят не более 22 сут в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.3. Селективные плотные среды для пересева
Б.3.1. Первая среда
Б.3.1.1. Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA)
ферментативный перевар животного белка 18,0 г панкреатический гидролизат казеина 6,0 г дрожжевой экстракт 10,0 г пируват натрия 2,0 г глюкоза 2,0 г глицерофосфат магния 1,0 г сульфат магния (безводный) 0,5 г хлорид натрия 5,0 г хлорид лития 10,0 г натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный) 2,5 г
5 - \text{бромо} - 4 - \text{хлоро} - 3 - \text{индолил} - \beta - D - \text{глюкопиранозид} 0,05 г
агар 12,0 - 18,0 г дистиллированная вода 930 см3 <*>
<*> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.1.1.2. Растворы селективных добавок
Б.3.1.1.2.1. Раствор налидиксовой кислоты
натриевая соль налидиксовой кислоты 0,02 г 0,05 моль/дм3 раствор гидроксида натрия 5,0 см3
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см3 0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.1.1.2.2. Раствор цефтазидима
цефтазидим 0,02 г дистиллированная вода 5,0 см3
Цефтазидим растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.2.3. Раствор полимиксина B сульфат
полимиксина B сульфат 76700,0 е.а. дистиллированная вода 5,0 см3
Полимиксин B сульфат растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3. Растворы антибиотиков
Б.3.1.1.3.1. Раствор циклогексимида
циклогексимид 0,05 г этанол 2,5 см3 дистиллированная вода 2,5 см3
Циклогексимид растворяют в 2,5 см3 этанола, затем добавляют 2,5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3.2. Раствор амфотерицина B (используется как альтернатива для раствора циклогексимида)
амфотерицин B 0,01 г соляная кислота (HCl) (1 моль/дм3) 2,5 см3 диметилформамид (DMF) 7,5 см3
Амфотерицин растворяют в растворе соляной кислоты (HCl) и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение — Раствор HCl и диметилформамид (DMF) очень токсичен. Обращаться с осторожностью.
Б.3.1.1.4. Дифференциальная добавка
L - \alpha - \text{фосфатидилинозитал} (Sigma P 6636^{®} ) 2,0 г
холодная дистиллированная вода 50 см3
L - \alpha - \text{фосфатидилинозитал} (Sigma P 6636^{®} ) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47 +/- 2) °C.
основа среды (см. Б.3.1.1.1) 930,0 (см3) <*>
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) 5,0 см3
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) 5,0 см3
раствор полимиксина B сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) 5,0 см3
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) 5,0 см3
или амфотерицина B (см. Б.3.1.1.3.2) 10,0 см3
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) 50,0 см3
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды добавляют, тщательно перемешивая после каждого добавления, растворы ингибиторов, антибиотиков и добавок.
pH готовой среды должен составлять (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 — 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.
Б.3.1.2. Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar)
пептон 18,5 г дрожжевой экстракт 4,0 г хлорид натрия 9,5 г пируват натрия 2,0 г хлорид лития 15,0 г мальтоза 4,0 г
5 - \text{бромо} - 4 - \text{хлоро} - 3 - \text{индолил} - \beta - D - \text{глюкопиранозид} 0,2 г
агар 14,0 г дистиллированная вода 930 см3 <*>
<*> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.1.2.2. Растворы селективных добавок
Б.3.1.2.2.1. Раствор налидиксовой кислоты
натриевая соль налидиксовой кислоты 0,02 г 0,05 моль/дм3 раствор гидроксида натрия 5,0 см3
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см3 0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.1.2.2.2. Раствор цефтазидима
цефтазидим 0,02 г дистиллированная вода 5,0 см3
Цефтазидим растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.2.2.3. Раствор полимиксина B сульфат
полимиксина B сульфат 76700,0 е.а. дистиллированная вода 5,0 см3
Полимиксин B сульфат растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.2.3. Растворы антибиотиков
Б.3.1.2.3.1. Раствор циклогексимида
циклогексимид 0,05 г этанол 2,5 см3 дистиллированная вода 2,5 см3
Циклогексимид растворяют в 2,5 см3 этанола, затем добавляют 2,5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.2.3.2. Раствор амфотерицина B (используют как альтернативу для раствора циклогексимида)
амфотерицин B 0,01 г соляная кислота (HCl) 1 моль/дм3 2,5 см3 диметилформамид (DMF) 7,5 см3
Амфотерицин растворяют в растворе HCl и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение — Раствор HCl и диметилформамид (DMF) очень токсичен. Обращаться с осторожностью.
Б.3.1.2.4. Дифференциальная добавка
L - \alpha - \text{фосфатидилинозитал} (Sigma P 6636^{®} ) <*> 2,0 г
холодная дистиллированная вода 50 см3
L - \alpha - \text{фосфатидилинозитал} (Sigma P 6636^{®} ) <*> растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47 +/- 2) °C.
<*> Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
основа среды (см. Б.3.1.2.1) 933,0 (см3) <**>
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.2.2.1) 5,0 см3
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.2.2.2) 5,0 см3
раствор полимиксина B сульфат (см. Б.3.1.2.2.3) 5,0 см3
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.2.3.1) 5,0 см3
или амфотерицина B (см. Б.3.1.2.3.2) 10,0 см3
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.2.4) 50,0 см3
<**> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.1.2.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.2.2.1, Б.3.1.2.2.2, Б.3.1.2.2.3), антибиотика (см. Б.3.1.2.3) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.2.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.
pH готовой среды должен составлять (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 — 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.
Б.3.1.3. Оценка качества первой среды
Определение селективности и продуктивности питательной среды необходимо проводить согласно ГОСТ ISO 11133-2.
В таблице Б.1 приведены тесты для оценки качества первой среды.
Б.3.2. Вторая среда, селективная среда для посева
Б.3.2.1. Оксфорд агар (Oxford agar)
пептон 23,0 г крахмал 1,0 г хлорид натрия 5,0 г эскулин 1,0 г цитрат аммонийного железа (III) 0,5 г хлорид лития 15,0 г агар (в зависимости от плотности среды) 9,0 - 18,0 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 +/- 0,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.1.2. Раствор селективной добавки
циклогексимид 400,0 мг сульфат колистина (полимиксин E) 20,0 мг гидрохлорид акрифлавина 5,0 мг цефотетан 2,0 мг фосфомицин 10,0 мг этанол 5,0 см3 дистиллированная вода 5,0 см3
Компоненты добавки растворяют в смеси этанола и воды. Стерилизуют раствор фильтрованием.
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.2.1.1) добавляют, тщательно перемешивая, раствор селективной добавки (см. Б.3.2.1.2).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 — 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.
Б.3.2.2. Палкам агар (PALCAM agar)
пептон 23,0 г крахмал 1,0 г хлорид натрия 5,0 г дрожжевой экстракт 3,0 г D-глюкоза 0,5 г D-маннитол 10,0 г эскулин 0,8 г цитрат аммонийного железа (III) 0,5 г фенол красный 0,08 г хлорид лития 15,0 г
агар 9,0 — 18,0 г <*>
дистиллированная вода 960,0 см3
<*> В зависимости от плотности среды.
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2). Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.2.2. Раствор сульфата полимиксина B
полимиксина B сульфат (100000 е.а.) 0,1 г дистиллированная вода 100 см3
Растворяют полимиксина B сульфат в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.3. Раствор гидрохлорида акрифлавина
акрифлавина гидрохлорид 0,05 г дистиллированная вода 100 см3
Растворяют гидрохлорид акрифлавина в дистиллированной воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.4. Раствор пентагидрата цефтазидима натрия
пентагидрат цефтазидима натрия 0,116 г дистиллированная вода 100 см3
Растворяют пентагидрат цефтазидим натрия в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
основа агара (В.3.3.1) 960,0 см3
раствор сульфата полимиксина B (В.3.3.2) 10,0 см3
раствор акрифлавина гидрохлорида (В.3.3.3) 10,0 см3
раствор пентагидрата цефтазидима натрия (В.3.3.4) 20,0 см3
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.2.2.1) добавляют, тщательно перемешивая, растворы добавок (см. Б.3.2.2.2 - Б.3.2.2.3).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 — 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133-1.
Б.3.2.3. Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ)
гидролизат казеина панкреатический 10,0 г гидролизат рыбной муки панкреатический 15,0 г гидролизат автолизованных дрожжей 2,0 г хлорид натрия 3,5 г хлорид лития 15,0 г цитрат аммонийного железа 0,5 г эскулин 0,8 г агар 13,0 г дистиллированная вода до 1000,0 см3
Компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают pH (7,0 +/- 0,2) ед. pH и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.3.2.3.2. Раствор селективной добавки
налидиксовая кислота 20 мг акрифлавин гидрохлорида 10 мг полимиксин B сульфат 10 мг стерильная дистиллированная вода 10 см3
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин B сульфат растворяют в стерильном физиологическом растворе.
основа среды (см. Б.3.2.3.1) 1000 см3
раствор селективной добавки (см. Б.3.2.3.2) 4,44 см3
К расплавленной основе среды добавляют с соблюдением правил асептики раствор селективной добавки. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более 22 сут в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4. Питательные среды, используемые для изучения культурально-морфологических свойств
Б.4.1. Плотные питательные среды
Б.4.1.1. Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
триптон или панкреатический гидролизат казеина 17,0 г соевый пептон 3,0 г хлорид натрия 5,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г глюкоза 2,5 г дрожжевой экстракт 6,0 г
агар 9,0 — 18,0 г <*>
дистиллированная вода 1000,0 см3
<*> В зависимости от плотности среды.
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. При необходимости установить pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,3 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду необходимого объема разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Скашивают агар. Для приготовления чашек с агаром готовую среду разливают в стерильные чашки Петри в объеме, необходимом для проведения теста. Дают агару застыть.
Б.4.1.2. Трипказо-соевый агар (TSA)
триптон 15,0 г соевый пептон 5,0 г хлорид натрия 5,0 г агар 5,0 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду разливают в чашки Петри и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.1.3. Мясопептонный агар (МПА)
В соответствии с ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).
Б.4.2. Жидкие питательные среды
Б.4.2.1. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)
триптон или панкреатический гидролизат казеина 17,0 г соевый пептон 3,0 г хлорид натрия 5,0 г калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г глюкоза 2,5 г дрожжевой экстракт 6,0 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.4.2.2. Трипказо-соевый бульон (TSB)
триптон 17,0 г соевый пептон 3,0 г хлорид натрия 5,0 г калия фосфат однозамещенный 2,5 г декстроза 2,5 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.2.3. Мясопептонный бульон (МПБ)
В соответствии с ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).
Б.5. Среда для определения \beta - \text{гемолитической} активности
Б.5.1. Кровяной агар
Б.5.1.1. Основа среды (вариант 1)
мясной пептон 15,0 г печеночный перевар 2,5 г дрожжевой экстракт 5,0 г хлорид натрия 5,0 г
агар 9,0 — 18,0 г <*>
дистиллированная вода 1000,0 см3
<*> В зависимости от плотности среды.
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая на водяной бане. При необходимости установить pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.5.1.2. Основа среды (вариант 2)
Состав и приготовление согласно ГОСТ 10444.1 (пункт 5.12).
Б.5.1.3. Дефибринированная кровь барана
В стерильную колбу со стеклянными бусами вливают 8 см3 только что взятой крови барана и непрерывно встряхивают в течение 10 — 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться и может храниться при температуре (4 +/- 1) °C в течение одной недели.
основа среды (см. Б.5.1 или Б.5.2) 100 см3
дефибринированная кровь барана 5,0 — 7,0 см3
В основу среды (см. Б.5.1 или Б.5.2), охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C, добавляют дефибринированную кровь барана (см. Б.5.1.3). Среда должна иметь pH (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовую среду осторожно перемешивают и разливают в чашки Петри (не более 10 см3 на чашку) и после затвердения агара подсушивают его при температуре (47 +/- 2) °C в течение 30 мин или в ламинарном боксе в течение 1 — 2 ч, или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.
Среду в чашках хранят при температуре (4 +/- 1) °C не более двух суток.
Слой агара в чашке Петри должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Для посева должна использоваться подсушенная среда.
Б.6. Суспензия из эритроцитов барана для определения гемолитической активности
Кровь из яремной вены барана отбирают в стерильную банку с бусами и дефибринируют (см. Б.5.1.3). Эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 1000 — 2000 об/мин в течение 5 — 10 мин соответственно. После последнего центрифугирования надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Красный цвет жидкости (гемолиз) свидетельствует о непригодности эритроцитов к применению. Отмытые эритроциты барана необходимо хранить при температуре (3 +/- 2) °C не более двух суток.
Если гемолиз эритроцитов барана не наблюдается, необходимо внести 2 см3 кровяных телец в 98 см3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11).
Если гемолиз эритроцитов наблюдается, необходимо внести около 4 см3 слоя кровяных телец в 10 см3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и осторожно перемешать, а затем центрифугировать. Если жидкость на поверхности стала четко красного цвета благодаря выраженному гемолизу, не допускается использование такой суспензии эритроцитов, она должна утилизироваться.
Суспензию эритроцитов барана необходимо хранить при температуре (3 +/- 2) °C не более пяти суток.
Б.7. Среды для определения ферментативных свойств
Б.7.1. Бульон с бромкрезоловым пурпурным
протеозный пептон 10,0 г мясной экстракт 1,0 г хлорид натрия 5,0 г бромкрезоловый пурпурный 0,02 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,8 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
углевод <*> 5,0 г
<*> L-рамноза, D-ксилоза и альфа-метил D-маннозид (Methyl \alpha - D - mannopyranoside ).
Каждый из углеводов отдельно растворяют в 100 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования.
основа среды (см. Б.7.1.1) 9,0 см3
углевод (см. Б.7.1.2) 1,0 см3
В асептических условиях в основу среды (см. Б.7.1) перед применением добавляют раствор каждого углевода (см. Б.7.2) в отдельности.
Б.7.2. Среды Гисса
Состав и приготовление — в соответствии с ГОСТ 10444.1.
Углеводы: L-рамноза, D-ксилоза и альфа-метил D-маннозид (Methyl \alpha - D - mannopyranoside ).
Б.8. Агар для определения подвижности культуры микроорганизма
ферментативный гидролизат казеина 20,0 г пептон 6,1 г агар-агар 3,5 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема в количестве 5 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.9. Среды для проведения КАМП (CAMP) теста
Для проведения этого теста могут быть использованы чашки Петри с кровяным агаром (см. Б.5.1.4), но предпочтительнее использовать чашки с двойным слоем: среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) и тонкого слоя кровяного агара (см. Б.5.1.4).
Среду (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) разливают примерно по 10 см3 в стерильные чашки Петри и дают застыть. Затем очень тонким слоем заливают кровяной агар (см. Б.5.1.4), но не более 3 см3 на чашку. Дают агару застыть.
Если кровяной агар (см. Б.5.1.4) вносится в заранее приготовленные чашки со средой (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), то перед тем как внести ее, необходимо прогреть эти чашки в течение 20 мин в термостате при температуре 37 °C.
Б.10. Среда для определения лецитиназной активности
Б.10.1. Лецитин-агар с активированным углем
панкреатический гидролизат рыбной муки 15,0 г панкреатический гидролизат казеина 10,0 г экстракт дрожжевой 2,0 г натрий хлорид 3,5 г глюкоза 1,0 г агар 10,0 +/- 2,0 г дистиллированная вода 1000 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.1.2. Активированный уголь
Активированный уголь растирают до порошкообразного состояния.
Б.10.1.3. Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см3 стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
основа среды (см. Б.10.1) 100 см3
активированный уголь (см. Б.10.2) 0,5 г
желточная эмульсия (см. Б.10.3) 5 см3
Расплавленную основу среды (см. Б.10.1) охлаждают до температуры (47 +/- 2,0) °C, добавляют активированный уголь (см. Б.10.2) и желточную эмульсию (см. Б.10.3), тщательно перемешивают и разливают по (20 +/- 5) см3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (40 +/- 5) мин.
Б.10.2. Лецитин-агар без угля
панкреатический гидролизат рыбной муки 15,0 г панкреатический гидролизат казеина 10,0 г экстракт дрожжевой 2,0 г натрий хлорид 3,5 г глюкоза 1,0 г агар 10,0 +/- 2,0 г дистиллированная вода 1000 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.2.2. Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см3 стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
основа среды (см. Б.10.2.1) 100 см3
желточная эмульсия (см. Б.10.2.2) 5 см3
Расплавленную основу среды (см. Б.10.2.1) охлаждают до температуры (47 +/- 2,0) °C, добавляют желточную эмульсию (см. Б.10.2.2), тщательно перемешивают и разливают по (20 +/- 5) см3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (40 +/- 5) мин.
Б.11. Фосфатно-солевой буфер (PBS)
натрий фосфорнокислый двухзамещенный 8,98 г натрий фосфорнокислый однозамещенный 2,71 г хлорид натрия 8,5 г дистиллированная вода 1000,0 см3
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде. При необходимости установить pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.