ГОСТ 28560-90. Государственный стандарт Союза ССР. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia

(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 24.05.1990 № 1277)

качеством продукции и стандартам от 24 мая 1990 г. № 1277

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДОВ PROTEUS, MORGANELLA, PROVIDENCIA

Food products. Method for detection of bacteria of Proteus, Morganella, Providencia genera

с 1 июля 1991 года

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. Разработан и внесен Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности.

Разработчики: В.И. Рогачев, д-р техн. наук; Б.И. Голод, канд. биол. наук; Р.А. Волкова.

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 24.05.90 № 1277.

3. Срок первой проверки — 1996 г.

Периодичность проверки — 5 лет.

4. Введен впервые.

Обозначение НТД, на который дана ссылка	Номер раздела, пункта
ГОСТ 8284-78	2
ГОСТ 10444.1-84	2, 3.1.11, 3.2.1, 3.2.2
ГОСТ 24104-88 2
ГОСТ 26668-85	1
ГОСТ 26669-85	1, 5.1
ГОСТ 26670-85 3.2.4, 3.2.8
	Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia.
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведений в жидкую селективную среду, культивировании посевов при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч, последующем пересеве выросших культур на плотные дифференциально-диагностические среды, культивировании посевов при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч, выделении характерных колоний и подтверждении с помощью биохимических тестов их принадлежности к бактериям родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или к видам Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.
1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор проб — по ГОСТ 26668, подготовка к испытанию — по ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности +/- 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности +/- 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический по ГОСТ 8284 или импортный с аналогичными техническими характеристиками;

термостат с диапазоном рабочих температур от 28 до 55 °C, позволяющий поддерживать заданную температуру с погрешностью +/- 1 °C;

холодильник бытовой;

стерилизатор горячим воздухом;

адонит;

мальтоза;

метил бутанол (амиловый спирт);

мочевина;

нейтральный красный;

натрия дезоксихолат;

натрия тиосульфат (Na_{2}S_{2}O_{3} \cdot 5H_{2}O) ;

натрий аммония фосфат;

полимиксин В сульфат во флаконах по 25 мг (250000 ЕД) и по 50 мг (500000 ЕД);

L- или DL-фенилаланин;

L- или DL-орнитин;

феноловый красный;

желчь сухая или желчь натуральная крупного рогатого скота;

железа (III) цитрат;

железо хлорное (FeCl_{3} \cdot 6H_{2}O) .

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов

3.1.1. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромтимолового синего 16 г/дм3: 1,6 г бромтимолового синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.1.2. Раствор массовой концентрацией мочевины 500 г/дм3: 50 г мочевины переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде, раствор доливают до метки.

3.1.3. Щелочной раствор фенолового красного массовой концентрацией 16 г/дм3: 1,6 г фенолового красного растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в растворе гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм3. Раствор доливают раствором гидроксида натрия до метки.

3.1.4. Раствор хлорного железа массовой концентрацией 100 г/дм3: 16,6 г (FeCl_{3} \cdot 6H_{2}O) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.5. Раствор гидроксида натрия массовой концентрацией 100 г/дм3: 10 г гидроксида натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.6. Раствор кристаллического фиолетового массовой концентрацией 1 г/дм3: 0,1 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки.

3.1.7. Раствор для среды агара-дезоксихолат-цитрат лактозного: 17,0 г натрия лимоннокислого, 1,0 г натрия тиосульфата, 2,0 г железа (III) цитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки и выдерживают на водяной бане при (60 +/- 1) °C в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

3.1.8. Раствор дезоксихолата натрия массовой концентрацией 100 г/дм3: 10 г дезоксихолата натрия переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60 +/- 1) °C в течение 1 ч. Раствор хранят при комнатной температуре не более 6 мес.

3.1.9. Растворы полимиксин В сульфата или полимиксин М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого во флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см3 стерильной дистиллированной воды.

3.1.10 Реактивы для определения индола:

Реактив Ковача: 5,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 75 см3 метил бутанола и добавляют 25 см3 концентрированной соляной кислоты (\rho = 1,18 - 1,19\text{г}/\text{см}^{3}) .

Реактив Эрлиха: 4,0 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 380 см3 этилового спирта с массовой долей 96% и добавляют 80 см3 концентрированной соляной кислоты (\rho = 1,18 - 1,19\text{г}/\text{см}^{3}) .

Реактивы хранят в сосудах из темного стекла при температуре (4 +/- 2) °C не более 1 мес.

3.1.11 Вазелиновое масло готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.12. Спиртовой раствор массовой концентрацией бромкрезолового пурпурного 10 г/дм3: 1 г бромкрезолового пурпурного переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и растворяют в этиловом спирте с массовой долей 96%. Раствор доливают этиловым спиртом до метки.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1 Агар мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.2 Бульон мясо-пептонный готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.3. Среда жидкая селективная. Основа среды: к 1 дм3 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 добавляют 1,0 г маннита, 50,0 см3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 0,8 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 2,0 см3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2,0 см3 спиртового раствора бромтимолового синего, приготовленного по п. 3.1.1. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 +/- 0,1) при 25 °C. Стерилизуют текучим паром при 100 °C в течение 15 мин.

Для приготовления среды к основе добавляют асептически 10,0 см3 раствора мочевины, приготовленного по п. 3.1.2, и 100000 ЕД полимиксина В сульфата или 120000 ЕД полимиксина М сульфата. Среду разливают в стерильные пробирки по 5 см3. Хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут. Готовая среда прозрачная, желто-бурого цвета.

3.2.4. Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по Leifson модификация Hynes.

Основа среды: в 1 дм3 кипящей мясной воды, приготовленной по ГОСТ 10444.1, растворяют 5,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 22,5 г агара, охлаждают до (45 — 50) °C, устанавливают pH таким образом, чтобы при 25 °C он составлял (7,4 +/- 0,1). Прибавляют 0,03 г нейтрального красного, разливают в мерные колбы, стерилизуют при (115 +/- 1) °C в течение 20 мин. Хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут.

Допускается использовать вместо 1 дм3 мясной воды и 5,0 г пептона 1 дм3 мясо-пептонного бульона, приготовленного по п. 3.2.2.

Для приготовления питательной среды к расплавленной и охлажденной до 45 — 50 °C основе прибавляют из расчета на 100 см3 основы 5 см3 раствора солей, приготовленных по п. 3.1.7, и 5 см3 раствора дезоксихолата натрия, приготовленного по п. 3.1.8. Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри по ГОСТ 26670. Среду используют в день ее приготовления.

3.2.5. Агар тройной сахарный с цитратом железа: в 1 дм3 мясо-пептонного бульона по п. 3.2.2 растворяют при нагревании 15 см3 дрожжевого экстракта, 10,0 г пептона, 10,0 г лактозы, 10,0 г сахарозы, 1,0 г глюкозы, 0,3 г железа (III) цитрата, 0,3 г натрия тиосульфата, 0,024 г фенолового красного, 15,0 г агара. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (7,4 +/- 0,1). Разливают в пробирки и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 мин, дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика составляла 2,5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2.6. Среда для расщепления фенилаланина: 15 см3 дрожжевого экстракта, 2,0 г DL-фенилаланина или 1,0 г L-фенилаланина, 1,0 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 5,0 г натрия хлорида, 12,0 г агара растворяют в 1 дм3 кипящей дистиллированной воды. По 5 см3 среды разливают в пробирки, стерилизуют при (121 +/- 1) °C 10 мин, дают застыть в наклонном положении. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут.

3.2.7. Агар с цитратом: 0,2 г магния сульфата, 1,0 г однозамещенного фосфорнокислого аммония, 1,0 г натрия аммония фосфата, 2,0 г трехосновного натрия лимоннокислого, 5,0 г натрия хлорида, 0,08 г бромтимолового синего, 15,0 г агара растворяют в 1 дм3 кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (7,0 +/- 0,1). Стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 15 мин и дают застыть в пробирках в наклонном положении. Среда имеет зеленую окраску, ее хранят при комнатной температуре не более 7 сут.

3.2.8. Агар дифференциально-диагностический: к 1 дм3 расплавленного мясо-пептонного агара по п. 3.2.1 добавляют 15,0 см3 дрожжевого экстракта, 10,0 г маннита, 10,0 г мальтозы, 80,0 см3 натуральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи, 2,0 г железа (III) цитрата, 0,5 г натрия тиосульфата, 0,5 см3 раствора кристаллического фиолетового, приготовленного по п. 3.1.6, 2,0 см3 щелочного раствора фенолового красного, приготовленного по п. 3.1.3, раствор антибиотика, приготовленного по п. 3.1.9 и содержащего 120000 ЕД полимиксина М сульфата или 100000 ЕД полимиксина В сульфата. Среду стерилизуют текучим паром (при 100 °C) в течение 15 мин и разливают по ГОСТ 26670 после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут. Готовая среда оранжево-красного цвета.

3.2.9. Триптон-триптофановая среда (Ljutov): 10,0 г триптона или пептона, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г DL-триптофана или 0,5 г L-триптофана растворяют в 1 дм3 кипящей дистиллированной воды и фильтруют, устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (7,5 +/- 0,1). Среду разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Среду используют в день приготовления.

3.2.10 Среда для определения декарбоксилазы орнитина:

в 1 дм3 дистиллированной воды растворяют при нагревании 5,0 г L-орнитина или 10,0 г DL-орнитина, 15,0 см3 дрожжевого экстракта, 1,0 г глюкозы, 1,2 см3 раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного по п. 3.1.12. Устанавливают pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял при 25 °C (6,8 +/- 0,1). Среду разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 10 мин. Хранят при (4 +/- 2) °C не более 7 сут. Готовая среда светло-фиолетового цвета.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое минимальное количество продукта, содержащее бактерии родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis.

4.2. Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1,0 см3 в жидкую селективную среду по п. 3.2.3. Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч.

4.3. Положительными считают пробирки, в которых наблюдается помутнение среды. При росте бактерий, расщепляющих мочевину, наблюдается изменение цвета среды в синий. Отсутствие изменения цвета среды не является показателем отсутствия роста выявляемых бактерий.

4.4. Для подтверждения присутствия бактерий родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia или видов Proteus vulgaris или Proteus mirabilis из всех пробирок, в которых наблюдается помутнение среды, делают пересевы на одну из дифференциально-диагностических плотных сред, приготовленных по п. 3.2.4 или по п. 3.2.8, таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний.

Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч.

4.5. На дифференциально-диагностических плотных средах бактерии образуют колонии круглой формы диаметром 1 — 3 мм. Бактерии рода Proteus обладают свойством роения (ползучим ростом).

4.6. Из всех чашек с характерным ростом выбирают не менее 5 колоний для выделения чистых культур и дальнейшего изучения.

Для получения чистых культур используют скошенный в пробирке мясо-пептонный агар по п. 3.2.1 или мясо-пептонный бульон по п. 3.2.2. Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 24 ч.

4.7. Биохимическое подтверждение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям родов Proteus и (или) Morganella, и (или) Providencia.

4.7.1. Для определения наличия дезаминазы фенилаланина из 24-часовой культуры по п. 4.6 делают высев штрихами на поверхность скошенного в пробирке агара, приготовленного по п. 3.2.6, и культивируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч, после этого на поверхность агара пипеткой наносят 3 — 5 капель раствора хлорного железа, приготовленного по п. 3.1.4. При этом появление интенсивной зеленой окраски среды свидетельствует о положительной реакции. При отрицательной реакции цвет среды не меняется.

Бактерии родов Proteus, Morganella, Providencia дают положительную реакцию.

4.7.2. Для определения способности образовывать сероводород культуры по п. 4.6 высевают методом укола в столбик и штрихами по поверхности агаризованной среды, приготовленной по п. 3.2.5.

Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч. При образовании сероводорода столбик среды чернеет. Бактерии рода Proteus образуют сероводород, при этом в столбике среды появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.

Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут, так как P. myxofaciens может образовывать сероводород на 3-и — 4-е сутки. Бактерии рода Morganella и Providencia сероводорода не образуют.

4.7.3. Для определения способности утилизировать цитрат культуры, не образующие сероводород по п. 4.7.2, пересевают на поверхность скошенного агара, приготовленного по п. 3.2.7. Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч. Окрашивание среды в синий цвет — положительная реакция, отсутствие изменения — отрицательная реакция.

Бактерии рода Providencia утилизируют цитрат, бактерии рода Morganella не утилизируют цитрат.

4.8. Для дифференциации видов P. vulgaris и P. mirabilis у культур, образующих сероводород по п. 4.7.2, проводят определение наличия декарбоксилазы орнитина и способности образовывать индол.

4.8.1. Для определения способности образовывать индол выделенные культуры высевают в триптон-триптофановую среду, приготовленную по п. 3.2.9. Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч. После инкубирования добавляют 1 см3 реактива Ковача или Эрлиха, приготовленных по п. 3.1.10. Темно-красное кольцо свидетельствует о положительной реакции.

P. vulgaris образует индол, P. mirabilis и P. myxofaciens индола не образуют.

4.8.2. Для определения наличия декарбоксилазы орнитина выделенные культуры высевают в среду, приготовленную по п. 3.2.10. Посевы инкубируют при (36 +/- 1) °C в течение 48 ч. Положительной реакцией считают помутнение среды и изменение ее цвета в фиолетовый.

P. mirabilis дает положительную реакцию, P. vulgaris, P. myxofaciens — отрицательную.

5. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при изучении культуральных и биохимических свойств обнаружены микроорганизмы, дезаминирующие фенилаланин, то их относят к бактериям родов Proteus, Morganella, Providencia.

5.2.1. Результаты испытания записывают следующим образом: фенилдезаминирующие бактерии родов Proteus, Morganella, Providencia — обнаружены или не обнаружены.

---