Государственная фармакопея Российской Федерации. XII издание. Часть 1

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКСПЕРТИЗЫ СРЕДСТВ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ» РОСЗДРАВНАДЗОРА

XII

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЧАСТЬ 1

I. РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ПО ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТЫ НАД ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕЕЙ

Председатель:

    Юргель                     - руководитель Федеральной службы по надзору
    Николай Викторович           в сфере здравоохранения и социального

                             развития (Росздравнадзора)

Заместители председателя:

    Багирова                   - директор Института стандартизации и
    Валерия Леонидовна           контроля лекарственных средств (ИСКЛС) ФГУ

                             "Научный центр экспертизы средств
                             медицинского применения" Федеральной
                             службы по надзору в сфере здравоохранения
                             и социального развития (ФГУ НЦЭСМП
                             Росздравнадзора)

Младенцев                  - заместитель руководителя Росздравнадзора
Андрей Леонидович

Ответственный секретарь:

    Митькина                   - руководитель аналитической лаборатории
    Лидия Ивановна               научно-методического отдела ИСКЛС ФГУ

                             НЦЭСМП Росздравнадзора

Члены Совета:
Беленков Юрий Никитич      - руководитель Федерального агентства по
                             здравоохранению и социальному развитию
                             (Росздрав)

Володин                    - заместитель руководителя Росздрава
Николай Николаевич

    Гильдеева                  - заместитель директора Департамента
    Гелия Назыфовна              развития медицинской помощи и курортного

                             дела Минздравсоцразвития России

    Ковалева                   - заместитель директора ИСКЛС ФГУ НЦЭСМП
    Елена Леонардовна            Росздравнадзора

    Косенко                    - начальник Управления организации
    Валентина Владимировна       государственного контроля обращения

                             медицинской продукции и средств
                             реабилитации инвалидов Росздравнадзора

    Рейхарт                    - и.о. директора Федерального фонда
    Дмитрий Владимирович         обязательного медицинского страхования

    Сакаев                     - заместитель директора Департамента
    Марат Рустамович             фармацевтической деятельности,

                             региональной и информационной политики по
                             вопросам здравоохранения и социального
                             развития Минздравсоцразвития России

    Сокольская                 - заместитель директора ГУ "ВНИИ
    Татьяна Александровна        лекарственных и ароматических растений"

    Стародубов                 - заместитель Министра здравоохранения и
    Владимир Иванович            социального развития Российской Федерации

    Тельнова                   - заместитель руководителя Росздравнадзора

Елена Алексеевна

    Хабриев                    - заместитель директора Департамента
    Рамил Усманович              социального развития и охраны окружающей

                             среды Правительства Российской Федерации

    Шаназаров                  - руководитель лаборатории экспертизы и
    Карим Сагамбаевич            стандартизации ИСКЛС ФГУ НЦЭСМП

                             Росздравнадзора

II. ПРЕДИСЛОВИЕ

Двенадцатому изданию Государственной фармакопеи Российской Федерации предшествовали следующие издания Фармакопеи на русском языке: первое — 1866 г., второе — 1871 г., третье — 1880 г., четвертое — 1891 г., пятое — 1902 г., шестое — 1910 г., седьмое — 1925 г., восьмое — 1946 г., девятое — 1961 г., десятое — 1968 г., одиннадцатое — 1987 г. (первый выпуск) и 1990 г. (второй выпуск).

После выпуска одиннадцатого издания вводились в действие Общие фармакопейные статьи, Фармакопейные статьи и Изменения, имеющие юридическую силу, равную Государственной фармакопее.

Первая часть Государственной фармакопеи Российской Федерации XII издания подготовлена Институтом стандартизации и контроля лекарственных средств Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора при участии Научно-исследовательского института фармации Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова, фармацевтического факультета Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова, Государственного научного центра «Институт биофизики» и специалистов ведущих научных центров и промышленных предприятий.

Общие фармакопейные и фармакопейные статьи, включенные в настоящее издание, утверждены приказом Минздравсоцразвития России от 15 октября 2007 г. № 641.

III. ОРГАНИЗАЦИИ, УЧРЕЖДЕНИЯ РОССИИ И СПЕЦИАЛИСТЫ, ПРИНЯВШИЕ УЧАСТИЕ В ПОДГОТОВКЕ ЧАСТИ 1 ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ XII ИЗДАНИЯ

1. Институт стандартизации и контроля лекарственных средств Федерального государственного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора):

• Багирова В.Л. — директор, доктор фармацевтических наук, профессор (1-40, ФС);
• Ковалева Е.Л. — заместитель директора, кандидат биологических наук (39, 40, ФС);
• Митькина Л.И. — руководитель аналитической лаборатории научно-методического отдела, доктор фармацевтических наук (1-12.4, 14-24, 35-37).
• Шаназаров К.С. -руководитель лаборатории экспертизы и стандартизации зарубежных лекарственных средств отдела экспертизы и стандартизации лекарственных средств, кандидат химических наук (16, 17, 23, 35-37, 39, 40, ФС);
• Полиевктов М.К. — старший научный сотрудник аналитической лаборатории научно-методического отдела, доктор фармацевтических наук (ФС);
• Нечаева Е.Б. — руководитель лаборатории экспертизы химико-фармацевтических препаратов отдела экспертизы и стандартизации лекарственных средств, кандидат фармацевтических наук (35);
• Милкина С.Е. — старший научный сотрудник лаборатории экспертизы химико-фармацевтических препаратов отдела экспертизы и стандартизации лекарственных средств (35);
• Петрищев Д.С. — научный сотрудник лаборатории хроматографии отдела экспертизы и стандартизации лекарственных средств (35);
• Титова А.В. — ведущий научный сотрудник лаборатории по организации экспертизы лекарственных средств научно-методического отдела, кандидат фармацевтических наук (24, ФС);
• Исаева И.В. — руководитель лаборатории контроля качества органопрепаратов, доктор фармацевтических наук (18);
• Ковалева С.В. — ведущий научный сотрудник лаборатории контроля качества органопрепаратов, кандидат биологических наук (18, 19);
• Антонова Н.П. — ведущий научный сотрудник лаборатории контроля фитопрепаратов отдела контроля качества, кандидат биологических наук (16, 17, 21, 22);
• Суранова А.В. — старший научный сотрудник лаборатории по организации контроля качества лекарственных средств научно-методического отдела, кандидат фармацевтических наук (24.2);
• Краюшкина Т.Я. — научный сотрудник лаборатории по организации контроля качества лекарственных средств научно-методического отдела (24.2);
• Терещенко Е.В. — младший научный сотрудник лаборатории контроля качества химико-фармацевтических препаратов отдела контроля качества лекарственных средств (24.2);
• Неугодова Н.П. — руководитель лаборатории фармакологии отдела биологических методов исследования, кандидат биологических наук (25-30);
• Батуашвили Т.А. — ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии отдела биологических методов исследования (28,29);
• Симутенко Л.В. — старший научный сотрудник лаборатории фармакологии отдела биологических методов исследования (28, 29);
• Сапожникова Г.А. — научный сотрудник лаборатории фармакологии отдела биологических методов исследования (30);
• Быстрова Л.В. -руководитель отдела биологических методов исследования, кандидат биологических наук (33);
• Гунар О.В. — руководитель лаборатории микробиологии отдела биологических методов исследования лекарственных средств, кандидат биологических наук (31, 32, 34);
• Каграманова К.А. — ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии отдела биологических методов исследования лекарственных средств, кандидат биологических наук (31, 32, 34);
• Денисова С.В. — старший научный сотрудник лаборатории микробиологии отдела биологических методов исследования лекарственных средств, кандидат биологических наук (31, 34);
• Колбикова А.С. — научный сотрудник лаборатории микробиологии отдела биологических методов исследования лекарственных средств (31).

2. Научно-исследовательский институт фармации Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова:

• Рудакова И.П. — заведующая лабораторией фармакопеи, доктор химических наук (4-7, 10, 12.5, 14, 16-19, 21, 22, 24, 30, 35);
• Мелентьева Т.А. — главный научный сотрудник лаборатории фармакопеи, доктор химических наук (4-7, 9-11, 21-22, 24);
• Дементьева Н.Н. — и.о. заведующей лабораторией фармацевтической химии, доктор фармацевтических наук, профессор (35);
• Завражная Т.А. — ведущий научный сотрудник лаборатории фармацевтической химии, кандидат фармацевтических наук (8, 20);
• Сегуру Н.В. — старший научный сотрудник лаборатории фармакопеи, кандидат фармацевтических наук (9, 14);
• Ильина И.Г. — старший научный сотрудник лаборатории фармакопеи, кандидат химических наук (11, 14).

3. Фармацевтический факультет Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова:

• Грачев С.В. — проректор по научной работе ММА им. И. М. Сеченова, академик РАМН (13);
• Садчикова Н.П. — профессор кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета, доктор фармацевтических наук (20, 23, 24).

4. Государственный научный центр «Институт биофизики», отдел радиофармацевтических препаратов:

• Кодина Г.Е. — заведующая лабораторией технологии и методов контроля радиофармацевтических препаратов, кандидат химических наук (38).

Специалисты других организаций:

• Краснова М.А. — ведущий научный сотрудник отделения изучения новых противоопухолевых лекарств НИИКО РОНЦ им. Н. Н. Блохина, кандидат фармацевтических наук (35-37);
• Львова М.Ш. — заведующая сектором ФГУП НИИ витаминов, кандидат химических наук (12.1-12.4);
• Шейченко В.И. — ведущий научный сотрудник ГУ «ВНИИ лекарственных и ароматических растений», кандидат физико-математических наук (12.5);
• Березовская И.В. — заведующая отделом лекарственной безопасности ОАО «ВНЦБАВ», доктор медицинских наук, профессор (25);
• Долгова Г.В. — заведующая отделом доклинических исследований и готовых лекарственных препаратов ГНЦА, кандидат биологических наук (25-27);
• Ситников А.Г. — генеральный директор ООО «ЛАЛ-Центр» (27);
• Титова Л.В. — руководитель лаборатории стандартов ИСКЛС ФГУ «НЦЭСМП» Росздравнадзора (ФС);
• Чибиляев Т.Х. — заместитель генерального директора, директор по развитию ОАО «Верофарм», кандидат фармацевтических наук (ФС);
• Зайцев С.А. — ведущий научный сотрудник отдела медицинской химии ГНЦА, кандидат химических наук (ФС);
• Локшин Б.В. — заведующий лабораторией молекулярной спектроскопии ИНЭОС РАН, доктор химических наук, профессор (ФС).

IV. ВВЕДЕНИЕ

Государственная фармакопея (ГФ) является сборником основных стандартов, применяемых в фармакопейном анализе и производстве лекарственных средств. Государственная фармакопея имеет законодательный характер. Основу Государственной фармакопеи составляют общие фармакопейные статьи (ОФС) и фармакопейные статьи (ФС). ОФС описывает принятые в фармакопейном анализе общие положения, методы анализа или включает в себя перечень нормируемых показателей и методов испытаний определенной лекарственной формы. ФС определяет уровень требований к конкретным лекарственным средствам.

Особенностью современного этапа стандартизации лекарственных средств является необходимость гармонизации требований к качеству лекарственных средств и методам их испытаний, предъявляемых фармакопеей России и ведущими зарубежными фармакопеями.

XII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации будет включать пять частей.

В первой части описаны общие положения, методы анализа, требования, предъявляемые к фармацевтическим субстанциям, и фармакопейные статьи на субстанции.

Последующие части будут посвящены:

• продолжению описания физических, физико-химических и химических методов анализа. В эту часть войдут статьи «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний», «Валидация аналитических методик», а также фармако-технологические и другие испытания;
• описанию общих требований к лекарственным формам, перечень которых по сравнению с ГФ XI будет расширен;
• лекарственному растительному сырью и препаратам на его основе: методам анализа и предъявляемым требованиям.

Впервые в Государственную фармакопею предполагается включить стандарты качества на гомеопатические лекарственные препараты, которым будет посвящена одна из частей.

1 часть ГФ XII содержит 45 ОФС и в отличие от ГФ XI издания — 77 фармакопейных статей (ФС) на фармацевтические субстанции, наиболее часто используемые в России, в том числе входящие в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств.

По сравнению с ГФ XI в первую часть включены новые ОФС: «Оборудование», «Осмолярность», «Ионометрия», «Остаточные органические растворители», «Бактериальные эндотоксины», «Определение эффективности антимикробных консервантов лекарственных средств», «Радиофармацевтические препараты», «Фармацевтические субстанции», «Сроки годности лекарственных средств».

Остальные ОФС переработаны и дополнены с учетом современных требований и достижений в области фармацевтического анализа.

В «Правилах пользования фармакопейными статьями» в отличие от ГФ XI приведены рекомендации по описанию веществ, предусматривающие указание структуры (крупнокристаллический, кристаллический, мелкокристаллический или аморфный) и цвета. Определение степени кристалличности порошков соотнесено с определением кристалличности ситовым анализом и размером отверстий применяемых сит. Приведены условия определения цвета порошка, унифицированные с зарубежными фармакопеями термины для используемых в фармакопейном анализе температурных интервалов и расшифровка рекомендуемых температурных условий хранения препаратов, точность измерений и вычисление результатов испытания, даны рекомендации по фильтрованию, использованию стандартных образцов, применяемых в фармакопейном анализе.

Вместо единиц измерений и сокращений, применяемых в Государственной фармакопее XI издания, в настоящем издании приведены единицы международной системы СИ, используемые в фармакопее, и их соответствие другим единицам.

В ОФС «Оборудование», составленную по аналогии с зарубежными фармакопеями, включены рекомендации по применению фильтров различной пористости, диаметр их пор и характеристика сит, применяемых в производстве и контроле лекарственных средств, что необходимо для гармонизации требований по определению измельченности порошков.

В отличие от ГФ XI температура плавления в капиллярном методе означает не интервал между началом и концом плавления, а температуру конца плавления, что согласуется с определением по Европейской фармакопее.

ОФС ГФ XI «Определение температурных пределов перегонки» дополнена определением точки кипения.

Для определения плотности предусмотрен дополнительный метод, основанный на измерении частоты колебаний трубки, заполненной испытуемым образцом.

ОФС «Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах» содержит кроме метода дистилляции метод газовой хроматографии.

ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях», «Спектрометрия в инфракрасной области», «Атомно-эмиссионная и атомно-абсорбционная спектрометрия», «Спектроскопия ядерного магнитного резонанса» и «Флуориметрия» разработаны с учетом современных возможностей спектроскопических методов, а также опыта использования методов, описанных в ГФ XI. По аналогии с зарубежными фармакопеями ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» содержит описание многокомпонентного спектрофотометрического анализа и производной спектрофотометрии.

В ОФС «Ионометрия» описано определение концентрации ионов в растворе с помощью ионоселективных электродов, при этом потенциометрическое определение pH является частным случаем определения концентрации ионов.

Общая фармакопейная статья «Растворимость» дополнена описанием методик определения растворимости веществ с неизвестной и известной растворимостью.

Для определения степени окраски, прозрачности и степени мутности жидкостей предусмотрена возможность использования инструментальных методов. Эталоны цветности унифицированы с эталонами Европейской фармакопеи.

В соответствии с дополнительными данными по токсичности в ОФС «Остаточные органические растворители» откорректированы таблицы классов органических растворителей.

В испытаниях на допустимые пределы примесей тяжелых металлов и железа предусмотрено, наряду с описанными в ГФ XI реактивами, использование других реактивов: тиоацетамидного — при определении тяжелых металлов и тиогликолевой кислоты и аммония роданида — при определении железа.

Включенные в ГФ XII статьи, описывающие биологические методы контроля качества лекарственных средств, соответствуют современному подходу к биологическим испытаниям.

Вместо статьи «Испытание на токсичность» в ГФ XII введена статья «Аномальная токсичность», поскольку данный показатель отражает не собственно токсичность, а токсичность, которая превышает уровень, установленный на стадии доклинических испытаний.

В статье «Пирогенность» указаны лекарственные препараты, для которых контроль по данному показателю является обязательным. Разработан новый уровень требований к проведению испытания и к величине максимального повышения температуры тела у животных.

В статье «Бактериальные эндотоксины» впервые введено правило расчета их предельного содержания, пороговая пирогенная доза и формула для расчета предельного содержания эндотоксинов в препаратах для парентерального введения, вводимых интратекально, и для радиофармацевтических препаратов.

Впервые в государственную фармакопею введена статья «Испытание на гистамин» с использованием изолированного органа. В ней подробно описана подготовка и проведение опыта, а также интерпретация его результатов.

Из статьи «Биологические методы оценки активности лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов, содержащих сердечные гликозиды» исключено испытание на голубях, которое проводят для гликозидов наперстянки пурпуровой, получаемых в настоящее время не из лекарственного растительного сырья, а синтетическим путем.

Впервые введены дифференцированные нормы микробиологической чистоты на готовые лекарственные формы (в том числе лекарственное растительное сырье и препараты из лекарственного растительного сырья), на субстанции и вспомогательные вещества. Дополнен список используемых питательных сред отечественного и зарубежного производства для определения стерильности и микробиологической чистоты. Введены критерии оценки качества микробиологических сред: ростовые и селективные свойства.

В ОФС «Реактивы. Индикаторы» и «Титрованные растворы» приведен значительно расширенный перечень применяемых в фармакопейном анализе реактивов и титрованных растворов.

Вместо статей ГФ XI «Радиоактивность» и «Определение примесей химических элементов в радиофармацевтических препаратах» в ГФ XII включена статья «Радиофармацевтические препараты», описывающая определение радиоактивности и показатели качества радиофармацевтических препаратов и предусматривающая использование широкого спектра современной аппаратуры и приемов измерений.

В ОФС «Фармацевтические субстанции» приведены основные требования, распространяющиеся, прежде всего, на индивидуальные органические вещества, а также на вспомогательные вещества, используемые для приготовления готовых лекарственных форм.

При подготовке ФС на фармацевтические субстанции учитывались не только международные требования, но и опыт, накопленный в процессе регистрации субстанций, используемых отечественными производителями.

Химические названия лекарственных веществ даны в соответствии с требованиями Международного союза теоретической и прикладной химии (IUPAC). Изложение фармакопейных статей гармонизировано с ведущими зарубежными фармакопеями. Основным методом идентификации является метод инфракрасной спектрометрии.

При количественном определении предпочтение отдается классическим титриметрическим методам анализа. Наряду с этим широко используются и современные физико-химические методы — такие, как спектроскопия в ультрафиолетовой области, газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография, предполагающие использование стандартных образцов. В таких случаях указанные методы, а также метод тонкослойной хроматографии, используются и для идентификации субстанций наряду с классическими химическими методами.

Содержание активного вещества приведено в пересчете на сухое (если определяется потеря в массе при высушивании), на безводное (если определяется вода) или на безводное, не содержащее остаточных органических растворителей вещество.

Для ряда субстанций в Приложении приведены рисунки ИК-спектров (не приводятся).

ОФС «Сроки годности лекарственных средств» подготовлена на основе ОСТ 42-2-72 «Средства лекарственные. Порядок установления сроков годности». В ней сохранены основные положения работ по установлению сроков годности лекарственных средств при хранении в обычных условиях, но в отличие от ОСТ согласно сложившейся мировой практике ОФС допускает использование субстанции в течение всего срока годности.

В первой части Государственной фармакопеи содержатся также табличные данные, при этом таблица наименования, символов и относительных масс элементов значительно расширена.

Общие статьи ГФ XI «Метод фазовой растворимости» и «Полярография» исключены как не нашедшие широкого применения.

ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ

1. ПРАВИЛА ПОЛЬЗОВАНИЯ ФАРМАКОПЕЙНЫМИ СТАТЬЯМИ (ОФС 42-0031-07)

Описание. Указывают характеристики физического состояния и цвет лекарственного средства; если необходимо, приводят информацию о запахе и гигроскопичности.

Твердые субстанции могут быть крупнокристаллическими, кристаллическими, мелкокристаллическими или аморфными.

Крупнокристаллический порошок. Не более 40% частиц порошка должно быть размером менее 0,4 мм.

Кристаллический порошок. Не менее 95% частиц порошка должно быть размером менее 0,4 мм и не более 40% — размером менее 0,2 мм.

Мелкокристаллический порошок. Не менее 95% частиц порошка должно быть размером менее 0,2 мм.

Вещество называют аморфным, если при вращении столика микроскопа не наблюдается отражения света.

Характеристики кристалличности и гигроскопичности в описании приводятся для информации и испытанию не подлежат. При необходимости нормирования величины частиц в частной фармакопейной статье приводят специальный раздел.

Цвет следует характеризовать названиями: белый, синий, зеленый, желтый, оранжевый, красный и т.п. При оттеночных цветах на первом месте указывают тот цвет, который содержится в меньшей доле, а затем через дефис — преобладающий цвет (например, красно-коричневый).

Слабоокрашенные образцы имеют оттенок цвета, название которого характеризуют суффиксом «-оват» (например, «желтоватый») или указывают «светло-» (например, «светло-желтый»).

Цвет твердых веществ следует определять на матово-белом фоне (белая плотная или фильтровальная бумага) при рассеянном дневном свете в условиях минимального проявления тени. Небольшое количество вещества помещают на белую бумагу и без нажима равномерно распределяют по поверхности бумаги (осторожно разравнивают шпателем или другим приспособлением) так, чтобы поверхность оставалась плоской.

Запах. Запах следует характеризовать терминами: «без запаха», «с характерным запахом», «со слабым характерным запахом».

Испытание проводят сразу после вскрытия упаковки. 0,5-2,0 г препарата равномерно распределяют на часовом стекле диаметром 6-8 см; через 15 мин. определяют запах на расстоянии 4-6 см или делают вывод о его отсутствии. В случае легко летучих жидкостей наносят 0,5 мл на фильтровальную бумагу и запах определяют сразу же после нанесения, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Масса. «Взвешивание по разности» (например, до и после высушивания/прокаливания при определении потери в массе при высушивании или при определении золы) проводят при одинаковых условиях (температура, давление, влажность), используя одни и те же средства измерения и лабораторную посуду. Интервал времени между двумя взвешиваниями определяется свойствами и количеством высушиваемого/прокаливаемого остатка.

После прокаливания/высушивания тигель или бюкс следует охлаждать в эксикаторе до температуры окружающей среды. Промежутки времени с момента извлечения тигля или стаканчика для взвешивания из эксикатора до момента взвешивания должны быть одинаковыми.

Массу следует считать постоянной, если разность результатов двух последующих взвешиваний не превышает 0,0005 г.

Термин «невесомый» означает, что масса не превышает 0,0005 г. Объем. Для обеспечения требуемой точности измерений стеклянная мерная посуда должна соответствовать требованиям класса А Международного стандарта (ISO). Допускается использование стеклянной мерной посуды по ГОСТам.

Понятие «капля» означает объем от 0,02 до 0,05 мл в зависимости от растворителя; для водных растворов объем капли равен приблизительно 0,05 мл (в 1 мл содержится примерно 20 капель).

Температура. Помимо конкретного указания температуры используют также следующие термины:

Глубокое охлаждение                                  Ниже -15 град. C
В холодильнике                                       От +2 до +8 град. C
В холодном или прохладном месте                      От +8 до +15 град. C
При комнатной температуре                            От +15 до +25 град. C
Теплый                                               От +40 до +50 град. C
Горячий                                              От +80 до +90 град. C
Температура водяной бани                             От +98 до +100 град. C
Температура ледяной бани                             0 град. C

Под «водяной баней» понимают кипящую водяную баню, если в частной фармакопейной статье не указана температура нагревания.

Испытания следует проводить при комнатной температуре, если в частной фармакопейной статье нет других указаний.

Если при проведении испытания, когда имеет значение температура, она не указана, то подразумевают температуру 20 град. C.

Если в тесте «Потеря в массе при высушивании» температурный интервал не указан, то подразумевается, что он равен +/- 2 град. C от указанного значения.

Ниже приводится расшифровка рекомендуемых температурных условий хранения препаратов:

Вакуум. Термин «вакуум» означает, что давление не превышает 20 мм рт. ст. (2,66 кПа), если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Для высушивания в вакууме используют вакуумный сушильный шкаф, вакуумный пистолет или другие подобные приборы.

Точность измерения. При описании количественного определения или испытания с численно заданными пределами количества вещества, необходимое для проведения испытания количество указывают приблизительно; в действительности оно может отклоняться в пределах +/- 10% от указанного. Необходимо взять точную навеску анализируемого вещества (или отмерить его каким-либо другим способом) и все вычисления производить для этого точного количества. Если пределы испытания заданы не численно, а определяются путем сравнения со стандартом при тех же условиях, для испытания берут строго указанное количество вещества. Реактивы всегда берут в строго указанных количествах.

Если значения массы навесок или объемов не используют для дальнейших расчетов, то точность их взятия (отмеривания, отвешивания) должна согласовываться с указанной в частной фармакопейной статье точностью.

Точность измерений следует обозначать числом десятичных знаков после запятой данного числового значения. Точность взвешивания должна быть +/- 5 единиц после последней указанной цифры; например, навеску 0,25 г следует понимать как лежащую в интервале от 0,245 до 0,255 г. Объемы отмеряют следующим образом. Если после запятой стоит 0 или число, заканчивающееся 0 (например, 10,0 мл или 0,50 мл), требуемый объем отмеряют с помощью пипетки, мерной колбы или бюретки. В остальных случаях можно использовать градуированный мерный цилиндр или градуированную пипетку. Микролитры отмеряют с помощью микропипетки или микрошприца.

Точная навеска. «Точная навеска» означает взвешивание на аналитических весах с погрешностью +/- 0,0002 г. Если не указано «точная навеска» и точность взвешивания не задана числом десятичных знаков, то навеску следует брать с погрешностью +/- 0,01 г.

При определении массы в граммах с точностью более четырех десятичных знаков следует пользоваться весами типа ВЛР-20 г или другими весами с аналогичными метрологическими или техническими характеристиками.

Время. Понятие «сразу» означает отрезок времени не более 30 с.

Понятие «свежеприготовленный раствор» означает раствор, приготовленный не более чем за 8 ч до его применения, если в частной фармакопейной статье нет других указаний.

Растворители. Если для растворов не указан растворитель, то подразумевают водные растворы.

Под названием «вода», если нет особых указаний, следует понимать воду, соответствующую требованиям фармакопейной статьи «Вода очищенная». Термин «вода дистиллированная» распространяется на «воду очищенную», полученную путем дистилляции.

Под названием «спирт», если нет особых указаний, следует понимать этиловый спирт, «этанол» — абсолютированный спирт; под названием «эфир» — диэтиловый эфир.

Если для проведения испытания требуется использовать растворитель с растворенным в нем индикатором и контрольный опыт не предусмотрен, то растворитель предварительно нейтрализуют по этому индикатору.

Если указано, что при приготовлении смеси растворителей их берут в соотношении (а:в), то имеется в виду соотношение объемов. Например, соотношение гексан — бензол (1:3) означает, что смешивают 1 объем гексана с 3 объемами бензола.

Реактивы. Для испытаний применяют реактивы квалификации «чистый для анализа». В этом случае квалификация реактива не указывается. При применении реактивов другой квалификации в частной фармакопейной статье следует приводить соответствующее указание.

Индикаторы. При титриметрических определениях раствор индикатора добавляют в количестве 0,2 мл или 3 капель, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Растворы. Под принятым способом обозначения концентрации растворов твердых веществ в различных растворителях 1:10, 1:2 и т.д. следует подразумевать содержание весовой части вещества в указанном объеме раствора, т.е. при приготовлении раствора 1:10 следует брать 1 г вещества и растворителя до получения 10 мл раствора; при приготовлении раствора 1:2 следует брать 1 г вещества и растворителя до получения 2 мл раствора и т.д.

Под обозначением «ч» подразумевают массовые части.

Обозначение «ppm» (частей на миллион) подразумевает массовое соотношение.

Процентная концентрация раствора может иметь одно из трех значений:

• массовый процент — % (м/м) — число граммов вещества в 100 граммах раствора;
• массо-объемный процент — % (м/о) — число граммов вещества в 100 мл раствора;
• объемный процент — % (о/о) — число миллилитров жидкого вещества в 100 мл раствора.

Если «%» используется без обозначения (м/м, м/о или о/о), то подразумевается массовый процент для смесей твердых веществ, массо-объемный процент для растворов или суспензий твердых веществ в жидкостях, объемный процент для растворов жидкостей в жидкостях и массо-объемный процент для растворов газов в жидкостях. Например, 1% раствор приготавливают растворением 1 г твердого вещества или 1 мл жидкости в 100 мл раствора.

Молекулярная масса. Молекулярные массы описанных в фармакопее соединений рассчитаны по таблице относительных атомных масс 1997 г., принятой Международным союзом по теоретической и прикладной химии (IUPAC) и основанной на шкале углерода-12.

Если молекулярная масса вещества меньше 400, приводят два десятичных знака, если больше 400 — один десятичный знак.

Пределы количественного содержания. Указываемые пределы основываются на результатах, полученных в рамках обычной аналитической практики; в них уже учтены обычные аналитические погрешности, допустимый разброс при производстве и приготовлении, а также ухудшение качества в процессе хранения в пределах, которые считаются приемлемыми. При определении соответствия препарата требованиям фармакопейной статьи к указанным пределам не должны добавляться никакие дополнительные допуски.

Если в разделе «Количественное определение» для индивидуальных веществ не указан верхний предел содержания, следует считать, что последний составляет не более 100,5% определяемого вещества.

В тех случаях, когда содержание вещества в препарате выражается в пересчете на сухое или безводное вещество, следует понимать, что потеря в массе при высушивании или содержание воды определены тем методом, который описан в соответствующей частной фармакопейной статье.

При определении действующих веществ в лекарственном растительном сырье расчет производят на абсолютно сухое сырье.

Контрольный опыт. Под контрольным опытом подразумевают определение, проводимое с теми же количествами реактивов и в тех же условиях, но без испытуемого препарата.

Методы испытаний. Как правило, в Общей фармакопейной статье (ОФС) на методы контроля описано несколько методов анализа. Если в частной фармакопейной статье не указано, какой из методов используется, то применяют первый метод, описанный в ОФС.

Защищенное от света место. Если указано, что испытание проводят «в защищенном от света месте», то это означает, что следует принять меры для избежания попадания прямого солнечного света, любого другого яркого света, а также ультрафиолетовых лучей, например, путем использования посуды из специального стекла, работы в затемненной комнате и т.д.

Сухое место. Термин «сухое место» подразумевает место с относительной влажностью не более 40% при комнатной температуре или эквивалентном давлении паров при другой температуре.

Фильтрование. Если для определения содержания примеси используют фильтрат, то перед фильтрованием фильтр промывают соответствующим растворителем до тех пор, пока не будет установлено, что определяемая примесь не обнаруживается. При промывании подкисленной водой следует для подкисления применять ту кислоту, которая применяется для определения. Если часть фильтрата применяют для дальнейших определений, то для фильтрования применяют сухой фильтр и первую порцию фильтрата отбрасывают.

Если не указана марка фильтра, то подразумевают любой бумажный фильтр.

Вычисление результатов испытания. При всех количественных определениях результат вычисляют с точностью на два десятичных знака большей, чем число десятичных знаков, указанное в частной фармакопейной статье, если это допустимо с точки зрения точности метода. Затем цифры округляют до указанного в пределе количества значащих цифр (если нет других указаний). При этом последнюю цифру увеличивают на единицу, если цифра, отбрасываемая при округлении, больше или равна пяти. Если цифра, отбрасываемая при округлении, меньше пяти, последнюю цифру оставляют неизменной.

Стандартные образцы. Современные методы анализа предусматривают использование стандартных образцов. В качестве стандартных образцов в нормативном документе должны быть предусмотрены Фармакопейные стандартные образцы, введенные в действие уполномоченным фармакопейным органом (EP CRS, BP CRS, USP RS, государственные стандартные образцы ГСО и др.).

В ряде случаев для проведения текущих анализов могут использоваться стандартные образцы серийных субстанций при условии, что они удовлетворяют требованиям нормативной документации и откалиброваны по Фармакопейным стандартным образцам.

2. ЕДИНИЦЫ МЕЖДУНАРОДНОЙ СИСТЕМЫ (СИ), ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ФАРМАКОПЕЕ, И ИХ СООТВЕТСТВИЕ ДРУГИМ ЕДИНИЦАМ (ОФС 42-0032-07)

МЕЖДУНАРОДНАЯ СИСТЕМА ЕДИНИЦ (СИ)

Международная система единиц в настоящее время включает в себя два класса единиц физических величин: основные единицы и производные единицы <*>. Класс основных единиц состоит из семи независимых единиц, определения которых приведены в табл. 2.1.

Производными единицами системы называются единицы физических величин, которые могут быть получены через основные единицы посредством алгебраических отношений. Единицы таких величин, используемых фармакопеей, приведены в табл. 2.2.

Таблица 2.1

Основные единицы СИ

<*> Используемые определения единиц Международной системы (СИ) приняты Международным комитетом мер и весов.

20-й Конференцией (1995 г.) Международного комитета мер и весов существующий ранее отдельный класс вспомогательных единиц, содержащий две единицы: угол на плоскости и пространственный угол, — включен в класс производных единиц.

<**> Если использованы моли, то следует указывать, к чему они относятся, например, атомы, молекулы, ионы, электроны, иные частицы или определенные группы таких объектов.

В табл. 2.3 приведены единицы, не входящие в систему СИ, но используемые наряду с Международной системой единиц.

Множительные приставки для образования десятичных дольных и кратных единиц приведены в табл. 2.4.

Таблица 2.2

Единицы СИ и их соответствие другим единицам

Таблица 2.3

системой единиц

Таблица 2.4

кратных и дольных единиц

Примечания

1.  Радиан  представляет  собой  плоский угол, вырезающий на окружности

дугу, равную по длине радиусу.

2.  В  фармакопее  условия  центрифугирования определяются центробежным

ускорением по отношению к ускорению свободного падения (g), которое -2 принимается равным g = 9,80665 м x с .

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

3. ОБОРУДОВАНИЕ (ОФС 42-0033-07)

В настоящей статье описана характеристика оборудования, применяемого в фармакопейном анализе, не описанная в других общих фармакопейных статьях.

ФИЛЬТРЫ

В зависимости от диаметра пор фильтры используются для следующих целей (табл. 3.1):

Таблица 3.1

диаметра пор

В табл. 3.2 приведен максимальный диаметр пор стеклянных фильтров различной пористости.

Таблица 3.2

различной пористости

СИТА

Материал сита должен быть индифферентным по отношению к просеиваемому веществу.

Для аналитических процедур используют сита с квадратными отверстиями. Для неаналитических процедур могут быть использованы также сита с круглыми отверстиями, диаметр которых в 1,25 раза превышает размер стороны квадратного отверстия сита соответствующего номера. Измельченность указывают в частной фармакопейной статье, используя номер сита, соответствующий номинальному размеру стороны отверстия в микрометрах, который приводится в скобках после названия вещества.

Максимальный допуск для размера отверстия (+ X) вычисляют по формуле:

                           0,75

                     2 x (омега     )             0,25
                 X = ---------------- + 4 x (омега    ),

                     3

где омега — номинальный размер отверстия.

При этом не должно быть отверстий, размер которых превышает номинальный размер более, чем на величину X.

Допуск для среднего значения размера отверстия (+/- Y) вычисляют по формуле:

                             0,98
                        омега
                   Y = ----------- + 1,6.
                          27

При этом средний размер отверстия не должен отклоняться от номинального размера более чем на величину +/- Y.

Промежуточный допуск (+ Z) вычисляют по формуле:

                          X + Y
                     Z = -------.
                            2

При этом не более чем 6% общего числа отверстий могут иметь размеры между «номинальный +Х» и «номинальный + Z». Диаметр d проволоки, применяемой для плетения металлической проволочной

ткани,  вставленной  в  раму, должен находиться в пределах от d    до d   ,
                                                               min     max
что  соответствует  допускам  (+/- 15%)  от  рекомендованного  номинального

диаметра. Диаметр проволоки в ситах должен быть одинаковым по всему ситу.

Номер сита (номинальный размер отверстий в мкм), допуски для отверстий, диаметр проволоки и допустимые пределы от ее номинального диаметра представлены в табл. 3.3.

Таблица 3.3

контроле лекарственных средств

ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

4. ТЕМПЕРАТУРА ПЛАВЛЕНИЯ (ОФС 42-0034-07)

Температурой плавления называют температуру, при которой происходит переход вещества из твердого состояния в жидкое.

Для определения температуры плавления в зависимости от физических свойств вещества применяют капиллярный метод, открытый капиллярный метод, метод мгновенного плавления и метод каплепадения. Для твердых веществ, легко превращаемых в порошок, применяют методы 1 и 3. Для аморфных веществ, не растирающихся в порошок и плавящихся ниже температуры кипения воды (таких как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы) — методы 2 и 4.

Для веществ, неустойчивых при нагревании, определяют температуру разложения. Температурой разложения называют температуру, при которой происходит резкое изменение физического состояния вещества (вспенивание) при нагревании.

Для определения температуры плавления используют описанные ниже приборы. Для калибровки приборов используют подходящие для этих целей стандартные вещества, имеющие температуру плавления, близкую к температуре плавления испытуемого вещества.

1. Капиллярный метод

Температура плавления, определенная капиллярным методом, представляет собой температуру, при которой последняя твердая частичка уплотненного столбика вещества в капиллярной трубке переходит в жидкую фазу.

Прибор 1. Составными частями прибора являются:

• стеклянный сосуд, содержащий жидкость (например, воду, вазелиновое или силиконовое масло), используемый в качестве бани и оснащенный подходящим устройством для нагрева. Жидкость в бане следует выбирать в зависимости от требуемой температуры;
• устройство для перемешивания, обеспечивающее однородность температуры внутри бани;
• подходящий термометр с ценой деления не более 0,5 град. C. Разность между верхним и нижним делениями термометра в области измеряемой температуры — не более 100 град. C;
• запаянные с одного конца капиллярные трубки из нейтрального прочного стекла диаметром от 0,9 до 1,1 мм и толщиной стенок от 0,10 до 0,15 мм.

Прибор 2. Составными частями прибора являются:

• круглодонная колба из термостойкого стекла вместимостью от 100 до 150 мл; длина горла колбы 20 см; диаметр горла — от 3 до 4 см;
• пробирка из термостойкого стекла, вставленная в колбу и отстоящая от дна колбы на расстоянии 1 см; диаметр пробирки — от 2 до 2,5 см;
• термометр ртутный стеклянный укороченный с ценой деления 0,5 град. C, вставленный во внутреннюю пробирку так, чтобы конец его отстоял от дна пробирки на 1 см;
• источник нагрева (газовая горелка, электрический обогрев);
• капиллярные трубки.

Колбу наполняют на 3/4 объема соответствующей жидкостью: вазелиновое масло или жидкие силиконы; серная кислота концентрированная для веществ с температурой плавления от 80 до 260 град. C; раствор калия сульфата в серной кислоте концентрированной 3:7 (по массе) — для веществ с температурой плавления выше 260 град. C; дистиллированная вода — для веществ с температурой плавления ниже 80 град. C.

Примечания

1. Стеклянные трубки, из которых вытягивают капилляры, должны быть вымыты и высушены.

2. При приготовлении раствора калия сульфата в серной кислоте концентрированной смесь кипятят в течение 5 мин. при энергичном перемешивании. При недостаточном перемешивании могут образоваться два слоя, в результате чего может произойти закипание смеси, приводящее к взрыву.

Прибор 3. Прибор для определения температуры плавления с диапазоном измерений в пределах от 20 до 360 град. C с электрическим обогревом (ПТП).

Составными частями прибора являются:

• основание с щитком управления и номограммой;
• стеклянный блок-нагреватель, обогрев которого осуществляется константановой проволокой, навитой бифилярно;
• оптическое приспособление;
• приспособление для установки термометра;
• приспособление для установки капилляров;
• термометр укороченный с ценой деления 0,5 град. C;
• источник нагрева (электрический обогрев);
• капиллярные трубки длиной 20 см.

Допускается применение других приборов, использующих капиллярный метод, если точность и правильность измерений будут не хуже, чем в случае применения приборов, описанных выше.

Методика. Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, тонкоизмельченное в порошок вещество сушат при температуре от 100 до 105 град. C в течение 2 ч, или в эксикаторе над серной кислотой в течение 24 ч, или в вакууме над безводным силикагелем в течение 24 ч.

Достаточное количество вещества помещают в капиллярную трубку до получения уплотненного столбика высотой от 4 до 6 мм. Необходимое уплотнение вещества при заполнении капиллярной трубки можно получить, если ее несколько раз бросить запаянным концом вниз в стеклянную трубку длиной не менее 1 м, поставленную вертикально на твердую поверхность. Капиллярную трубку с веществом сохраняют до начала определения в эксикаторе.

Повышают температуру в бане (приборе) приблизительно на 10 град. C ниже предполагаемой температуры плавления и затем продолжают нагревание со скоростью около 1 град. C в мин. Когда температура достигнет значения на 5-10 град. C ниже предполагаемой температуры плавления, помещают капиллярную трубку в прибор так, чтобы ее запаянный конец находился на уровне центра шарика термометра.

Продолжают нагревание со скоростью:

• для устойчивых при нагревании веществ при определении температуры плавления ниже 100 град. C — со скоростью от 0,5 до 1 град. C в 1 мин.;
• при определении температуры плавления от 100 до 150 град. C — от 1 до 1,5 град. C в 1 мин.;
• при определении температуры плавления выше 150 град. C — от 1,5 до 2 град. C в 1 мин.;
• для неустойчивых при нагревании веществ — от 2,5 до 3,5 град. C в 1 мин.

Отмечают температуру, при которой последняя твердая частичка перейдет в жидкую фазу.

Проводят не менее двух определений. За температуру плавления принимают среднее значение. Расхождение между определениями не должно превышать 1 град. C.

Примечание. Во время определения температуры плавления колба и пробирка должны быть открыты.

2. Открытый капиллярный метод

Используют стеклянную капиллярную трубку, открытую с обоих концов, длиной около 80 мм, наружным диаметром от 1,4 до 1,5 мм и внутренним диаметром от 1,0 до 1,2 мм.

Вещество, предварительно обработанное, как указано в частной фармакопейной статье, помещают и каждую из пяти капиллярных трубок в количестве, достаточном для формирования в каждой трубке столбика высотой около 10 мм. Трубки оставляют на определенное время при температуре, указанной в частной фармакопейной статье.

Прикрепляют одну из капиллярных трубок к термометру с ценой деления 0,2 град. C таким образом, чтобы вещество находилось в непосредственной близости к шарику термометра.

Термометр с прикрепленной капиллярной трубкой помещают в стакан так, чтобы расстояние между дном стакана и нижней частью шарика термометра составляло 1 см. Стакан наполняют водой до высоты слоя 5 см.

Повышают температуру воды со скоростью 1 град. C в мин.

За температуру плавления принимают температуру, при которой вещество начинает подниматься по капиллярной трубке. В тех случаях, когда столбик вещества не поднимается в капилляре, за температуру плавления принимают температуру, при которой столбик вещества в капилляре становится прозрачным.

Повторяют эту операцию с четырьмя другими капиллярными трубками и рассчитывают результат как среднее из пяти показаний.

3. Метод мгновенного плавления

Прибор. Прибор состоит из металлического блока, изготовленного из материала, обладающего высокой теплопроводностью и не взаимодействующего с испытуемым веществом, например, из латуни. Верхняя поверхность блока должна быть плоской и тщательно отполированной. Блок равномерно нагревают по всей массе газовой горелкой с микрорегулировкой или электрическим нагревателем с тонкой регулировкой. Блок имеет достаточно широкую цилиндрическую полость для размещения термометра, столбик ртути которого должен находиться в одном и том же положении, как при калибровке, так и при определении температуры плавления испытуемого вещества. Цилиндрическая полость размещена параллельно отполированной верхней поверхности блока на расстоянии около 3 мм от нее.

Методика. Блок быстро нагревают до температуры на 10 град. C ниже предполагаемой температуры плавления и затем устанавливают скорость нагрева около 1 град. C в мин. Несколько частичек тонкоизмельченного в порошок вещества, высушенного в вакууме над безводным силикагелем в течение 24 ч, бросают через равные промежутки времени на поверхность блока в непосредственной близости от шарика термометра, очищая поверхность после каждого испытания. Записывают температуру t1, при которой вещество плавится мгновенно при соприкосновении с металлом. Останавливают нагрев. Во время охлаждения через равные промежутки времени бросают несколько частичек вещества на поверхность блока очищая ее после каждого испытания. Записывают температуру t2 , при которой вещество прекращает мгновенно плавиться при соприкосновении с металлом. Температуру плавления (Т ) рассчитывают по формуле: пл.

                                      t1  + t2
                              T    = -----------,
                               пл.          2

где:

t1 — первое значение температуры;

t2 — второе значение температуры.

4. Метод каплепадения

В данном методе определяют температуру, при которой в условиях, приведенных ниже, первая капля расплавленного испытуемого вещества падает из чашечки.

Прибор. Прибор состоит из двух металлических гильз (А и Б), соединенных посредством резьбы. Гильза (А) прикреплена к ртутному термометру. В нижней части гильзы (Б) с помощью двух уплотнителей (Г) свободно закреплена металлическая чашечка (Д). Точное положение чашечки определяется фиксаторами (Е) длиной 2 мм, которые используются также для центровки термометра. Отверстие (В) в стенке гильзы (Б) предназначено для выравнивания давления. Отводящая поверхность чашечки должна быть плоской, а края выходного отверстия — под прямым углом к поверхности. Нижняя часть ртутного термометра имеет форму и размер, как показано на рис. 4.1 (не приводится); термометр градуирован от 0 до 110 град. C и расстояние на шкале в 1 мм соответствует разности температур в 1 град. C. Ртутный шарик термометра имеет диаметр (3,5 +/- 0,2) мм и высоту (6,0 +/- 0,3) мм.

Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около 200 мм и наружным диаметром около 40 мм.

каплепадения

Рисунок не приводится.

Прибор прикрепляют к пробирке с помощью пробки, в которую вставлен термометр и которая имеет боковую прорезь. Отверстие чашечки должно находиться на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все устройство погружают в стакан вместимостью около 1 л, заполненный водой. Дно пробирки должно находиться на расстоянии около 25 мм от дна стакана. Уровень воды должен достигать верхней части гильзы (А). Для равномерного распределения температуры в стакане используют мешалку.

Методика. Заполняют чашечку до краев нерасплавленным испытуемым веществом, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Избыток вещества удаляют с обеих сторон шпателем. После соединения гильз (А) и (Б) проталкивают чашечку внутрь на ее место в гильзе (Б) до упора. Удаляют шпателем вещество, выдавленное термометром. Прибор помещают в водяную баню, как описано выше. Водяную баню нагревают до температуры примерно на 10 град. C ниже предполагаемой температуры плавления и устанавливают скорость нагрева около 1 град. C в минуту. Отмечают температуру падения первой капли. Проводят не менее трех определений, каждый раз с новым образцом вещества. Разность между показаниями не должна превышать 3 град. C. Рассчитывают среднее из полученных значений.

5. ТЕМПЕРАТУРА ЗАТВЕРДЕВАНИЯ (ОФС 42-0035-07)

Температурой затвердевания называют температуру, при которой вещество переходит из жидкого состояния в твердое при охлаждении.

Прибор 1. Прибор (рис. 5.1 — не приводится) состоит из внутренней толстостенной пробирки с внутренним диаметром около 25 мм и длиной около 150 мм, помещенной внутри другой пробирки диаметром около 40 мм и длиной около 160 мм. Внутренняя пробирка закрыта пробкой, снабженной термометром длиной около 175 мм с ценой деления 0,2 град. C, который закреплен таким образом, чтобы ртутный шарик находился на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. В пробирке имеется отверстие, через которое проходит вал мешалки, изготовленный из стеклянного стержня или другого подходящего материала, согнутый на конце под прямым углом в виде петли, внешний диаметр которой около 18 мм. Внутреннюю пробирку вместе с внешней пробиркой располагают в центре стакана вместимостью 1 л, содержащего подходящую охлаждающую жидкость, уровень которой находится на расстоянии около 20 мм от верхнего края стакана. Охлаждающая баня также должна быть снабжена термометром.

Прибор 2 (прибор Жукова) — дьюаровский сосуд из прозрачного стекла (рис. 5.2 — не приводится), снабженный пробкой, в которой укреплен укороченный термометр с диапазоном температур от +30 до +100 град. C и ценой деления 0,2 град. C, помещенный в водяную баню.

затвердевания

Рисунок не приводится.

Рис. 5.2. Прибор Жукова

Рисунок не приводится.

Методика 1. Во внутреннюю пробирку помещают достаточное количество (около 10 г) испытуемого вещества, находящегося в жидком состоянии (твердое вещество предварительно расплавляют при температуре не выше 20 град. C ожидаемой температуры затвердевания), чтобы ртутный шарик находился посередине слоя испытуемого вещества, и при быстром охлаждении определяют приблизительную температуру затвердевания. Внутреннюю пробирку помещают в водяную баню с температурой на 5 град. C выше определенной приблизительно температуры затвердевания до полного расплавления кристаллов. Затем заполняют стакан водой или насыщенным раствором натрия хлорида с температурой на 5 град. C ниже ожидаемой температуры затвердевания. Внутреннюю пробирку вместе с внешней помещают в стакан. При постоянном перемешивании испытуемого вещества отмечают температуру каждые 30 с. Вначале происходит постепенное понижение температуры, затем при появлении твердой фазы она остается некоторое время постоянной или повышается перед тем, как стать постоянной (в этот момент прекращают перемешивание), а затем снова падает. Отмечают наиболее высокую температуру, остающуюся короткое время постоянной при переходе вещества из жидкого состояния в твердое. Эту температуру и принимают за температуру затвердевания.

Если вещество остается жидким при ожидаемой температуре затвердевания, его охлаждают на 1-2 град. C ниже ожидаемой температуры затвердевания и вызывают затвердевание введением малых количеств (нескольких кристаллов) испытуемого вещества или потиранием стенок внутренней пробирки термометром.

Методика 2. Для твердых веществ, имеющих высокую температуру затвердевания с диапазоном от +30 до +100 град. C (парафины и высокоплавкие кристаллические вещества).

Испытуемое вещество, расплавленное на водяной бане или в термостате при температуре на 15-20 град. C выше ожидаемой температуры затвердевания, тщательно перемешивают и заливают в подогретый прибор на 3/4 его высоты. Температура испытуемого вещества после залива в прибор должна превышать ожидаемую температуру затвердевания не менее, чем на 8 град. C. В отверстие прибора вставляют термометр на пробке по оси прибора так, чтобы ртутный шарик термометра находился приблизительно на половине высоты слоя расплавленного вещества. Оставляют прибор до достижения температуры на 3-4 град. C выше температуры затвердевания. По достижении этой температуры записывают температуру через каждую минуту. Сначала температура понижается быстро, затем понижение замедляется и в течение нескольких минут сохраняется постоянной или снижается очень медленно, после чего происходит снова быстрое понижение температуры. За температуру затвердевания вещества принимают то показание термометра, при котором температура оставалась постоянной или снижалась наиболее медленно.

Рассчитывают среднее арифметическое трех определений. Расхождение между определениями не должно превышать 0,2 град. C.

6. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПРЕДЕЛЫ ПЕРЕГОНКИ И ТОЧКА КИПЕНИЯ (ОФС 42-0036-07)

Под температурными пределами перегонки подразумевают интервал между начальной и конечной температурой кипения при нормальном давлении 101,3 кПа (760 мм рт. ст.).

Начальной температурой кипения считают температуру, при которой в приемник перегнались первые 5 капель жидкости. Конечной температурой кипения считают температуру, при которой в приемник перешло 95% жидкости.

Точка кипения — скорректированная температура, при которой давление пара жидкости достигает 101,3 кПа.

Определение температурных пределов перегонки

Прибор. Прибор (рис. 6.1 — не приводится) состоит из перегонной колбы (A), прямого холодильника (B) и аллонжа (C); допускается использовать холодильник с изогнутым нижним концом. Колбу снабжают термометром, конец ртутного шарика которого должен находиться на 5 мм ниже от нижнего края отводной трубки перегонной колбы. Применяют укороченный термометр с диапазоном шкалы около 50 град. C и ценой деления 0,2 град. C.

пределов перегонки

Рисунок не приводится.

Во время испытания колбу защищают от охлаждения соответствующим экраном.

Для жидкостей, кипящих при температуре ниже 150 град. C, применяют водяное охлаждение; для жидкостей, кипящих при температуре выше 150 град. C, достаточно воздушного охлаждения.

Методика. В колбу помещают 50 мл исследуемой жидкости и несколько тонких запаянных с одного конца капилляров или кусочков пористого материала.

Начинают нагревание колбы, отмечают начальную температуру кипения и продолжают нагревание таким образом, чтобы в минуту перегонялось 2-3 мл жидкости. Перегоняют требуемый объем жидкости, отмечая конечную температуру кипения. Отгон собирают в приемник (цилиндр вместимостью 50 мл с ценой деления 1 мл). Приемник помещают так, чтобы аллонж входил в него на 2,5 см.

Наблюдаемую температуру перегонки (t1) приводят к нормальному давлению 101,3 кПа (760 мм рт. ст.) по формуле:

t2 = t1 + K x (P — P1), (1)

где:

t2 — исправленная температура, в градусах Цельсия;

t1 — наблюдаемая температура, в градусах Цельсия;

P — нормальное барометрическое давление, в кПа или мм рт. ст.;

P1 — барометрическое давление во время опыта, наблюдаемое по ртутному барометру или анероиду, в кПа или мм рт. ст., с учетом поправок, указанных в поверочном свидетельстве и в инструкции по эксплуатации;

K — поправочный коэффициент. Значения K зависят от температуры кипения перегоняемой жидкости и приведены в табл. 6.1.

Таблица 6.1

нормальному значению

Примечания

1. Если во время опыта давление измеряют ртутным барометром, то после внесения поправок, указанных в поверочном свидетельстве и в инструкции по эксплуатации, оно должно быть приведено к показаниям при температуре 0 град. C, для чего вычитают из показаний барометра:

0,27 кПа (2 мм рт. ст.) при температуре окружающей среды 13-20 град. C; 0,4 кПа (3 мм рт. ст.) при температуре окружающей среды 21-28 град. C; 0,53 кПа (4 мм рт. ст.) при температуре окружающей среды 29-35 град. C.

2. Перегонку эфира следует проводить на предварительно нагретой водяной бане при температуре от 54 до 58 град. C.

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений температуры кипения не должно превышать 1 град. C.

Определение точки кипения

Испытание проводят в приборе для определения температурных пределов перегонки, за исключением того, что термометр вводят в горло колбы так, чтобы нижний конец ртутного шарика находился на уровне нижнего конца горла колбы.

В колбу помещают 20 мл испытуемой жидкости и несколько кусочков пористого материала и быстро нагревают до кипения. Отмечают температуру, при которой жидкость начинает поступать по отводной трубке колбы в холодильник.

Отмеченную температуру кипения приводят к нормальному давлению по формуле (1).

Микрометод определения температуры кипения обычно используется для идентификации веществ.

В тонкостенную стеклянную запаянную с одного конца трубочку диаметром 3 мм и длиной около 8 см помещают несколько капель исследуемой жидкости, чтобы образовался слой от 1 до 1,5 см высоты. В трубочку вставляют открытым концом вниз запаянный с одного конца капилляр длиной около 10 см и диаметром около 1 мм. Трубочку прикрепляют с помощью резинового колечка или тонкой проволоки к укороченному термометру так, чтобы нижний конец трубочки находился на уровне середины ртутного шарика, и термометр помещают в прибор для определения температуры плавления. Нагревание ведут таким образом, чтобы температура поднималась на 2-3 град. C в минуту до того момента, когда из капилляра вместо отдельных воздушных пузырьков начнет выделяться непрерывная цепочка пузырьков пара, после чего прекращают или уменьшают нагрев. Момент, когда прекратится выделение пузырьков и жидкость начнет подниматься в капилляр, принимают за температуру кипения.

Наблюдаемую температуру кипения приводят к показаниям при нормальном давлении, как указано выше.

7. ПЛОТНОСТЬ (ОФС 42-0037-07)

                                                         m

Плотностью называют массу единицы объема вещества: ро = ---. Если массу V

m измеряют в  граммах, а  объем  V - в кубических сантиметрах, то плотность
представляет  собой   массу  1 куб. см  вещества:  ро г/куб. см.  Плотность
вещества ро20  является  отношением  массы   вещества  к   его  объему  при

температуре 20 град. C. 20

Относительная плотность вещества d является отношением массы 20 определенного объема вещества к массе равного объема воды при температуре 20 20 град. C. Относительная плотность вещества d является отношением массы 4 определенного объема вещества при температуре 20 град. C к массе равного объема воды при температуре 4 град. C.

Формулы пересчета между относительной плотностью (d) и плотностью (ро), выраженной в кг/куб. м, следующие:

                      20      20               -3
    ро20 = 998,202 x d   или d   = 1,00180 x 10   ро20;
                      20      20

                      20      20               -3
    ро20 = 999,972 x d   или d   = 1,00003 x 10   ро20;
                      4       4

     20               20
    d   = 0,998230 x d   .
     4                20

Определение плотности проводят с помощью пикнометра, ареометра или плотномера.

Метод 1

Применяют для определения плотности жидкостей с точностью до +/- 0,001 г/куб. см с помощью пикнометра.

Чистый сухой пикнометр взвешивают с точностью до 0,0002 г, заполняют с помощью маленькой воронки дистиллированной водой немного выше метки, закрывают пробкой и выдерживают в течение 20 мин. в термостате при температуре (20 +/- 0,1) град. C. При этой температуре уровень воды в пикнометре доводят до метки, отбирая излишек воды при помощи пипетки или свернутой в трубку полоски фильтровальной бумаги. Пикнометр снова закрывают пробкой и выдерживают в термостате еще 10 мин. Затем пикнометр вынимают из термостата и вытирают фильтровальной бумагой внутреннюю поверхность горлышка и весь пикнометр снаружи, проверяют положение мениска воды, который должен находиться на уровне метки, оставляют под стеклом аналитических весов в течение 10 мин. и взвешивают с той же точностью.

Пикнометр освобождают от воды, высушивают, споласкивая последовательно спиртом и эфиром (сушить пикнометр нагреванием не допускается), удаляют остатки эфира продуванием воздуха, заполняют пикнометр испытуемой жидкостью и проводят те же операции, что и с водой.

Плотность ро20 (г/куб. см) вычисляют по формуле:

                                     (m2 - m)

ро20 = 0,99703 x -------- + 0,0012, (m1 — m)

где:

m — масса пустого пикнометра, в граммах;

m1 — масса пикнометра с дистиллированной водой, в граммах;

m2 — масса пикнометра с испытуемой жидкостью, в граммах;

0,99703 — значение плотности воды при 20 град. C, в г/куб. см (с учетом плотности воздуха);

0,0012 — значение плотности воздуха при 20 град. C и барометрическом давлении 101,1 кПа (760 мм рт. ст.).

Метод 2

Применяют для определения плотности твердых жиров и воска. Проводят все операции с дистиллированной водой и высушивают пикнометр, как описано в методе 1. При помощи пипетки или небольшой воронки с оттянутым концом вносят в пикнометр расплавленный жир или воск в таком количестве, чтобы он занимал 1/3-1/2 объема пикнометра. Пикнометр без пробки ставят на один час в горячую воду, затем охлаждают до температуры 20 град. C и взвешивают. Содержимое пикнометра доводят до метки дистиллированной водой при температуре 20 град. C, вытирают пикнометр и снова взвешивают. В обеих фазах и на поверхности их раздела не должно быть пузырьков воздуха.

Величину плотности ро20 вычисляют по формуле:

                             (m2 - m)

ро20 = 0,99703 x --------------------- + 0,0012, (m1 + m2) — (m + m3)

где:

m — масса пустого пикнометра, в граммах;

m1 — масса пикнометра с дистиллированной водой, в граммах;

m2 — масса пикнометра с жиром, в граммах;

m3 — масса пикнометра с жиром и водой, в граммах.

Метод 3

Применяют для определения плотности жидкостей с точностью до +/- 0,01 г/куб. см с помощью ареометра.

Испытуемую жидкость помещают в цилиндр и при температуре 20 град. C осторожно опускают в нее чистый сухой ареометр, на шкале которого предусмотрена ожидаемая величина плотности. Ареометр не должен касаться стенок и дна цилиндра. Через 3-4 мин. после погружения ареометра производят отсчет по делению шкалы ареометра, соответствующему нижнему мениску жидкости (глаз должен быть на уровне мениска).

Примечания

1. Определение плотности сильнолетучих веществ ареометром не допускается.

2. В случае определения плотности в темноокрашенных жидкостях отсчет производят по верхнему мениску.

Метод 4

Применяют для определения плотности жидкостей и газов в малом объеме (1-2 мл) с точностью до +/- 0,0001 г/куб. см с помощью плотномера.

Принцип измерения плотности плотномером основан на определении периода колебаний U-образной измерительной трубки определенного объема, вызываемых электромагнитным генератором.

Частота собственных колебаний трубки зависит от ее конструктивных особенностей — упругости и массы и определяется в процессе калибровки при заполнении ее веществом с известной плотностью. При заполнении трубки испытуемым веществом частота колебаний трубки меняется в зависимости от массы (плотности) вещества. Измеряемый специальным датчиком период колебаний измерительной трубки автоматически пересчитывается на плотность образца в г/куб. см.

8. ВЯЗКОСТЬ (ОФС 42-0038-07)

Вязкость (внутреннее трение) — свойство текучих тел оказывать сопротивление перемещению одной их части относительно другой.

Основными кинематическими переменными для жидкостей служат деформация и ее скорость. Поэтому для изучения реологических характеристик жидких сред устанавливают связь между приложенными внешними нагрузками и кинематическими параметрами.

Жидкости, вязкость которых не зависит от напряжения сдвига и при определенной концентрации и температуре является постоянной величиной в соответствии с законом Ньютона, называются ньютоновскими. Неньютоновские жидкости не следуют закону Ньютона, их вязкость зависит от напряжения сдвига.

Различают динамическую, кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкости. Для неньютоновских жидкостей, главным образом, характерна структурная вязкость. Структурная (эффективная или кажущаяся) вязкость — вязкость при данном напряжении сдвига.

Динамическая вязкость или коэффициент вязкости (эта) — это приходящаяся

на  единицу  поверхности  тангенциальная сила, называемая также напряжением
сдвига  (тау), выраженная в паскалях (Па), которую необходимо приложить для
того,  чтобы  переместить слой жидкости площадью 1 кв. м со скоростью (v) 1

                 -1

метр в секунду (м x с ), находящийся на расстоянии (х) 1 метр относительно другого слоя, параллельно плоскости скольжения.

Величина dv/dx представляет собой градиент скорости и определяет -1

скорость сдвига D, выраженную в обратных секундах (с  ). Таким образом,

                            эта = тау/D,                                (1)

    Динамическую   вязкость   (эта)  обычно  выражают  в  пуазах  (пз)  или
сантипуазах  (1  спз  =  0,01  пз).  Жидкость  имеет  вязкость  1  пз, если

                                                       -1

напряжение  сдвига 1 дин/кв. см создает скорость сдвига 1 с  . В системе СИ
динамическая    вязкость   выражается   в   паскаль-секундах   (Па x c) или

миллипаскаль-секундах (мПа x с). 1 сП = 1 мПа x с.

Кинематическую вязкость (ню), выраженную в метрах квадратных на секунду -1

(кв. м x с  ), получают  делением  величины  динамической  вязкости эта  на
плотность  жидкости  ро,  выраженную  в   килограммах  на  метр  кубический

   -3

(кг x м  ), измеренную при той же температуре:

                           ню = эта/ро,                                 (2)

Кинематическую вязкость обычно выражают в стоксах (ст) или сантистоксах

(1 сст = 0,01 ст),   в   системе  СИ - в  метрах   квадратных   на  секунду
          -1                                                   -1
(кв. м x с  ) или миллиметрах квадратных на секунду (кв. мм х с  ).

                     -1

    1 ст = 10-4 кв. м x с  .

    В   ряде   случаев   требуется   определить   вязкость  одной  жидкости
относительно другой - относительную вязкость (эта   ).

                                             отн

Часто вязкость выражают как удельную вязкость (эта ), которая уд показывает, какая часть вязкости раствора обусловлена присутствием в нем растворенного вещества:

                      эта - эта0   эта
             эта   = ---------- = ----- - 1 = эта    - 1,               (3)
                уд       эта0      эта0          отн

где:

эта — вязкость раствора;

эта0 — вязкость растворителя.

    Удельная   вязкость,   отнесенная   к  единице  концентрации  раствора,
называется приведенной вязкостью (эта    ):

                                 прив

                        эта
                           уд

                эта     = --------,                                     (4)
                   прив     с

где: с — концентрация раствора.

Для растворов полимеров вязкость является функцией молекулярных масс, формы, размеров и гибкости макромолекул. Чтобы определить структурные характеристики полимеров, приведенную вязкость экстраполируют к нулевой концентрации. В этом случае вводится понятие характеристической вязкости [эта]:

                                           эта
                                              уд

                   [эта] = lim  эта     = lim  -------.                 (5)
                           с->0    прив   с->0   c

Характеристическая вязкость выражается в единицах, обратных единицам концентрации.

Для определения вязкости применяются капиллярные, ротационные вискозиметры и вискозиметры с падающим шариком.

Капиллярные вискозиметры обычно используются для определения вязкости при одном значении скорости сдвига, поэтому применяются в основном для исследования ньютоновских жидкостей. Они просты и удобны в обращении.

Ротационные вискозиметры позволяют определять реологические свойства жидкостей в широком диапазоне скоростей сдвига, что особенно важно для неньютоновских жидкостей.

Вискозиметр с падающим шариком (вискозиметр Гепплера) предназначен для измерения вязкости прозрачных ньютоновских жидкостей.

Допускается использование других вискозиметров при условии, что точность и правильность измерений будет не хуже, чем в случае использования вискозиметров, описанных ниже.

Измерение вязкости на капиллярных вискозиметрах

Для измерения кинематической вязкости применяются капиллярные вискозиметры типа Оствальда и Уббелоде с различными модификациями.

Стеклянные капиллярные вискозиметры предназначены: 1) серии ВПЖ и ВПЖТ — для определения вязкости прозрачных жидкостей; 2) серии ВПЖМ и ВПЖТМ — для определения вязкости малых объемов прозрачных жидкостей; 3) серии ВНЖ и ВНЖТ — для определения вязкости непрозрачных жидкостей.

На рис. 8.1 и 8.2 (не приводятся) представлен общий вид вискозиметров серии ВПЖ.

Рис. 8.1. Вискозиметр стеклянный капиллярный ВПЖ-1

Рисунок не приводится.

Рис. 8.2. Вискозиметр стеклянный капиллярный ВПЖ-2

Рисунок не приводится.

Вискозиметр состоит из капилляра с радиусом R и длиной L, через который под действием силы тяжести протекает жидкость объема V.

    Если  H  -  средняя  высота  жидкости,  g  - ускорение силы тяжести, то
кинематическая   вязкость   (ню)  в  миллиметрах   квадратных   на  секунду

       -1

(кв. мм x с ) равна:

                            4

                  эта     пи x R  x g x H
             ню = ---- = ------------------ x t = K x t,                (6)
                   ро        8 x L x V

                4

              пи x R  x g x H
    где: K = ----------------     - постоянная прибора, обычно выражаемая в
                 8 x L x V     миллиметрах квадратных на секунду квадратную

                                       -2

                                (кв. мм x с   ).

    Если  известна  плотность  испытуемой  жидкости  ро, то, зная ню, можно

вычислить динамическую вязкость эта:

эта = ро x ню = ро x K x t, (7)

где:

эта — динамическая вязкость в миллипаскаль-секундах (мПа x с);

    ро  -  плотность  испытуемой  жидкости,  в  миллиграммах  на  миллиметр
                   -3                                                   20
кубический (мг x мм  ), полученная умножением относительной плотности (d  )

                                                                    20

на 0,9982.

Для определения вязкости в каждом конкретном случае капиллярные вискозиметры выбирают в соответствии с табл. 8.1 и 8.2 по известным значениям K и V в зависимости от характера испытуемой жидкости, ее объема и значения вязкости.

Таблица 8.1

Характеристики капиллярных вискозиметров серии ВПЖ-1

Таблица 8.2

Характеристики капиллярных вискозиметров серии ВПЖ-2

Методика. Перед проведением измерений вискозиметр следует тщательно промыть и высушить.

В колено 2 вискозиметра наливают измеренный объем жидкости и вискозиметр помещают в вертикальном положении в водяной термостат с температурой (20 +/- 0,1) град. C, если в частной фармакопейной статье не указана другая температура, удерживая его в этом положении не менее 30 мин. для установления температурного равновесия. Производят подсасывание через отверстие 1 (в случае вискозиметра ВПЖ-1; при этом закрывают трубку 4 — рис. 8.1) до тех пор, пока жидкость не поднимется выше отметки М1. Тогда подсасывание прекращают, и жидкость опускается. Время t, которое требуется, чтобы мениск прошел расстояние между отметками М1 и М2, замеряют секундомером с точностью до 0,2 с.

Время истечения испытуемой жидкости определяют как среднее не менее чем трех измерений. Полученные данные являются приемлемыми при условии, что результаты двух последовательных измерений отличаются не более чем на 1%.

Для определения относительной вязкости жидкости измеряют время t ocp

истечения  между верхней и нижней меткой мениска той жидкости, относительно
которой   проводят   измерения   эта   . Затем   в  том  же  чистом и сухом

                                отн

вискозиметре при тех же условиях определяют время истечения t cp

испытуемой   жидкости.   Одновременно    измеряют   плотности    испытуемых
жидкостей  ро0  и  ро пикнометрическим методом и рассчитывают относительную

вязкость по формуле:

                                t
                                 ср. x ро

                         эта     = -------------                        (8)
                            отн.    t     x ро0

                                 оср.

    Для   измерения  характеристической  вязкости  готовят  не  менее  пяти
различных  концентраций  испытуемого  раствора. При этом должно выполняться
условие  возможности  линейной экстраполяции приведенной вязкости к нулевой
концентрации,  т.е.  концентрации  раствора следует выбирать минимальными в
пределах   чувствительности   и   точности  метода  измерения.  Для  каждой
концентрации раствора определяют t   и  рассчитывают  приведенную вязкость.

                              cp.

Затем строят зависимость эта от концентрации с и графически или прив. линейным методом наименьших квадратов экстраполируют приведенную вязкость к нулевой концентрации, т.е. находят характеристическую вязкость.

Измерение вязкости на ротационных вискозиметрах

Ротационные вискозиметры обычно используют для измерения динамической вязкости. Они представляют собой системы с жесткими соосно расположенными цилиндрами, конусами или дисками, в которых осуществляется сдвиговое течение (рис. 8.3 — не приводится).

Рис. 8.3. Геометрия ротационных вискозиметров

Рисунок не приводится.

Принцип действия наиболее часто используемых ротационных вискозиметров заключается в измерении силы сдвига в жидкой среде, расположенной между двумя коаксиальными цилиндрами, один из которых вращается двигателем, а второй приводится во вращение первым. Вязкость (структурная, эффективная или кажущаяся) характеризуется углом (М), на который поворачивается второй цилиндр; этот угол пропорционален моменту силы, выраженному в ньютон-метрах (H x м).

В случае ламинарного потока, динамическую вязкость эта, выраженную в паскаль-секундах (Па x с), рассчитывают по формуле:

          1     {  M }   { 1      1  }        M
  эта = ----- x {----} x {---- - ----} = K x -----,                     (9)
        омега   {4пиh}   { 2       2 }       омега
                         {R       R  }
                         { A       B }

где:

h — глубина погружения второго цилиндра в жидкую среду, в метрах;

R — радиус меньшего из цилиндров, в метрах; A

R — радиус большего из цилиндров, в метрах; B

омега — угловая скорость, в радианах на секунду;

K — постоянная вискозиметра.

Постоянная вискозиметра K может быть определена при разных скоростях вращения с использованием градуировочных жидкостей для калибровки вискозиметров. Выпускаемые приборы сопровождаются таблицами, в которых приведена постоянная вискозиметра в зависимости от площади поверхности используемого цилиндра и скорости его вращения.

Вязкость измеряют в соответствии с инструкцией по применению ротационного вискозиметра. Температуру, при которой измеряют вязкость, указывают в частной фармакопейной статье. Для неньютоновских жидкостей в частной фармакопейной статье указывают тип вискозиметра и угловую скорость или скорость сдвига, при которых проводят измерения.

Измерение вязкости на вискозиметре с падающим шариком

Измерение вязкости на вискозиметрах Гепплера с падающим шариком основано на определении скорости падения шарика в жидкости.

    На  рис.  8.4 (не приводится) показан общий вид вискозиметра с падающим
шариком.  В  комплект  вискозиметра  входят  шарики с диаметром от 10,00 до
15,80  мм,  что обеспечивает измерение динамической вязкости градуировочных

                                  4

жидкостей в диапазоне от 0,6 до 8 x 10 мПа x с.

Рис. 8.4. Вискозиметр с падающим шариком

Рисунок не приводится.

Методика. Для измерения вязкости испытуемую жидкость заливают в трубку, опускают шарик и термостатируют вискозиметр при температуре (20 +/- 0,1) град. C, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, в течение примерно 30 мин. Далее шарик ставят в исходное положение и включают секундомер, когда нижняя часть шарика коснется верхней метки, и останавливают, когда шарик достигнет нижней метки. Время движения шарика измеряют не менее 5-7 раз. При этом разность между наибольшим и наименьшим значениями времени движения шарика не должна превышать 0,5% от его среднего значения. Динамическую вязкость испытуемой жидкости вычисляют по формуле:

                    эта = K x (ро   - ро ) x t   ,                     (10)
                                 ш.     ж      ср.

где:

эта — динамическая вязкость;

K — постоянная вискозиметра;

     Ро   и  Ро   - плотности шарика и жидкости соответственно;
       ш.      ж.
     t    - среднее время движения шарика между крайними метками.

  cp.

Постоянная вискозиметра K определяется по формуле:

                        эта
                           о

                 K = --------------------,                             (11)
                     (ро  - ро  ) x t
                        ш     ож     оср

где:

эта — динамическая вязкость градуировочной жидкости; о

    ро  и ро   - плотности шарика и градуировочной жидкости соответственно;
      ш     ож
    t    - среднее    значение    времени   движения   данного   шарика   в
     оср   градуировочной жидкости.

    Число  постоянных  вискозиметра соответствует числу шариков, входящих в

комплект вискозиметра.

    При   необходимости   постоянные   прибора   могут  быть  проверены  по
вышеуказанной  формуле  с  помощью  градуировочных  жидкостей  с известными
значениями   динамической  вязкости.  Плотность  шариков ро  вычисляют   по

                                                       ш

формуле:

                           6 х m

                        ро  = ----------,                              (12)
                          ш           3

                           пи x d

где:

m — масса шарика, определяемая взвешиванием;

d — диаметр шарика.

Перед проведением измерений вискозиметр следует тщательно промыть и высушить.

9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПИРТА ЭТИЛОВОГО В ЖИДКИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ (ОФС 42-0039-07)

Спирт этиловый в жидких фармацевтических препаратах в зависимости от состава и физико-химических свойств присутствующих в препарате компонентов может быть определен одним из методов: дистилляцией или газовой хроматографией. Метод количественного определения спирта должен быть указан в частной фармакопейной статье.

Метод дистилляции

Данный метод заключается в отгонке спирта этилового от растворенных в нем веществ.

В круглодонную колбу (1) вместимостью 200-250 мл вносят точно отмеренное количество препарата. При содержании спирта в препарате до 20% для определения берут 75 мл препарата, при содержании от 20 до 50% — 50 мл, при содержании от 50% и выше — 25 мл; перед перегонкой препарат разбавляют водой до 75 мл.

Колбу присоединяют через каплеотбойник (2) к вертикально расположенному шариковому холодильнику с отводной трубкой (3), направляющей дистиллят в приемник — мерную колбу вместимостью 50 мл (4), помещенный в стакан с водой (5) (рис. 9.1 — не приводится).

Нагревают перегонную колбу с помощью электроплитки с сеткой. Для равномерного кипения в колбу с раствором препарата помещают капилляры, пемзу или кусочки прокаленного фарфора. Если раствор препарата при перегонке сильно пенится, то прибавляют 2-3 мл концентрированных фосфорной или серной кислот, кальция хлорид, парафин, воск (2-3 г).

Собирают около 48 мл отгона, охлаждают его до температуры 20 град. C, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Отгон может быть прозрачным или слегка мутным.

Определяют плотность отгона пикнометром и по алкоголеметрическим таблицам находят содержание спирта в процентах объемных.

Содержание спирта в препарате в процентах объемных (X) вычисляют по формуле:

                         50 x a

X = -------, b

где: 50 — объем отгона, в миллилитрах;

a — содержание спирта в отгоне, в процентах объемных;

b — объем испытуемого препарата, взятый для перегонки, в миллилитрах.

Если препарат содержит летучие вещества — эфирные масла, хлороформ, этиловый эфир, камфару, летучие кислоты или основания, свободный йод и т.д., его предварительно обрабатывают.

При содержании в препарате эфирных масел, хлороформа, этилового эфира, камфоры к нему добавляют в делительной воронке равные объемы насыщенного раствора натрия хлорида и петролейного эфира. Смесь взбалтывают в течение 3 мин. После разделения слоев спиртоводный слой сливают в другую делительную воронку и обрабатывают таким же образом половинным количеством петролейного эфира. Спиртоводный слой сливают в колбу для перегонки, а объединенные эфирные извлечения взбалтывают с половинным количеством насыщенного раствора натрия хлорида, потом присоединяют к жидкости, находящейся в колбе для перегонки.

Если препарат содержит менее 30% спирта, то высаливание проводят не раствором, а 10 г сухого натрия хлорида.

При содержании в препарате летучих кислот их нейтрализуют раствором щелочи, а при содержании летучих оснований — фосфорной или серной кислотами.

спирта этилового

Рисунок не приводится.

Препараты, содержащие свободный йод, перед дистилляцией обрабатывают до обесцвечивания цинковой пылью или рассчитанным количеством сухого натрия тиосульфата. Для связывания летучих сернистых соединений к препарату прибавляют несколько капель 10% раствора натрия гидроксида.

Метод газовой хроматографии

Данный метод основан на сорбционном хроматографическом отделении спирта от растворенных в нем веществ.

Для проведения анализа используют газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и с хроматографической колонкой размером 150x0,4 см, заполненной полимерным сорбентом Porapak Q с размером частиц 100-120 меш.

Температура колонки — 150 град. C; температура испарителя — 170 град. C; температура детектора — 170 град. C. Скорость газа-носителя (азот или гелий) — 30 мл/мин.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают точно отмеренное количество испытуемого препарата, достаточное для получения раствора, содержащего 4-6% этанола по объему, прибавляют 5,0 мл пропанола (внутренний стандарт), перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Раствор стандартного образца. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 5,0 мл спирта этилового 95% (стандартный образец) и 5,0 мл пропанола (внутренний стандарт), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

В испаритель газового хроматографа, выведенного на рабочий режим, вводят последовательно по 1-2 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца и регистрируют хроматограммы.

Содержание спирта этилового в препарате в процентах объемных (X) рассчитывают по формуле:

                            /
                       S x S    x 5,0 x P
                            ст.

X = -------------------, /

                             S    x S  x V
                              ст.         пр.

где:
     /

S и S — площади пика спирта этилового на хроматограммах анализируемого раствора и раствора стандартного образца соответственно; /

    S    и  S    - площади  пика  пропанола  на хроматограммах  испытуемого
     ст.     ст.

               раствора и раствора стандартного образца соответственно;

V — объем препарата, взятый для анализа, в миллилитрах; пр.

P — содержание спирта этилового в стандартном образце, в процентах.

Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

Проверка пригодности хроматографической системы. Система считается пригодной, если:

• разрешение (R) пиков спирта этилового и пропанола не менее 2,0;
• коэффициент асимметрии (T) пика спирта этилового не превышает 1,5;
• относительное стандартное отклонение (RSD) не превышает 2,0%.

10. РЕФРАКТОМЕТРИЯ (ОФС 42-0040-07)

Показателем преломления (индексом рефракции) называют отношение скорости света в вакууме к скорости света в испытуемом веществе (абсолютный показатель преломления). На практике определяют так называемый относительный показатель преломления (n), который является отношением скорости света в воздухе к скорости света в испытуемом веществе.

Показатель преломления зависит от температуры и длины волны света, при которой проводят определение. В растворах показатель преломления зависит также от концентрации вещества и природы растворителя.

Рефрактометрию применяют для установления подлинности и чистоты вещества. Метод применяют также для определения концентрации вещества в растворе, которую находят по графику зависимости показателя преломления раствора от концентрации. На графике выбирают интервал концентраций, в котором наблюдается линейная зависимость между показателем преломления и концентрацией. В этом интервале концентрацию вычисляют по формуле:

X = (n — n )/F, o

где:

X — концентрация, в процентах;

n — показатель преломления раствора;

n — показатель преломления растворителя при той же температуре; o

F — фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации на 1% (устанавливается экспериментально).

    Для   определения   показателя   преломления  применяют  рефрактометры.
Определение  проводят  при  температуре  (20 +/- 0,5) град. C и длине волны

линии D спектра натрия (589,3 нм). Показатель преломления, определенный при 20 таких условиях, обозначается индексом n . D

Современные приборы откалиброваны таким образом, что отсчеты, полученные по их шкалам, соответствуют показателям преломления для D линии спектра натрия. При проведении измерений следует соблюдать указания в отношении соответствующего источника света, приведенные в инструкции к прибору. Если используют белый свет, то рефрактометр снабжен компенсирующей системой.

Цена деления термометра не должна превышать 0,5 град. C.

    Обычно  измерения  показателя  преломления  проводят  на рефрактометрах
Аббе,  в  основу которых положено явление полного внутреннего отражения при
прохождении  светом  границы  раздела  двух  сред  с  разными  показателями
преломления.  Диапазон  измеряемых  показателей преломления при измерении в
проходящем  свете 1,3-1,7. Точность измерения показателя преломления должна

                   -4

быть не ниже +/- 2 x 10  .
    Могут  быть  использованы  рефрактометры  других  типов  с такой же или

большей точностью.

    Рефрактометры  юстируют  по  эталонным  жидкостям,  приведенным в табл.
10.1,  значения показателей преломления которых обозначены на этикетке, или
                                                 20             25
по  дистиллированной   воде,   для   которой    n   = 1,3330 и n   = 1,3325
                                                 D              D

(дельта n/дельта t = — 0,000085).

Таблица 10.1

Температурные коэффициенты эталонных жидкостей

11. ПОЛЯРИМЕТРИЯ (ОФС 42-0041-07)

Оптическое вращение — свойство вещества вращать плоскость поляризации при прохождении через него поляризованного света.

В зависимости от природы оптически активного вещества вращение плоскости поляризации может иметь различное направление и величину. Если от наблюдателя, к которому направлен свет, проходящий через оптически активное вещество, плоскость поляризации вращается по часовой стрелке, то вещество называют правовращающим и перед его названием ставят знак (+); если же плоскость поляризации вращается против часовой стрелки, то вещество называют левовращающим и перед его названием ставят знак (-).

Величину отклонения плоскости поляризации от начального положения, выраженную в угловых градусах, называют углом вращения и обозначают греческой буквой альфа. Величина угла вращения зависит от природы оптически активного вещества, длины пути поляризованного света в оптически активной среде (чистом веществе или растворе) и длины волны света. Для растворов величина угла вращения зависит от природы растворителя и концентрации оптически активного вещества. Величина угла вращения прямо пропорциональна длине пути света, т.е. толщине слоя оптически активного вещества или его раствора. Влияние температуры в большинстве случаев незначительно.

    Для   сравнительной   оценки   способности  различных  веществ  вращать
плоскость  поляризации света вычисляют величину удельного вращении [альфа].

                                 20

Удельное оптическое вращение [альфа] представляет собой угол вращения D

альфа плоскости поляризации монохроматического света при  длине волны линии
D спектра  натрия  (589,3 нм),   выраженный  в  градусах,   измеренный  при

температуре 20 град. C, рассчитанный для толщины слоя испытуемого вещества

1 дм  и приведенный  к  концентрации  вещества, равной 1 г/мл. Выражается в
                                                       -1    -1
градус-миллилитрах на дециметр-грамм [(град.) x мл x дм   x г  ].

Иногда для измерения используют зеленую линию спектра ртути с длиной волны 546,1 нм.

При определении [альфа] в растворах оптически активного вещества необходимо иметь в виду, что найденная величина может зависеть от природы растворителя и концентрации оптически активного вещества.

Замена растворителя может привести к изменению [альфа] не только по величине, но и по знаку. Поэтому, приводя величину удельного вращения, необходимо указывать растворитель и выбранную для измерения концентрацию раствора.

Удельное вращение определяют либо в пересчете на сухое вещество, либо из высушенной навески, что должно быть указано в частной фармакопейной статье.

Измерение угла вращения проводят на поляриметре, позволяющем определить величину угла вращения с точностью +/- 0,02 град. C, при температуре (20 +/- 0,5) град. C. Измерения оптического вращения могут проводиться и при других значениях температуры, но в таких случаях в частной фармакопейной статье должен быть указан способ учета температуры. Шкалу обычно проверяют при помощи сертифицированных кварцевых пластинок. Линейность шкалы может быть проверена при помощи растворов сахарозы.

Оптическое вращение растворов должно быть измерено в течение 30 мин. с момента их приготовления; растворы или жидкие вещества должны быть прозрачными. При измерении, прежде всего, следует установить нулевую точку прибора или определить величину поправки с трубкой, заполненной чистым растворителем (при работе с растворами), или с пустой трубкой (при работе с жидкими веществами). После установки прибора на нулевую точку или определения величины поправки проводят основное измерение, которое повторяют не менее 3 раз.

Для получения величины угла вращения альфа показания прибора, полученные при измерениях, алгебраически суммируют с ранее найденной величиной поправки.

Величину удельного вращения [альфа] рассчитывают по одной из следующих формул.

Для веществ, находящихся в растворе:

                                   альфа x 100

[альфа] = ------------, (1) l x c

где:

альфа — измеренный угол вращения, в градусах;

l — толщина слоя, в дециметрах;

c — концентрация раствора, в граммах вещества на 100 мл раствора.

Для жидких веществ:

                                   альфа

[альфа] = --------, (2) l x ро

где:

альфа — измеренный угол вращения, в градусах;

l — толщина слоя, в дециметрах;

ро — плотность жидкого вещества, в граммах на 1 мл.

Измерение величины угла вращения проводят либо для оценки чистоты оптически активного вещества, либо для определения его концентрации в растворе. Для оценки чистоты вещества по уравнению (1) или (2) рассчитывают величину его удельного вращения [альфа]. Концентрацию оптически активного вещества в растворе находят по формуле:

                             альфа x 100

C = ------------, (3) [Альфа] x l

Поскольку величина [альфа] постоянна только в определенном интервале концентраций, возможность использования формулы (3) ограничивается этим интервалом.

12. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Спектроскопические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного определения светопоглощающих соединений.

В зависимости от используемой аппаратуры в фармацевтическом анализе различают следующие методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излучения и испускании света:

• спектрофотометрия в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях;
• спектрофотометрия в инфракрасной (ИК) области;
• атомно-эмиссионная и атомно-абсорбционная спектроскопия (АЭС и ААС);
• флуориметрия;
• спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Ряд длин волн, для которых проводятся измерения методами абсорбционной спектрофотометрии, охватывает спектральную область от коротких длин волн в УФ-области до ИК-области. Для удобства отнесений этот спектральный ряд делится на следующие диапазоны длин волн: УФ (от 190 до 380 нм), видимый (от 380 до 780 нм), ИК (от 0,78 до 400 мкм).

12.1. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ И ВИДИМОЙ ОБЛАСТЯХ (ОФС 42-0042-07)

Уменьшение величины монохроматического излучения, проходящего через гомогенную поглощающую среду, количественно описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

log10(1/T) = A = эпсилон x c x b, (1)

где:

T — пропускание; T — I/I ; o

I — интенсивность прошедшего монохроматического излучения;

I — интенсивность падающего монохроматического излучения; o

эпсилон — молярный показатель поглощения;

c — молярная концентрация вещества в растворе;

b — длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах.

Величина log10(1/T) носит название оптической плотности, обозначается буквой A и является измеряемой величиной. В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (A) пропорциональна концентрации вещества в растворе (c) и толщине слоя (b). 1%

Величина A представляет собой удельный показатель поглощения, т.е. 1 см оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л (1 г/100 мл) 1% в кювете с толщиной слоя 1 см. Величины A и эпсилон связаны 1 см соотношением:

                1%     10 x эпсилон
               A     = -------------,                                   (2)
                1 см      М.м.

где М.м. — молекулярная масса исследуемого вещества.

Измерение оптической плотности. Если нет других указаний в частной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 +/- 1) град. C по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора при данной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,4 и желательно, чтобы она была менее 0,2. Для снижения величины ошибки при определении оптической плотности концентрация раствора (а иногда и толщина слоя) подбираются таким образом, чтобы оптическая плотность в исследуемой спектральной области находилась в пределах от 0,2 до 0,8.

Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция длины волны — по оси абсцисс.

Если в частной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на +/- 2 нм.

Приборы. Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей монохроматическое излучение в области от 190 до 780 нм и обеспечивающей его прохождение через образец, и устройства для измерения оптической плотности.

Основными частями этих приборов являются: источник излучения, диспергирующий прибор (призма или решетка), щель для выделения полосы длин волн, кюветы для образцов, детектор излучаемой энергии, встроенные усилители и измерительные приборы.

Проверка шкалы длин волн в УФ и видимой области. Точность калибровки прибора по шкале длин волн в спектральном ряду проверяют по приведенным в табл. 12.1.1 спектральным линиям водородной (Hбета) или дейтериевой (Dбета) разрядной лампы, линиям паров ртути (Hg) кварцево-ртутной дуговой лампы, а также по максимумам поглощения раствора гольмия перхлората (Ho) (готовый реактив для калибровки спектрофотометра представляет собой 4% раствор гольмия оксида в 1,4 М растворе хлорной кислоты). Допустимое отклонение составляет +/- 1 нм для ультрафиолетовой и +/- 3 нм для видимой области.

Таблица 12.1.1

Спектральные линии для проверки шкалы длин волн

Шкала длин волн может быть калибрована также при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют фиксированные полосы поглощения в видимой и УФ-областях, а также стандартных стекол, содержащих дидим (смесь празеодима и неодима), и стекол, содержащих гольмий.

    Проверка  шкалы  оптической  плотности.  Для  проверки шкалы оптической
плотности  используют  стандартные  неорганические  стеклянные  фильтры или
раствор  калия дихромата при длинах волн, указанных в табл. 12.1.2, где для
каждой   длины   волны   приведено  точное  значение  удельного  показателя

        1%

поглощения A и допустимые пределы. 1 см

Раствор калия дихромата готовят следующим образом:

от 57,0 до 63,0 мг (точная навеска) калия дихромата, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 град. C, растворяют в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000 мл.

Таблица 12.1.2

различных длинах волн

Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть обнаружен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов: например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида в кювете с толщиной слоя 1 см при 200 нм при использовании воды в качестве раствора сравнения должна быть больше 2.

Разрешающая способность (для качественного анализа). Если есть указание в частной статье, определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02% (об/об) раствора толуола в гексане. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в частной статье.

Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина щели должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения (шириной на половине оптической плотности) и в то же время должна быть максимально велика для получения высокого значения интенсивности падающего монохроматического излучения (Io). Таким образом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности.

Кюветы. Допустимые отклонения в толщине слоя используемых кювет должны быть не более +/- 0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого раствора и раствора сравнения, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать.

Требования к растворителям. Для определений, производимых в ультрафиолетовой и видимой областях, образец анализируемого вещества растворяют в соответствующем растворителе, который должен быть оптически прозрачным в используемой области длин волн. Для этих областей длин волн пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры и разбавленные растворы сильных кислот и щелочей.

Идентификация

Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях спектра применяют для определения подлинности лекарственных средств путем:

• сравнения спектров поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;
• указания положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба; расхождение между наблюдаемыми и указанными длинами волн в максимумах и минимумах поглощения не должно обычно превышать +/- 2 нм.

Возможны и другие варианты применения, оговоренные в частных фармакопейных статьях.

Количественное определение

Определение концентрации веществ спектрофотометрическим методом основано на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера в форме:

                             A

C = ----------, (3) 1% A x b 1 см

где:

C — концентрация вещества в г/100 мл;

A — оптическая плотность испытуемого раствора; 1%

A — удельный показатель поглощения вещества; 1 см

b — толщина поглощающего слоя, в сантиметрах.

В ряде случаев даже при использовании монохроматического излучения могут наблюдаться отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, обусловленные процессами диссоциации, ассоциации и комплексообразования. Поэтому предварительно следует проверить линейность зависимости оптической плотности раствора от концентрации в аналитической области. При наличии отклонений от линейной зависимости следует пользоваться не формулой (3), а экспериментально найденной зависимостью.

Обычно определение концентрации спектрофотометрическим методом проводят с использованием стандартного образца. Расчет концентрации основан на использовании уравнения:

                             C     A
                            --- = ---,                                  (4)
                             C     A
                              o     o

где:

    C и C  - концентрации  испытуемого  раствора  и  раствора  стандартного
         o   образца соответственно;
    A и A  - оптические   плотности   испытуемого   раствора   и   раствора
         o   стандартного образца соответственно.

Вначале измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье, затем проводят измерение оптической плотности испытуемого раствора. Второе измерение проводят сразу после первого, с использованием той же кюветы, в тех же экспериментальных условиях.

Метод с использованием стандартного образца является более точным и надежным. Возможность применения значения удельного показателя поглощения в каждом конкретном случае следует обосновывать. Обычно метод с использованием значения удельного показателя поглощения применим при допусках содержания анализируемого вещества не менее +/- 10% от номинального содержания.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

                  m

                А  = SUM   E   x c        i = 1,...n,                   (5)
                 i   j = 1  ij    j

где:

А — оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны; i

E — показатели поглощения (зависящие от способа выражения Ij концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

c — концентрация j-го компонента образца. j

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в частных фармакопейных статьях.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности с длиной волны, d A/d лямбда) от длины волны.

    Спектр   второй   производной  представляет  собой  график  зависимости
                                   2         2
кривизны   спектра  поглощения   (d А/d лямбда )  от  длины  волны.  Вторая
производная  при  любой  длине  волны  связана  с  концентрацией  следующим

соотношением:

                       2 1%

                 2        d A
                d A          1 см
             --------- = ---------- x c x l,                            (6)
                     2            2
             d лямбда     d лямбда

где:

A — оптическая плотность при длине волны лямбда; 1%

A — удельный показатель поглощения при длине волны лямбда; 1 см

c — концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;

l — толщина слоя, в сантиметрах.

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Приборы. Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистентно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.

Разрешающая способность. Если указано в частных фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 12.1.1. (не приводится). Если нет других указаний в частных фармакопейных статьях, отношение A/B должно быть не менее 0,2.

Методика. Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в частной фармакопейной статье.

толуола (0,2 г/л) в метаноле

Рисунок не приводится.

12.2. СПЕКТРОМЕТРИЯ В ИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ (ОФС 42-0043-07)

Инфракрасные (ИК) спектры (колебательные спектры) возникают вследствие поглощения электромагнитной энергии при колебаниях ядер атомов в молекулах или ионах, которые сопровождаются изменением дипольных моментов, и представляют собой зависимость пропускания от длины волны (лямбда) или частоты колебаний (ню).

Под ИК-областью подразумевают электромагнитное излучение в области длин

волн  от  0,78  до  400 мкм. Область от 780 до 2500 нм (от 0,78 до 2,5 мкм)
рассматривается  как  ближняя ИК-область, область от 2,5 до 25 мкм (от 4000

      -1

до  400 см  ) относится к средней ИК-области спектра и область от 25 до 400
мкм  относится  к  дальней  ИК-области. Наиболее часто используется средняя

ИК-область.

Длину волны (лямбда) в ИК-спектрах обычно измеряют в микрометрах (микронах), мкм.

Поскольку частота колебаний в ИК-спектрах имеет большие числовые _ значения, обычно используют не частоты (ню), а волновые числа (ню), -1 которые измеряются в см и связаны с частотой (n) уравнением:

                         _

ню = ню/с,

где:
                         -1

ню — частота, в герцах (с ); -1

с — скорость света в вакууме, в см x с .

                    _

Волновое число (ню) связано с длиной волны (лямбда, в мкм) соотношением:

                               _       4

(ню) = 10 /лямбда.

Приборы. Могут быть использованы инфракрасные спектрофотометры, снабженные оптической системой (призмы или дифракционные решетки), выделяющей монохроматическое излучение в измеряемой области, или спектрофотометры с Фурье-преобразованием. В последних используется полихроматическое излучение и рассчитывается спектр в заданной области частот путем Фурье-преобразования исходных данных. В таких приборах вместо диспергирующего прибора используется интерферометр, а обработка спектральных данных производится с помощью компьютера.

Подготовка образца. Для записи спектра пропускания или поглощения готовят образец субстанции по одной из следующих методик.

Жидкости. Жидкости исследуют в форме пленки между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасного излучения, или в кювете с малой (обычно 0,01-0,05 мм) толщиной слоя, также прозрачной для инфракрасного излучения.

Жидкости или твердые вещества в растворе. Готовят раствор испытуемой субстанции в подходящем растворителе. Выбирают концентрацию вещества и толщину слоя кюветы, позволяющие получить удовлетворительный спектр.

Обычно хорошие результаты получают при концентрациях от 5 до 15 г/л при толщине слоя от 0,1 до 1 мм.

Поглощение растворителя компенсируют путем помещения в канал сравнения аналогичной кюветы, содержащей выбранный растворитель.

Кюветы. Если кюветы, заполненные растворителем, обладают разным поглощением при выбранной длине волны, то вносят поправку на измеренное поглощение испытуемого раствора. При использовании спектрофотометров с Фурье-преобразованием коррекция кювет не требуется, поскольку одна и та же кювета может быть использована и для растворителя и для испытуемого раствора. Кюветы для ИК-спектрометрии изготавливают из солевых материалов (NaCl, KBr, CaF2, LiF и др.). Область прозрачности кюветы в ИК-области зависит от использованного материала.

    Растворители.  Не  существует  растворителей,  которые при значительной
толщине    слоя    были   бы   полностью   прозрачными   для   ИК-спектров.
Четыреххлористый  углерод (при толщине слоя до 5 мм) практически  прозрачен

                 -1

до 6 мкм (1666 см ). Углерода дисульфид (толщиной 1 мм) подходит как -1

растворитель до 40 мкм (250 см  ) за исключением областей от 4,2 до 5,0 мкм
                     -1                                         -1
(от  2381  до 2000 см  ) и от 5,5 до 7,5 мкм (от 1819 до 1333 см  ), где он
имеет  сильное  поглощение.  Другие  растворители  прозрачны в относительно
узкой  области.  Растворители,  применяемые в ИК-спектрометрии, должны быть

инертны к материалу, из которого сделана кювета.

Твердые вещества. Твердые вещества исследуют в твердом состоянии (диски из галогенидов щелочных металлов), диспергированными в подходящей жидкости в виде суспензии или формируют пленку из расплавленной массы между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасного излучения. Подготовку образца описывают в частной фармакопейной статье.

Диски. 1-3 мг вещества, предназначенного для испытания, растирают с 150-200 мг, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, тщательно измельченного и высушенного калия бромида или калия хлорида (обычно используют калия бромид). Типичные условия высушивания калия бромида: при 105 град. C в вакууме, в течение 12 ч. Обычно такого количества достаточно для приготовления диска диаметром 13 мм и получения спектра подходящей интенсивности. Смесь тщательно перетирают, добиваясь необходимой однородности, и прессуют диск при давлении около 800 МПа (8 т/кв. см) в вакууме (2-3 мм рт. ст.) в течение 2-5 мин. Причиной образования некачественных дисков могут быть такие факторы, как недостаточное или чрезмерное растирание, влага или иные примеси в дисперсионной среде и недостаточное измельчение частиц.

Диск непригоден для испытания, если при визуальном осмотре он -1

неоднороден  по прозрачности или если его пропускание при 2000 см   (5 мкм)
составляет  менее  75%  без компенсации при отсутствии специфической полосы

поглощения.

Суспензии. Небольшое количество вещества, предназначенного для испытания, растирают с минимальным количеством вазелинового масла или другой подходящей жидкости (смешивают 5-20 мг твердого вещества с 1-2 каплями иммерсионной жидкости). Полученную суспензию сжимают между двумя пластинками (NaCl или KBr), прозрачными для инфракрасного излучения.

Газы. Газы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасного излучения, с длиной оптического пути около 100 мм. Откачивают воздух из кюветы и заполняют анализируемым газом через кран или при помощи игольчатого клапана.

Если необходимо, доводят давление в кювете до атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного излучения (например, азот или аргон). Для исключения помех, связанных с поглощением воды, углерода диоксида или других атмосферных газов, в канал сравнения помещают идентичную кювету, которая либо вакуумирована, либо заполнена газом, прозрачным для инфракрасного излучения.

Для записи спектра по методу нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) подготовку образца проводят одним из способов.

Растворы. Вещество растворяют в соответствующем растворителе, соблюдая условия, приведенные в частной фармакопейной статье. Раствор испаряют на поверхности элемента МНПВО, который обычно изготавливают из кристалла бромида йодида таллия (KRS-5), германия или другого минерала с большим показателем преломления.

Твердые вещества. Вещество помещают на поверхность элемента МНПВО таким образом, чтобы получить гомогенный контакт.

Идентификация с использованием стандартных образцов

Образец испытуемого вещества и стандартный образец готовят по одной и -1

той  же методике и записывают спектры в области от 4000 до 400 см   (от 2,5
до  25  мкм),  в  одних  и  тех  же  условиях.  Полосы поглощения в спектре
испытуемого  образца должны соответствовать по положению полосам поглощения
в  спектре  стандартного  образца.  Под  полосами  поглощения подразумевают

минимумы пропускания и максимумы поглощения.

Если спектры, полученные в твердом состоянии, показывают различия в положении полос поглощения, то испытуемую субстанцию и стандартный образец обрабатывают одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались или получались в одной и той же форме, или обрабатывают способом, указанным в частной фармакопейной статье, а затем снимают спектры.

Идентификация с использованием эталонных спектров

    Контроль  разрешающей способности. Записывают спектр пленки полистирола
толщиной  0,04 мм. Разность x (рис. 12.2.1 - не приводится) между процентом

                                               -1

пропускания при максимуме пропускания А при 2870 см (3,48 мкм) и минимуме -1 пропускания B при 2849,5 см (3,51 мкм) должна быть больше 18. Разность у -1 между процентом пропускания при максимуме пропускания C при 1589 см (6,29 -1 мкм) и минимуме пропускания D при 1583 см (6,32 мкм) должна быть больше

    Проверка   шкалы  волновых  чисел.  Шкала  волновых  чисел  может  быть
проверена  с  помощью пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания

                                               -1

(максимум поглощения) при волновых числах (в см ), приведенных в табл. 12.2.1.

    Методика.  Субстанцию готовят к испытанию в соответствии с инструкцией,
прилагаемой   к   эталонному   спектру.   Используя  условия,  при  которых

проводилась проверка разрешающей способности, записывают спектр испытуемого -1

образца  и  на  него  накладывают  полосы полистирола при 2849,5 см   (3,51
                 -1                          -1
мкм),  1601,2  см   (6,25  мкм)  и  1028,3 см   (9,72 мкм).  Сравнивают два
спектра  (эталонный  и  спектр испытуемой субстанции) и полосы полистирола,
указанные  выше.  При  использовании положения полос полистирола в качестве
стандартных   величин,   положения  значимых  полос  в  спектре  испытуемой
субстанции  и  в  эталонном  спектре  должны  соответствовать  друг другу в
пределах  0,5%  от шкалы волновых чисел. Относительная величина полос обоих

спектров должна согласовываться между собой.

используемый для проверки разрешающей способности

Рисунок не приводится.

Таблица 12.2.1

пленки полистирола

Примеси в газах

Для анализа примесей в газах используют кювету, прозрачную для инфракрасного излучения и имеющую соответствующую длину оптического пути (например, от 1 до 20 м). Кювету заполняют так, как указано в разделе «Газы». Для обнаружения и количественной оценки примесей используют методики, указанные в частных фармакопейных статьях.

12.3. АТОМНО-ЭМИССИОННАЯ И АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ (ОФС 42-0044-07)

Атомная спектрометрия — эмиссионная и абсорбционная — применяется для определения содержания элемента в испытуемом образце посредством измерения интенсивности одной из эмиссионных линий атомного пара (атомно-эмиссионная спектрометрия) или поглощения излучения атомным паром (атомно-абсорбционная спектрометрия) определяемого элемента путем измерения интенсивности эмиссии (испускания) или абсорбции (поглощения) света при определенной длине волны атомного пара элемента, генерированного из вещества, например, при введении раствора вещества в пламя. Определение проводят при длине волны, соответствующей выбранной эмиссионной или абсорбционной линии.

Точность обоих методов атомной спектрометрии, в зависимости от концентрации вещества, составляет 1-4%, чувствительность определяется свойствами аналитической линии, составом пробы, классом аппаратуры и может достигать 0,001 мкг/мл.

Принцип метода. Анализируемый раствор распыляется в виде аэрозоля в пламя горелки, работающей на горючем газе. Под действием температуры пламени происходит ряд сложных физико-химических процессов: испарение растворителя из капель аэрозоля, испарение твердых частиц, диссоциация молекул, возбуждение атомов и возникновение характеристического излучения атомов. Излучение определяемого элемента отделяется от постороннего с помощью светофильтра или монохроматора, попадает на фотоэлемент и вызывает фототок, который измеряется. Количественное определение элемента методом эмиссионной спектрометрии основано на функциональной зависимости интенсивности спектральной линии (I) от концентрации элемента в растворе (c). Прямопропорциональная зависимость между I и c имеет место лишь в определенной для данного элемента области концентраций. Линейную зависимость I от c может нарушать самопоглощение, ионизация, образование газообразных или трудно диссоциирующих в пламени соединений.

Прибор. Главными составными частями атомно-эмиссионного спектрометра являются: генератор атомного пара определяемого элемента (пламя, плазма, дуга и др.), монохроматор и детектор.

Если генератором является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени.

Принцип метода. Резонансное излучение от лампы с полым катодом проходит через пламя, в которое распыляется анализируемый раствор пробы. Излучение попадает на входную щель монохроматора, установленного таким образом, что из спектра выделяется только резонансная линия определяемого элемента, интенсивность которой измеряется фотоэлектрическим способом. Измеряют уменьшение интенсивности резонансной линии вследствие поглощения ее атомами определяемого элемента, принимая интенсивность неослабленной линии за 100%. Величина поглощения резонансного излучения пропорциональна числу атомов, находящихся в поглощающем слое.

Прибор. Главными составными частями прибора являются: источник излучения, атомный генератор определяемого элемента (пламя, печь и др.), монохроматор и детектор — для считывания сигнала из нагревательной камеры.

Для каждого определяемого элемента должен быть выбран специфический источник, излучающий спектральную линию, которая должна быть абсорбирована. Таким источником излучения обычно является полая катодная лампа, катод которой испускает излучение при возбуждении. Поскольку излучение, абсорбируемое испытуемым элементом, обычно той же длины волны, что и его линия эмиссии, в полой катодной лампе используется тот элемент, который определяется.

Прибор снабжен аспиратором для введения испытуемого образца в пламя, создаваемое газовыми смесями.

Число возбужденных атомов увеличивается с ростом температуры, которая зависит в основном от теплотворной способности создающего пламя газа (табл. 12.3.1).

Способ введения образца зависит от типа используемого генератора. Если генератором атомного пара является пламя, в качестве растворителя для приготовления испытуемого и стандартного растворов рекомендуется использовать воду. Могут использоваться и органические растворители, если они не влияют на стабильность пламени. При использовании печи может быть также использована техника ввода твердых проб.

В атомно-абсорбционной спектрометрии должна учитываться природа растворителя и концентрация твердых частиц. Идеальным считается растворитель с минимальными помехами в процессах поглощения или эмиссии, при использовании которого в пламени образуются нейтральные атомы. Если имеются значительные различия между поверхностным натяжением или вязкостью испытуемого раствора и стандартного раствора, то эти растворы всасываются и атомизируются с различной скоростью, что обуславливает существенное различие в генерированных сигналах. Концентрация кислоты в растворах также влияет на процессы абсорбции. Таким образом, растворители, используемые для приготовления испытуемого и стандартного растворов в методе ААС, должны быть одними и теми же или максимально похожими и должны образовывать растворы, которые легко всасываются через трубку форсунки аспиратора.

Присутствие в растворе частиц нерастворенного твердого вещества может вызвать помехи при проведении анализа, поэтому общее содержание нерастворимых твердых частиц в растворах должно быть менее 2%.

Атомный пар может быть получен также вне спектрометра, например, методом «холодного пара» для определения ртути или гидридным методом. При определении ртути атомы генерируются при химическом восстановлении, и атомный пар вносится потоком инертного газа в абсорбционную ячейку, расположенную на оптическом пути прибора. В гидридном методе получают гидрид определяемого элемента, который либо смешивается с газом, питающим горелку, либо вносится инертным газом в нагретую абсорбционную ячейку, где он диссоциирует на атомы.

Методика. Прибор выводят на режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора и устанавливают требуемую длину волны. В генератор атомного пара вводят холостой раствор и настраивают регистрирующее устройство на нулевое значение в случае атомно-эмиссионного спектрометра и на максимальное светопропускание в случае атомно-абсорбционной спектрометрии. Вводят стандартный раствор определяемого элемента с наибольшей концентрацией и подбирают чувствительность для получения подходящего значения регистрируемого сигнала.

Испытуемый раствор готовят, как указано в частной фармакопейной статье.

Определения проводят путем сравнения со стандартными растворами известной концентрации определяемого элемента одним из двух методов: методом калибровочной кривой или методом стандартных добавок.

Каждый раствор вводят в генератор прибора не менее трех раз и записывают установившееся показание. Каждый раз промывают прибор холостым раствором и проверяют, чтобы показание прибора возвращалось к первоначальному значению для холостого раствора.

В случае использования печи в качестве генератора атомного пара между измерениями ее отжигают.

Метод калибровочной кривой. Готовят не менее трех стандартных растворов определяемого элемента таким образом, чтобы ожидаемое значение концентрации испытуемого раствора находилось внутри диапазона концентраций стандартных растворов. Все реагенты, используемые при приготовлении испытуемого раствора, прибавляют к стандартным растворам и холостому раствору в таких же концентрациях.

Строят калибровочную кривую зависимости среднего значения результата измерения (I), полученного для стандартных растворов, от концентрации (c) и определяют концентрацию элемента в испытуемом растворе по калибровочной кривой.

Метод стандартных добавок. Равные объемы испытуемого раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы одинаковой вместимости. Во все колбы, кроме одной, прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы стандартного раствора, содержащего известную концентрацию определяемого элемента (стандартные добавки), и доводят объемы растворов используемым растворителем до метки. При этом значение регистрируемого сигнала растворов со стандартными добавками должно находиться в линейной области калибровочной кривой.

Рассчитывают параметры линейного уравнения прямолинейной зависимости среднего значения результата измерения от концентрации раствора методом наименьших квадратов и вычисляют концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

Расчет концентрации может быть произведен графическим методом. Для этого строят график зависимости среднего значения результата измерения от добавленного количества определяемого элемента. Экстраполируют линию, соединяющую эти точки на графике, до пересечения с осью абсцисс. Расстояние от начала координат до полученной точки пересечения дает концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

При использовании техники ввода твердых проб условия проведения анализа должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

При использовании АЭС и ААС для определения концентрации элемента в анализируемых образцах наряду с приведенными выше методами (калибровочной кривой и стандартных добавок) могут быть использованы метод сравнения и метод ограничивающих растворов или другие валидированные методы.

Реактивы и эталонные растворы. Вода должна быть деионизированной на ионообменных смолах, продистиллированной непосредственно перед употреблением и должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной.

Ниже приведены растворы солей, катионы которых обозначены названиями элементов, наиболее часто нормируемых в фармацевтическом анализе.

Кальций. 1,001 г кальция карбоната, высушенного до постоянной массы при температуре 105 град. C, растворяют в 25 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 400 мкг ионов Ca в 1 мл.

Срок годности раствора — 1 мес., хранение при комнатной температуре.

Калий. 1,1440 г калия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 130 град. C, растворяют в небольшом количестве воды и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 600 мкг ионов К в 1 мл.

Срок годности раствора — 2 мес., хранение при комнатной температуре.

Натрий. 0,5084 г натрия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 130 град. C, растворяют в небольшом количестве воды и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 200 мкг ионов Na в 1 мл.

Срок годности раствора 2 мес., хранение при комнатной температуре.

Цинк. 2,5 г гранулированного цинка растворяют в 20 мл 5 М раствора хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до 500,0 мл. Раствор содержит 5 мг ионов Zn в 1 мл.

Срок годности раствора — 2 мес., хранение при комнатной температуре.

Свинец. 0,1600 г свинца нитрата растворяют в 5 мл 32% раствора азотной кислоты и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл. Раствор содержит 100 мкг ионов Pb в 1 мл.

Срок годности раствора 1 мес., хранение при комнатной температуре.

Медь. 1,000 г меди электролитической растворяют в небольшом объеме 50% раствора азотной кислоты и доводят объем раствора 1% азотной кислотой до 1000,0 мл. Раствор содержит 1 мг ионов Cu в 1 мл.

Срок годности раствора — 1 мес., хранение при комнатной температуре.

Допускается использование других реактивов и эталонных растворов для спектрального анализа, аттестованных компетентным уполномоченным органом.

Эталонные, а также приготовленные на их основе растворы сравнения хранят в посуде, позволяющей сохранять концентрацию этих растворов неизменной (например, в посуде из кварца, тефлона, чистого полиэтилена и т.п.). Чашки и тигли для озоления проб должны быть изготовлены из кварца.

12.4. ФЛУОРИМЕТРИЯ (ОФС 42-0045-07)

Флуориметрия (или флуоресцентная спектрофотометрия) основана на измерении флуоресценции — интенсивности флуоресцентного света, излучаемого испытуемым образцом в возбужденном состоянии, которое было достигнуто поглощением лучевой энергии в результате воздействия ультрафиолетового, видимого или других видов электромагнитного излучения. Флуоресценция органических соединений охватывает спектральную область от 250 до 800 нм, т.е. области: УФ (частично), видимую и начало ближнего ИК.

Энергия молекул, поглотивших лучевую энергию и находящихся в возбужденном состоянии, может высвобождаться в виде тепла или излучения при той же или большей длине волны по сравнению с поглощаемым излучением. Поэтому свет, излучаемый флуоресцентным раствором, имеет максимум интенсивности, смещенный в более длинноволновую область по сравнению с возбуждающим излучением, обычно на 20-30 нм.

    Поскольку  поглощение  и  испускание излучения осуществляется благодаря
переходу  электронов  между  различными  уровнями энергии или молекулярными
орбитами,  между  поглощением  и  испусканием  света  имеется  задержка  во
времени.   Этот   интервал   (продолжительность   возбужденного  состояния)
                  -9      -8
составляет  от  10   до 10   с для большей части флуоресцирующих растворов.
Короткое  время  жизни  флуоресценции  отличает  этот  тип люминесценции от
фосфоресценции,  которая  представляет собой долгоживущее свечение, имеющее

             -3

время жизни от 10 с до нескольких мин.

Флуориметрия является более чувствительным методом анализа, чем абсорбционная спектрофотометрия, и позволяет определять флуоресцирующие вещества в растворах с концентрацией, которая составляет примерно от 1/10 до 1/100 от концентрации, используемой в абсорбционной спектрофотометрии.

Интенсивность флуоресценции обозначается символом I и представляет собой эмпирическое выражение флуоресцентной активности в условных единицах, пропорциональных отклику детектора.

Флуоресцентный спектр испускания представляет собой графическое изображение спектрального распределения излучения, испускаемого активированным веществом, в координатах: интенсивность испускаемого излучения — ордината, длина волны — абсцисса.

Флуоресцентный спектр возбуждения представляет собой графическое изображение спектра активации в координатах: интенсивность испускаемого излучения — ордината, длина волны активирующего излучения — абсцисса.

Приборы. Для проведения флуориметрического анализа используют приборы двух типов: фильтрационный флуориметр и спектрофлуориметр.

Фильтрационный флуориметр состоит из источника излучения, первичного фильтра, камеры для образца, вторичного фильтра и системы детектирования флуоресценции. У большей части таких приборов детектор помещен под углом 90 град. к возбуждающему лучу. Геометрия прямого угла позволяет возбуждающему излучению пройти через испытуемый образец, не «загрязняя» произведенный сигнал, передаваемый на детектор флуоресценции. Однако детектор все-таки получает возбуждающее излучение, искаженное в результате рассеивающих свойств самих растворов, а также из-за присутствия в растворе пыли или других твердых частиц. Для устранения этого остаточного рассеяния используются фильтры. Первичный фильтр отбирает коротковолновое излучение, способное к возбуждению испытуемых образцов, вторичный фильтр пропускает флуоресценцию в длинноволновой области, но блокирует рассеянное возбуждение.

Большинство флуориметров в качестве детекторов используют фотоумножители разных типов. Каждый тип детектора имеет специальные характеристики (спектральная область максимальной чувствительности, усиление, электрические шумы). Фототок усиливается и регистрируется измерительным прибором или самописцем.

Спектрофлуориметры отличаются от фильтрационных флуориметров тем, что вместо фильтров используются монохроматоры типа призмы или решетки. Для аналитических целей эти приборы более предпочтительны. В спектрофлуориметрах монохроматоры снабжены щелями. Узкая щель дает высокое разрешение и спектральную чистоту, широкая щель обеспечивает высокую чувствительность. Выбор размера щели определяется разделением между длинами волн возбуждения и испускания и необходимой чувствительностью.

Кюветы, используемые для измерения флуоресценции, представляют собой кюветы цилиндрической формы или прямоугольные кюветы, отполированные со всех четырех вертикальных сторон. Обычно объем испытуемых образцов составляет 2-3 мл, но к некоторым приборам прилагаются кюветы вместимостью от 100 до 300 мкл или капиллярные держатели для еще меньшего объема.

Измерение флуоресценции. Практически флуоресценцию определяют в -5

растворах  с  концентрацией  от  10   М и менее, когда между интенсивностью
флуоресценции    и   концентрацией   вещества   наблюдается   прямолинейная
зависимость.   При   более   высоких   концентрациях   значительная   часть
поступающего  света  абсорбируется  образцом  вблизи  поверхности кюветы, и
интенсивность  света,  достигающего  центра,  уменьшается. При этом образец

действует как «внутренний фильтр», в результате чего линейность нарушается.

Все замеры интенсивности флуоресценции должны быть скорректированы с растворителем.

Интенсивность флуоресценции в значительной степени зависит от длины волны возбуждающего света, величины pH испытуемого раствора, температуры, характера растворителей и присутствия в растворе посторонних частиц.

Твердые частицы, влияющие на флуоресценцию (могут поглощать некоторую долю возбуждающей энергии, дезактивировать возбужденные молекулы или завышать измеряемую величину из-за многократных отражений в кювете с образцом), удаляют центрифугированием или фильтрованием. В последнем случае следует учесть, что некоторые сорта фильтровальной бумаги содержат флуоресцирующие примеси.

Для некоторых веществ эффективность флуоресценции может снизиться на 1-2% при повышении температуры на градус. В таких случаях следует использовать термостатированные кюветы с контролируемой температурой. В рутинном анализе может оказаться достаточным сделать измерение быстро, чтобы не произошло нагревания образца от источника облучения.

Флуоресцентные вещества чувствительны к свету. При выдержке во флуориметре они могут подвергаться фотораспаду с образованием других флуоресцирующих продуктов. Такие эффекты обнаруживаются по отклику детектора в зависимости от времени и могут быть снижены применением фильтров или экрана после источника света.

Изменение растворителя может заметно повлиять на интенсивность и спектральное распределение флуоресценции. Многие соединения, флуоресцирующие в органических растворителях, фактически не флуоресцируют в воде, поэтому для того, чтобы решить, является вещество флуоресцентным или нет, надо исследовать его в различных растворителях.

Для многих органических растворителей интенсивность флуоресценции возрастает при удалении растворенного кислорода, являющегося сильным гасителем флуоресценции. Кислород может быть удален пропусканием инертного газа (азот или гелий) через испытуемый образец.

Идентификация. Характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для идентификации веществ.

Количественный анализ. При количественных определениях интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе.

Методика. Растворяют испытуемый образец в растворителе или в смеси растворителей, указанных в частной фармакопейной статье. Переносят раствор в кювету флуориметра и освещают лучом возбуждающего света с длиной волны, указанной в частной фармакопейной статье.

Вначале в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для растворения вещества, и устанавливают прибор на «ноль». Затем вводят стандартный раствор и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы замер был больше 50. Если повторное доведение чувствительности производится при изменении ширины щели, должна быть произведена переустановка «нуля» и интенсивность флуоресценции стандартного образца должна быть измерена вновь. Последним вводят раствор испытуемого образца неизвестной концентрации и замеряют показания прибора.

    Рассчитывают  концентрацию  вещества  в  испытуемом  растворе  (C )  по
формуле:                                                             x

                             I  x C
                              x    ст.
                       C  = -----------,
                        x      I

                            ст.

где:

C — концентрация вещества в стандартном растворе; ст.

I — интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором; x

I — интенсивность света, испускаемого стандартным раствором. ст.

Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой.

В некоторых случаях измерение может быть сделано относительно фиксированного стандарта (например, флуоресцентного стекла или раствора другого флуоресцентного вещества). В качестве стандартов могут быть использованы: раствор известной концентрации хинина в 0,05 М растворе серной кислоты или раствор флуоресцеина в 0,1 М растворе натрия гидроксида. В таких случаях концентрацию испытуемого образца следует определять с использованием предварительно полученной в тех же условиях калибровочной кривой.

12.5. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА (ОФС 42-0046-07)

Вещества, ядра атомов которых имеют магнитные моменты, в постоянном магнитном поле поглощают энергию электромагнитных волн (радиочастотный диапазон) при определенном соотношении между величинами постоянного магнитного поля и частотой переменного поля (ядерный магнитный резонанс, ЯМР). Частота ню0 = омега0/2пи, при которой выполняется условие резонанса омега0 = гамма x B0 (гамма — постоянная, носит название «гиромагнитное отношение») называется резонансной частотой.

Магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетным атомным весом (1H, 13C, 15N, 31P, 19F). Не имеют магнитных моментов ядра атомов с четным зарядом и четным атомным весом (12C, 16O).

Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: или при непрерывном облучении образца слабым электромагнитным полем с изменяющейся частотой, в результате чего получается непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса с последующим Фурье-преобразованием отклика, представляющего собой сигнал свободной индукции, в спектр (импульсная спектроскопия).

    В  молекулах  положение энергетических уровней, переходы между которыми
образуют   спектр  ЯМР,  определяется  величиной  взаимодействия  магнитных
моментов  ядер  с  постоянным магнитным полем B    и с магнитными моментами

                                           лок

других ядер через посредство электронов молекулы (спин-спиновое взаимодействие).

Электроны атомов уменьшают величину внешнего магнитного поля B0 в месте нахождения ядра: B = B0 x (1 — сигма), сигма > 0, константа лок

экранирования  -  безразмерная  величина.  Разница  в  резонансных частотах
сигналов,  равная  разнице  в  константах  экранирования  ядер,  называется
химическим  сдвигом  сигналов  (обозначается  символом дельта, измеряется в
миллионных  долях,  м.д.).  Спин-спиновое  взаимодействие,  характеризуемое
константой   спин-спинового   взаимодействия   (обозначается   символом  J,
измеряется  в герцах), приводит к образованию мультиплетов. Значения дельта
и  J  не  зависят  от  величины  постоянного  магнитного  поля.  Количество
компонент   в   мультиплетах   определяется   спином   ядра  и  количеством

взаимодействующих ядер.

Диапазон химических сдвигов сигналов ядер водорода не превосходит 20 м.д. Диапазон химических сдвигов сигналов других ядер измеряется сотнями м.д.

Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) веществ в растворах определяется временем поперечной релаксации T2, характеризующим время установления равновесия в системе спинов, а также неоднородностью магнитного поля. Определяемая этими величинами ширина сигналов ядер со спином 1/2 обычно не превосходит 1 Гц. Уширение сигналов происходит в результате обменных процессов или присутствием в молекуле ядер со спином большим 1/2.

    Интенсивность  сигнала  ЯМР  в спектре определяется избытком количества
ядер  на  нижнем  энергетическом  уровне. Отношение количества ядер N- и N+
соответственно  на  верхнем  и  нижнем  энергетических уровнях определяется

фактором Больцмана: N-/N+ = exp(-мю B0/IkT), где: k — постоянная Больцмана, n мю — магнитный момент ядра, T — абсолютная температура, I — спин ядра (при n этом (мю B0/I << kT). Очень небольшая разница в энергиях между возбужденным n

и  основным  состоянием ядер является основной причиной сравнительно низкой
чувствительности   метода  ЯМР.  Уменьшение  интенсивности  сигналов  также
связано   со  сравнительно  большим  временем  нахождения  системы  ядер  в
возбужденном   состоянии   и   большим   временем  релаксации  (постоянная,

характеризующая время релаксации обозначается символом T1).

Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. Частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода, называется рабочей частотой ЯМР спектрометра. Спектроскопия ЯМР на ядрах водорода и углерода 13C (естественное содержание 1,1%) наиболее часто используется в исследовании органических лекарственных веществ.

Широкополосные импульсные ЯМР-спектрометры позволяют получать спектры практически от всех элементов периодической системы.

Прибор. ЯМР-спектрометр для спектроскопии с непрерывным облучением состоит из магнита, генератора изменяющейся частоты, датчика, генератора радиочастоты и приемника, а также электронного интегратора и самопишущего потенциометра. Импульсные спектрометры, кроме того, имеют генератор импульсов и компьютер для преобразования интерферограммы отклика в спектр.

Рабочая частота спектрометра не должна быть меньше 60 МГц.

Если в частной фармакопейной статье не оговорено, то необходимо соблюдать следующие условия:

1. Разрешение должно быть 0,5 Гц или менее.

2. Амплитуда боковых сигналов, появляющихся при вращении образца, не должна превышать 2% от основного сигнала.

3. При количественных измерениях с использованием интегралов сигналов ни одно из пяти измерений не должно превосходить 2,5% от среднего значения.

4. Разрешение и отношение сигнал/шум следует измерять, используя соответствующие команды в пакете стандартных программ.

Метод. Растворенное вещество должно быть подписано и отфильтровано; раствор должен быть прозрачным. Перед регистрацией спектра фаза сигнала должна быть отрегулирована по возможности на поглощение.

Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах 1H и 13C измеряется относительно сигнала тетраметилсилана (ТМС), положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (дельта — шкала химических сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1H используется 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС), химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров 13C водных растворов в качестве эталона используют диоксан (ДО), химический сдвиг которого равен 67,4 м.д.

В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию.

Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов растворителей имеют следующие значения: хлороформ — 7,26; бензол — 7,16; вода — 4,7; метанол — 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид — 2,50; ацетон — 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры.

Для того чтобы избежать уширения сигналов при использовании смешанных растворителей, перед получением спектров необходимо выждать время для гомогенизации смеси растворителей, которое может составлять часы.

Для спектроскопии с непрерывным облучением амплитуда переменной частоты не должна быть большой, чтобы избежать насыщения сигнала. Наиболее интенсивный сигнал должен занимать почти всю ширину бланка. Кривая интеграла записывается поверх сигналов спектра.

В импульсных спектрометрах устанавливают следующие параметры: ширина спектра, время регистрации сигнала, длительность радиочастотного импульса, количество точек для Фурье-преобразования (спектральное разрешение) и количество накоплений сигнала свободной индукции.

Имеется ряд методик получения сигналов ЯМЕ, которые могут быть использованы при решении аналитических задач. В основе каждой из них используется определенная последовательность импульсов. Методики принято обозначать несколькими заглавными буквами латинского алфавита. Например, используемая часто методика COSY является сокращением словосочетания correlation spectroscopy. Обычные (одномерные) спектры получают воздействием на вещество одним радиочастотным импульсом, при завершении которого проводится считывание сигнала (свободная индукция) от ядер образца с последующим преобразованием сигнала свободной индукции в спектр (Фурье-преобразование).

Для слабых сигналов цикл возбуждение — считывание с накоплением сигнала повторяется многократно, чем достигается необходимое для анализа отношение сигнал/шум. Для количественных измерений цикл возбуждение — считывание повторяется через интервал времени, превышающим время релаксации T1 в несколько раз. Для измерения времени T1 следует использовать программу в пакете стандартных программ, прилагаемых к ЯМР-спектрометрам.

Наряду с одномерными в аналитических целях используются двумерные корреляционные спектры, получаемые методиками COSY (для ядер одного вида), HETCOR (для разных ядер) и др. В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов (перенос когерентности), называемых кросс-пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер.

Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросс-пиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах.

Для быстрого получения спектров гетероядер (13C, 15N и др.) применяются методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах 1H спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия.

Методика DOSY позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения. Методика основана на различии в скоростях диффузии различных молекул.

Области применения. Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для установления подлинности и количественных определений.

1. Установление подлинности вещества. В спектрах ЯМР практически исключается совпадение даже нескольких сигналов от разных веществ. При заявлении спектра на подлинность желательно ограничиваться по возможности меньшим количеством сигналов. При описании спектров необходимо приводить значения химических сдвигов и мультиплетность сигналов, заявленных на подлинность. Следует указывать рабочую частоту спектрометра, т.к. от нее зависит вид спектра. По этой же причине не использовать формулировку «...такой же вид, как и на приведенном (в НД) спектре».

Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) эффективна двумерная ЯМР-спектроскопия. При описании двумерных спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков.

2. Определение количества посторонних примесей. При получении спектров ЯМР, как правило, легко достигается значение отношения сигнал/шум более 100, что позволяет использовать этот метод для определения в субстанции примеси в количествах, измеряемых процентами и долями процента.

3. Определение количества остаточных растворителей. Все растворители, содержащие атомы водорода и углерода, дают характерные сигналы в спектрах 1H и 13C ЯМР. Чувствительность метода ЯМР к сигналам растворителя весьма высокая.

4. Количественное определение относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси). Содержание вещества (X%) определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов анализируемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов анализируемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу.

К испытуемому образцу добавляют вещество-стандарт, проводят измерение площадей сигналов анализируемого вещества и вещества-стандарта. Вычисляют процентное содержание анализируемого вещества в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество (X%) по формуле:

    X%     = 100 x (S'  /S'   ) x (M  x m  /M   x m ) x (100/(100 - W)),
      масс             a    ст      a    ст  ст    a

где:

    S' - приведенное   значение    интегральной    интенсивности   сигнала,
равное измеренной интегральной  интенсивности,   деленной  на   количество
протонов   в  структурном  фрагменте   (для  CH2  -   измеренная   площадь,

деленная на 2, для CH3 — деленная на 3 и т.д.);

M — молекулярная масса анализируемого вещества; a

M — молекулярная масса стандарта; ст

m — навеска испытуемого образца; a

m — навеска вещества-стандарта; ст

W — содержание влаги, в процентах.

В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).

При использовании в качестве стандартов веществ, молекулярная масса которых имеет небольшую величину, интервал времени между повторяющимися циклами импульсных последовательностей должен превосходить в несколько раз время релаксации T1 веществ-стандартов.

    Мольная  (X    ) и весовая (X    ) доля  компонента i в смеси n веществ
               моль              масс

определяется по формулам:

                      S'                             M  x S'
                        i             X               i     i
       X        = ------------         i, масс = -----------------
        i, моль    j = n                          j = n       S'
                   SUM    S'                      SUM    M  x   j
                   j = 1    j                     j = 1   j

    X       (%) = X     x 100    и     X       (%) = X      x 100.
     i, моль       моль                 i, масс       масс

13. ОСМОЛЯРНОСТЬ (ОФС 42-0047-07)

Осмолярность характеризует создаваемое растворами осмотическое давление и является одной из важнейших характеристик инфузионных растворов. Растворы, равные по осмолярности 0,9% раствору натрия хлорида, называют изотоническими. Для изотонических растворов теоретически рассчитанные значения осмолярности находятся в пределах 239-376 мОсм/л.

На этикетках растворов для инфузий должно быть указано теоретическое значение их осмолярности. В случае, когда теоретическая осмолярность не может быть рассчитана, указывают среднее значение экспериментально определенной осмолярности для данного лекарственного средства. Полученные данные носят информационный характер и не являются показателем качества лекарственного средства.

Осмолярность — это характеристика растворов, выражающая их осмотическое давление через суммарную концентрацию кинетически активных частиц в единице объема раствора.

Кинетически активные частицы — это молекулы, ионы или ионные комплексы одного или нескольких растворенных веществ, свободно распределенные во всем объеме растворителя и обладающие способностью к хаотическому перемещению внутри раствора.

Теоретическая осмолярность может быть рассчитана по формуле:

                                m

                         C     =  ----- x n x 1000,                      (1)
                          осм.      M

где:

C — осмолярность раствора, миллиосмоль на литр (мОсм/л); осм.

m — содержание вещества в растворе, г/л;

M — молярная масса вещества;

n — суммарное число ионов, образующихся из одной молекулы растворенного

вещества в результате диссоциации (n = 1 для недиссоциирующих  веществ;
    n = 2, 3  для  веществ,  образующих  при   растворении  соответствующее

количество ионов).

На практике количество частиц (n) несколько меньше теоретически рассчитанного и приближенно может быть описано формулой:

n = n x фи, (2) o

где:

n — реальное количество частиц, образующихся при растворении данного вещества;

n — теоретически рассчитанное количество частиц (п = 1, 2, 3...); o

    фи  - молярный  осмотический  коэффициент,  учитывающий  взаимодействие
Между   частицами   в   растворе   и   зависящий   только   от   количества

растворенного вещества.

Коэффициент фи определяется экспериментально. Для многокомпонентных растворов его определение крайне затруднительно.

Осмолярность растворов, состоящих из нескольких компонентов, может быть определена как сумма осмолярностей всех компонентов.

Существующие инструментальные методы позволяют определить не осмолярность, а осмоляльность — концентрацию кинетически активных частиц на килограмм растворителя (мОсм/кг).

В отечественной практике принято выражать концентрацию инфузионных растворов как массо-объемную (в г/л), поэтому удобным представляется контролировать содержание кинетически активных частиц в миллиосмолях на литр (осмолярность), а не на килограмм (осмоляльность) раствора.

Различиями между значениями осмолярности и осмоляльности растворов с осмолярностью, близкой к осмолярности 0,7-1,1% раствора натрия хлорида или ниже, можно пренебречь (теоретическое значение осмотического давления 0,9% раствора натрия хлорида — 308 мОсм/л; экспериментальное значение -286 мОсм/л); для более концентрированных растворов (например, 10% раствора натрия хлорида) осмолярность может быть определена по формуле:

c(мОсм/л) = C(мОсм/кг) x ро, (3)

где ро — плотность раствора, кг/л.

Примечания

1. Расчет теоретических границ осмолярности проводится следующим образом: минимальное значение — осмолярность раствора, содержащего минимально допустимые по НД количества ингредиентов; максимальное значение — осмолярность раствора, содержащего максимально допустимые количества ингредиентов.

2. При наличии в растворе высокомолекулярного вещества за его молярную массу берется средняя молекулярная масса фракции.

3. Гидрокарбонаты при расчете осмолярности учитываются как соли одноосновной кислоты.

Для практического определения осмолярности могут быть использованы три метода: криоскопический, мембранная и паровая осмометрия.

1 осмоль на килограмм воды понижает точку замерзания на 1,86 град. C и понижает давление пара на 0,3 мм рт. ст. при температуре 25 град. C. Измерение этих изменений лежит в основе криоскопического метода и метода паровой осмометрии.

Метод основан на понижении точки замерзания растворов по сравнению с точкой замерзания чистого растворителя. Данный метод нашел самое широкое практическое применение как достаточно универсальный и точный.

1. Определение осмолярности с использованием термометра Бекмана. Определение температуры замерзания проводят на установке, изображенной на рис. 13.1. (не приводится). Установка состоит из сосуда А диаметром 30-35 мм и длиной около 200 мм, куда помещается испытуемый раствор (или растворитель); верхняя часть сосуда расширена и закрывается пробкой с двумя отверстиями для погружения термометра Б и мешалки В; сосуд А вставлен в более широкую емкость (Г) так, что не касается ее стенок или дна; термометр также не должен касаться стенок или дна сосуда А; уровень охлаждающей смеси в емкости Г должен быть не ниже уровня испытуемого раствора в сосуде А. При проведении эксперимента раствор (или растворитель) должен прикрывать основной ртутный резервуар термометра. Температура охлаждающей смеси должна быть на 3-5 град. C ниже температуры замерзания растворителя (для бидистиллированной воды: от минус 3 до минус 5 град. C); контроль минусовой температуры осуществляется минусовым термометром Д с ценой деления 0,5 град. C. Состав охладительной смеси: лед + натрия хлорид кристаллический. Установку термометра Бекмана на криометрические исследования производят путем подбора количества ртути в основном резервуаре так, чтобы при замерзании чистого растворителя (бидистиллированной воды) мениск ртути в капилляре находился у верхней части шкалы измерения. При этом возможна регистрация ожидаемого понижения температуры замерзания водного раствора.

Методика. Для определения температуры замерзания чистого растворителя пользуются следующим приемом: дают жидкости переохладиться (охлаждают без перемешивания), и когда термометр показывает температуру на 0,2-0,3 град. C ниже ожидаемой точки замерзания, перемешиванием вызывают выпадение кристаллов растворителя; при этом жидкость нагревается до точки замерзания. Максимальную температуру (средний результат трех измерений, отличающихся не более чем на 0,01 град. C), которую показывает термометр после начала выпадения кристаллов, регистрируют как температуру замерзания растворителя (T1).

В высушенный сосуд А наливают достаточное количество испытуемого водного раствора; определение точки замерзания проводят, как описано выше для чистого растворителя; средний результат трех опытов регистрируют как температуру замерзания испытуемого раствора лекарственного вещества (T2).

Осмолярность раствора рассчитывают по формуле:

                        (T2 - T1)

                    C     = --------- x 1000 (мОсм/кг),                 (4)
                     осм.       K

где: T2 — температура замерзания чистого растворителя, градусы Цельсия;

T1 — температура замерзания испытуемого раствора, градусы Цельсия (град. C);

K — криометрическая постоянная растворителя (для воды: 1,86).

2. Определение осмолярности растворов с использованием автоматического криоскопического осмометра. Данный вариант предусматривает применение автоматических осмометров, например, МТ-2, МТ-4 (производитель НПП «Буревестник», Санкт-Петербург). Испытуемый раствор (обычно 0,2 мл) помещают в стеклянный сосуд, погруженный в ванну с контролируемой температурой. Термопару и вибратор помещают под испытуемым раствором; температуру в ванной снижают до переохлаждения раствора. Включают вибратор и вызывают кристаллизацию воды в испытуемом растворе; выделившееся тепло поднимает температуру раствора до точки замерзания. По зафиксированной точке замерзания раствора рассчитывают осмолярность. Прибор калибруют с помощью стандартных растворов натрия или калия хлорида, которые перекрывают определяемый диапазон осмолярности (табл. 13.1).

Метод основан на использовании свойств полупроницаемых мембран избирательно пропускать молекулы веществ.

Движущей силой процесса является процесс осмоса. Растворитель проникает в испытуемый раствор до установления равновесия; возникающее при этом дополнительное гидростатическое давление приближенно равно осмотическому давлению и может быть рассчитано по формуле:

                Пи     ~= P      = ро x g x дельта h,                   (5)
                  осм.     гидр.

где:

пи — осмотическое давление; осм.

P — гидростатическое давление; гидр.

ро — плотность жидкости;

g — ускорение свободного падения;

дельта h — высота столба жидкости.

Осмолярность может быть рассчитана по формуле:

                     C     = пи     /R x T,                             (6)
                      осм.     осм.

где: R — универсальная газовая постоянная (8,314 Дж/мольK);

T — абсолютная температура, Кельвин.

    Примечание.    Данный    метод    применим    только    для   растворов
                                  4    6
высокомолекулярных   веществ   (10 - 10  г/моль).  При  анализе  растворов,
содержащих   электролиты   и   другие   низкомолекулярные  вещества,  будет
определяться  только осмотическое давление, создаваемое высокомолекулярными

компонентами раствора.

Методика. Испытуемый раствор с помощью шприца (рис. 13.2 — не приводится) с длинной иглой вносят в специальное отверстие измерительной ячейки. Калибровку проводят с помощью устройства, находящегося в приборе. Проводят не менее трех измерений. Для получения воспроизводимых результатов необходима проба объемом не менее 1,2 мл.

Метод основан на измерении разности температур термисторами (чувствительными к температуре сопротивлениями) вследствие различия между давлением пара над раствором вещества и чистым растворителем. При нанесении на оба термистора капли растворителя разность температур равна нулю. Если одну из капель заменяют каплей испытуемого раствора, то на поверхности этого термистора происходит конденсация паров растворителя, так как давление пара растворителя над этой поверхностью меньше. При этом температура капли раствора повышается за счет экзотермического процесса конденсации до тех пор, пока давление пара над каплей раствора и давление чистого растворителя в ячейке не сравняются. Наблюдаемая разница температур измеряется. Разность температур практически пропорциональна моляльной концентрации раствора.

Методика. В предварительно термостатированную при температуре не ниже 25 град. C и насыщенную парами растворителя (воды) ячейку на оба термистора наносят по капле воды (рис. 13.3 — не приводится).

Полученные показания прибора фиксируют. Далее проводят калибровку прибора по эталонным растворам нескольких концентраций. Перед каждым измерением один из термисторов промывают чистым растворителем и наносят каплю раствора. Объемы наносимых капель раствора и чистого растворителя должны быть одинаковы; объемы капель калибровочных растворов также должны быть равны.

По результатам калибровки строится график зависимости разницы температур от осмоляльности. Нулевая точка — показания прибора по чистому растворителю. Далее проводят анализ испытуемых растворов. Осмоляльность находят по калибровочному графику.

14. ИОНОМЕТРИЯ (ОФС 42-0048-07)

Метод ионометрии основан на определении активности (концентрации) определяемых ионов с помощью ионоселективных электродов (ИСЭ). Ионоселективный электрод обладает избирательной чувствительностью к определенным ионам, от содержания которых зависит его потенциал. В основу определения положен принцип потенциометрического анализа, заключающийся в измерении разности потенциалов (электродвижущей силы — ЭДС) измерительного (ионоселективного) электрода и электрода сравнения, потенциал которого постоянен.

Зависимость электродвижущей силы электродной системы от активности потенциалопределяющего иона описывается уравнением Нернста:

                           R x T

               E = E  + 2,303 ------- lg a,                             (1)
                    0           Z x F

где:

E — разность потенциалов между измерительным и вспомогательным электродами (ЭДС), мВ;

E — значение ЭДС электродной системы в начальной точке диапазона 0 измерений (стандартное значение ЭДС), мВ;

R — газовая постоянная;

T — абсолютная температура;

F — число Фарадея;

z — заряд определяемого иона;

a — активность или эффективная концентрация свободных ионов в растворе, связанная с концентрацией соотношением:

a = f x C, (2)

где: C — молярная концентрация;

f — коэффициент активности.

Для очень разбавленных растворов коэффициент активности близок к единице и активность ионов равна концентрации.

Если коэффициент активности поддерживается постоянным, уравнение Нернста принимает вид:

                                  k

                            E = E  + --- x lg f x C,                    (3)
                                 0    z

        R x T

где k = ------- — температурный коэффициент. F

Температурный коэффициент k при любой температуре может быть рассчитан по формуле:

k = 0,05916 + 0,000198 x (t — 25 град. C) (4)

и приведен в табл. 14.1.

Таблица 14.1

Значения k при различных температурах

Коэффициент активности (f) считается постоянным, если при измерениях во всех анализируемых и калибровочных растворах поддерживается одинаковая ионная сила. Для создания высокой ионной силы к раствору добавляют раствор индифферентного электролита (фоновый раствор) с тем, чтобы различные количества анализируемого иона не влияли на ионную силу раствора и коэффициент активности определяемого иона оставался постоянным.

                              k                          k
                Если E = E  + -- x lg f = E '   и    S = ---,
                          0   Z            0              z

где S — крутизна электродной функции, то

                       E = E ' + S lgC = E '- S x pC,                   (5)
                            0             0

где pC = -lgC.

Таким образом, при постоянной ионной силе раствора и постоянной температуре наблюдается линейная зависимость ЭДС электродной системы от концентрации определяемого иона.

ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ И КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ

Ионометрические измерения осуществляют с использованием иономера (высокоомного потенциометра с входным сопротивлением, по крайней мере, в 100 раз большим, чем сопротивление используемых электродов), который включает в себя электродную систему и измерительный преобразователь.

В качестве ионселективных электродов могут использоваться электроды с кристаллической или некристаллической мембраной или с твердой матрицей (например, стеклянные электроды), электроды с заряженными (положительно или отрицательно) или незаряженными подвижными носителями, сенсибилизированные электроды (электроды с ферментативной подложкой, газ-индикаторные электроды). Электродом сравнения служит, главным образом, хлорсеребряный электрод или каломельный электрод с соответствующими индифферентными соединительными жидкостями.

Прибор градуирован в милливольтах или в единицах pX. Подготовка иономера к работе и проведение измерений производятся согласно инструкциям, прилагаемым к прибору. Измерения выполняют при постоянной температуре +/- 0,5 град. C и постоянной ионной силе раствора. Помещают электроды в испытуемый раствор и снимают установившееся показание при медленном и постоянном перемешивании.

При частых измерениях периодически проверяют стабильность отклика и линейность калибровочной кривой в диапазоне концентраций испытуемого раствора. В противном случае проверку проводят перед каждыми измерениями.

1. Метод градуировочного графика

Метод градуировочного графика заключается в построении графика зависимости ЭДС электродной системы от концентрации стандартных растворов с известной концентрацией и последующем нахождении концентрации испытуемого раствора по измеренному в нем значению ЭДС электродной системы. Градуировочный (калибровочный) график строится микропроцессором измерительного преобразователя автоматически на основе введенных в него значений ЭДС электродной системы и соответствующих им значений pX при калибровке иономера в стандартных растворах (двух и более). Подбор концентраций стандартных растворов должен соответствовать диапазону концентраций испытуемых растворов: крайние значения концентраций испытуемых растворов должны находиться внутри линейной области калибровочного графика. Значение pX в испытуемом растворе находится автоматически с использованием градуировочного графика по измеренному значению ЭДС электродной системы (E) — рис. 14.1. (не приводится).

потенциалопределяющего иона

Рисунок не приводится.

Поскольку в разбавленных растворах pX = -lgC, значение молярной концентрации (моль/л) вычисляют по уравнению:

                                    -pX
                              C = 10   .                            (6)

Значение массовой концентрации иона (г/л) рассчитывают, исходя из уравнения:

                                     -pX
                           C = M x 10   ,                           (7)

где M — молярная масса иона, г/моль.

При наличии влияния других компонентов испытуемого раствора на потенциал ионоселективного электрода используют метод стандартных добавок.

2. Метод стандартных добавок

Метод применим в линейных областях калибровочной кривой.

2.1 Метод многократных добавок

    В  испытуемый   раствор,   приготовленный,   как   указано   в  частной
фармакопейной  статье,  вводят  несколько  (по  крайней  мере  три)  порций
объемом V    раствора  с  известной  концентрацией   определяемого    иона,

     ст.

соблюдая условие неизменной ионной силы в растворе. Измеряют  потенциал  до
и  после  каждой  добавки и вычисляют разность  дельта Е  между  измеренным

потенциалом и потенциалом испытуемого раствора. Полученная величина связана с концентрацией определяемого иона уравнением:

                                             C    x V
                                              ст.    ст.
                      дельта E = S x lg (l + -------------),            (8)

                                          C x V

или

                    дельта E

                        -------        C    x V
                           S            ст.    ст.
                      10        = 1 + -------------,                    (9)

                                      C x V

где:

V — объем испытуемого раствора;

C — молярная концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

V — добавленный объем стандартного раствора; ст.

C — концентрация определяемого иона в стандартном растворе; ст.

    S - крутизна  электродной  функции, определяемая  экспериментально  при
постоянной  температуре  измерением  разности  потенциалов двух стандартных
растворов,  концентрации  которых  отличаются  в  10  раз  и  соответствуют

линейной области калибровочной кривой.

                               дельта E
                               --------
                                  S

Строят график зависимости 10 от объема добавки V и ст. экстраполируют полученную прямую до пересечения с осью X. В точке пересечения концентрация испытуемого раствора определяемого иона выражается уравнением:

                                  C    x V
                                   ст.    ст.                          (10)

C = ------------, V

2.2 Метод однократной добавки

К объему V испытуемого раствора, приготовленного, как описано в частной фармакопейной статье, прибавляют объем V стандартного раствора известной ст. концентрации C Готовят холостой раствор в тех же условиях. Измеряют ст.

потенциалы  испытуемого раствора и холостого раствора до и после добавления
стандартного   раствора.  Вычисляют  концентрацию  C  анализируемого  иона,
используя  следующее  уравнение  и  делая  необходимые поправки на холостой

раствор:

                             C    x V
                              ст.    ст.
                     C = ---------------------------,                  (11)

                       дельта E
                       --------
                          S
                     10        x (V + V   ) - V
                                       ст.

где:

V — объем испытуемого или холостого раствора;

C — концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

V — добавленный объем стандартного раствора; ст.

C — концентрация определяемого иона в стандартном растворе; ст.

дельта E — разность потенциалов, измеренных до и после добавки;

    S - крутизна   электродной   функции,   определяемая   экспериментально
при   постоянной   температуре     измерением   разности  потенциалов  двух
стандартных  растворов,  концентрации   которых  отличаются   в  10  раз  и

соответствуют линейной области калибровочной кривой.

3. Потенциометрическое определение pH

Водородным показателем pH, характеризующим концентрацию ионов водорода в водных растворах, называется отрицательный десятичный логарифм активности ионов водорода

pH = -lg a + (12) H

Потенциометрическое определение pH заключается в измерении ЭДС электродной системы, где в качестве ионоселективного электрода используют чувствительный к ионам водорода электрод (обычно стеклянный), в качестве электрода сравнения — стандартный электрод с известной величиной потенциала (насыщенный каломельный или хлорсеребряный электроды). На практике для измерения pH применяют метод градуировочного графика. pH испытуемого раствора связан с pH стандартного раствора следующим уравнением:

                                  E - E
                                       s

pH = pHs — -------, (13) k

где:

E — потенциал электрода в испытуемом растворе;

    E - потенциал  того же электрода в растворе с  известным  значением  pH
     s    (стандартном растворе).

Прибор. В качестве прибора для потенциометрического определения pH используют иономеры или pH-метры с чувствительностью не менее 0,05 единиц pH или 3 мВ. Калибровка приборов производится по стандартным буферным растворам, приведенным в общей фармакопейной статье «Буферные растворы».

Методика. Все измерения проводят при одной и той же температуре в интервале от 20 до 25 град. C, если нет других указаний в частной статье. В табл. 14.2 приведена зависимость значений pH от температуры для различных стандартных буферных растворов, используемых для калибровки прибора. Для приготовления указанных растворов могут быть использованы фиксаналы по ГОСТ.

Таблица 14.2

различных температурах

<*> Изменение pH на градус Цельсия.

Если необходимо, учитывают температурные поправки в соответствии с инструкцией предприятия-производителя. Прибор калибруют при помощи буферного раствора калия гидрофталата (первичный стандарт) и одного из буферных растворов с другим значением pH (предпочтительно одного из приведенных в табл. 14.2). Показания прибора для третьего буферного раствора с промежуточным значением pH не должны отличаться больше чем на 0,05 единиц pH от табличного значения pH этого раствора. Электроды погружают в испытуемый раствор и измеряют pH в тех же условиях, что и для буферных растворов.

Все испытуемые растворы и стандартные буферные растворы должны быть приготовлены на воде, свободной от диоксида углерода, для чего ее необходимо прокипятить перед употреблением. Вода, свободная от диоксида углерода, должна иметь pH 5,8-7,0.

Приготовление стандартных буферных растворов

0,05 М раствор калия тетраоксалата. 12,61 г KC4H3O8 x 2H2O растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

Насыщенный при 25 град. C раствор калия гидротартрата. Избыток КС4Н5O6 энергично встряхивают с водой при температуре 25 град. C. Фильтруют или декантируют. Раствор используют свежеприготовленным.

0,05 М раствор калия дигидроцитрата. 11,41 г KC6H7O7 растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл. Раствор используют свежеприготовленным.

0,05 М раствор калия гидрофталата. 10,13 г KC8H5O4, предварительно высушенного при температуре от 110 до 135 град. C до постоянной массы, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,025 М раствор калия дигидрофосфата и 0,025 М раствор натрия гидрофосфата. 3,39 г KH2PO4 и 3,53 г Na2HPO4, предварительно высушенных в течение двух часов при температуре от 110 до 130 град. C до постоянной массы, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,0087 М раствор калия дигидрофосфата и 0,0303 М раствор натрия гидрофосфата. 1,18 г KH2PO4 и 4,30 г Na2HPO4, предварительно высушенных при температуре от 110 до 130 град. C, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,01 М раствор натрия тетрабората. 3,80 г Na2B4O7 x 10H2O растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл. Хранят, защищая от диоксида углерода.

0,025 М раствор натрия карбоната и 0,025 М раствор натрия гидрокарбоната. 2,64 г Na2CO3 и 2,09 г NaHCO3 растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

При измерении pH в неводных и смешанных растворителях, а также в некоторых коллоидных системах, следует иметь в виду, что полученные значения pH являются условными.

В табл. 14.3 приведены термины, используемые для характеристики реакции растворов в зависимости от pH, и цвет раствора при использовании некоторых наиболее распространенных индикаторов.

Таблица 14.3

Реакция раствора, значение pH и цвет индикатора

15. РАСТВОРИМОСТЬ (ОФС 42-0049-07)

В фармакопейном анализе понятие растворимости приводится в качестве характеристики приблизительной растворимости лекарственного вещества при температуре от 15 до 25 град. C. Испытание следует проводить при фиксированном значении температуры, обычно 20 +/- 2 град. C, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Если растворимость является показателем чистоты субстанции (что должно быть указано в частной фармакопейной статье), то в разделе следует представлять конкретные количественные соотношения субстанции и растворителей.

Рекомендуется использовать растворители разной полярности (обычно три); не рекомендуется использование легкокипящих и легковоспламеняющихся (например, диэтиловый эфир) или очень токсичных (например, бензол, метилен-хлорид) растворителей.

В фармакопее растворимость вещества выражают в следующих терминах (в пересчете на 1 г):

Таблица 15.1

Субстанцию считают растворившейся, если в растворе при наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества. В растворе могут содержаться следовые количества физических примесей, таких как волокна фильтровальной бумаги и других. Для субстанций, образующих при растворении мутные растворы, соответствующее указание должно быть приведено в частной фармакопейной статье.

Термин "смешивается с..." используется для характеристики жидкостей, смешивающихся с указанным растворителем во всех соотношениях.

Если указано, что субстанция растворима в жирных маслах, то имеется в виду, что она растворима в любом масле, относящемся к классу жирных масел.

Методика определения растворимости. К навеске растертой в тонкий порошок субстанции прибавляют отмеренное количество растворителя и непрерывно встряхивают в течение 10 мин. при 20 +/- 2 град. C.

Для медленно растворимых препаратов, требующих для своего растворения более 10 мин., допускается нагревание на водяной бане до 30 град. C. Наблюдение производят после охлаждения раствора до комнатной температуры и энергичного встряхивания в течение 1-2 мин.

Условия растворения медленно растворимых препаратов указывают в частных фармакопейных статьях.

Для субстанций с неизвестной растворимостью испытание проводят по следующей методике.

К 1,00 г растертой субстанции прибавляют 1,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она очень легко растворима.

Если субстанция растворилась неполностью, к 100 мг растертой субстанции прибавляют 1,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она легко растворима.

Если субстанция растворилась неполностью, добавляют 2,0 мл растворителя и продолжают растворение. Если субстанция полностью растворилась, она растворима.

Если субстанция растворилась неполностью, добавляют 7,0 мл растворителя и продолжают растворение. Если субстанция полностью растворилась, она умеренно растворима.

Если субстанция растворилась неполностью, к 10 мг растертой субстанции прибавляют 10,0 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она мало растворима.

Если субстанция растворилась неполностью, к 10 мг растертой субстанции прибавляют 100 мл растворителя и проводят растворение, как описано выше. Если субстанция полностью растворилась, она очень мало растворима.

Если субстанция не растворилась, она практически нерастворима в данном растворителе.

Для субстанций с известной растворимостью испытание проводят по описанной выше методике, но только для крайних значений, относящихся к указанному термину. Например, если субстанция растворима, то 100 мг растертой субстанции не должны растворяться в 1,0 мл растворителя, но должны раствориться полностью в 3,0 мл растворителя.

16. СТЕПЕНЬ ОКРАСКИ ЖИДКОСТЕЙ (ОФС 42-0050-07)

Окраску жидкостей определяют визуально одним из методов, приведенных ниже, путем сравнения с соответствующими эталонами. В статью включены методы контроля качества лекарственных средств по показателям "цветность" и "цветность раствора". Цветность является условно принятой количественной характеристикой для жидкостей, имеющих незначительную окраску.

Цвет - это восприятие или субъективная реакция наблюдателя на объективный раздражитель в виде энергии, излучаемой в видимой части спектра и охватывающей диапазон длин волн от 400 до 700 нм. Окраска двух растворов совпадает (при определенном источнике света), если их спектры поглощения и отражения идентичны и наблюдатель не замечает разницы между ними.

Ахроматизм или отсутствие окраски означает отсутствие у испытуемого раствора абсорбции в видимой области спектра.

Для визуальной оценки окраски жидкостей в зависимости от интенсивности в области коричневых, желтых и красных цветов используют один из двух методов, описанных в статье. Бесцветными считаются жидкости, если их окраска не отличается от воды (в случае растворов - от соответствующего растворителя) или выдерживают сравнение с эталоном B9, т.е. должны быть окрашены не более интенсивно, чем эталон B9.

Метод 1

Испытания проводят в одинаковых пробирках из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с внутренним диаметром около 12 мм, используя равные объемы - 2,0 мл испытуемой жидкости и воды, или растворителя, или эталона сравнения, описанного в статье. Сравнивают окраску в дневном отраженном свете, горизонтально (перпендикулярно оси пробирок) на матово-белом фоне (эталоны 1-3).

Метод 2

Испытания проводят в одинаковых пробирках из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с внутренним диаметром от 15 до 25 мм, используя равные слои высотой 40 мм испытуемой жидкости и воды, или растворителя, или эталона сравнения, описанного в статье. Сравнивают окраску в дневном отраженном свете сверху вдоль вертикальной оси пробирок на матово-белом фоне (эталоны 4-9).

Приготовление исходных растворов

Желтый раствор. 46 г (точная навеска) железа(III) хлорида (FeCl3 x 6 H2O; М.м. 270,30) растворяют в 900 мл смеси, приготовленной из 25 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и 975 мл воды, в мерной колбе вместимостью 1000 мл, перемешивают и доводят объем раствора в колбе этой же смесью до метки. Определяют количественное содержание железа хлорида в 1 мл раствора. Объем раствора железа хлорида разбавляют этой же смесью таким образом, чтобы содержание железа хлорида в 1 мл составляло 45,0 мг.

Раствор хранят в защищенном от света месте.

Количественное определение: 10,0 мл раствора железа хлорида помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 15 мл воды, 5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и 4 г калия йодида, перемешивают, закрывают пробкой и оставляют на 15 мин. в темном месте, затем прибавляют 100 мл воды. Титруют выделившийся йод раствором 0,1 М натрия тиосульфата, прибавляя 0,5 мл раствора крахмала в конце титрования в качестве индикатора.

1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 27,03 мг железа(III) хлорида (FeCl3 x 6 H2O).

Красный раствор. 60 г (точная навеска) растертого кобальта(II) хлорида (CoCl2 x 6 H2O; М.м. 237,93) растворяют в 900 мл смеси, приготовленной из 25 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и 975 мл воды, в мерной колбе вместимостью 1000 мл и доводят объем раствора в колбе этой же смесью до метки. Определяют количественное содержание кобальта хлорида в 1 мл раствора. Объем раствора кобальта хлорида разбавляют этой же смесью таким образом, чтобы содержание кобальта хлорида в 1 мл раствора составляло 59,5 мг.

Количественное определение. 5,0 мл раствора кобальта хлорида помещают в коническую колбу с притертой стеклянной пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 5 мл 3% раствора перекиси водорода и 30 мл 10% раствора натрия гидроксида. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин., затем охлаждают до комнатной температуры и прибавляют 60 мл 1 М раствора серной кислоты и 2 г калия йодида. Закрывают колбу и растворяют осадок, осторожно помешивая. Выделившийся йод титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата до бледно-розового окрашивания, используя в качестве индикатора 0,5 мл раствора крахмала в конце титрования.

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 23,79 мг кобальта (II) хлорида (CoCl2 x 6 H2O).

Голубой раствор. 63 г (точная навеска) меди(II) сульфата (CuSO4 x 5 H2O; М.м. 249,68) растворяют в 900 мл смеси, приготовленной из 25 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и 975 мл воды, в мерной колбе вместимостью 1000 мл и доводят объем раствора в колбе этой же смесью до метки. Определяют количественное содержание меди сульфата в 1 мл раствора. Объем раствора меди сульфата разбавляют этой же смесью таким образом, чтобы содержание меди сульфата в 1 мл раствора составляло 62,4 мг.

Количественное определение. 10,0 мл раствора меди сульфата помещают в коническую колбу с притертой стеклянной пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл воды, 12 мл 2 М раствора уксусной кислоты и 3 г калия йодида. Смесь перемешивают и выделившийся йод титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата до бледно-коричневого окрашивания, используя 0,5 мл раствора крахмала в качестве индикатора в конце титрования.

1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 24,97 мг меди(II) сульфата (CuSO4 x 5 H2O).

Приготовленные исходные и стандартные растворы помещают в сухие склянки с притертыми пробками и хранят при температуре (20 +/- 3) град. C в защищенном от попадания прямых солнечных лучей месте.

Срок годности исходных и стандартных растворов - 1 год.

При хранении исходных и стандартных растворов следует перед употреблением убедиться в отсутствии в них мути, осадка и хлопьев. При наличии таковых растворы заменяют свежеприготовленными.

Приготовление стандартных растворов

Стандартные растворы, получаемые смешением исходных растворов железа хлорида, кобальта хлорида и меди сульфата с 1% раствором хлористоводородной кислоты, представлены в табл. 16.1.

Таблица 16.1

Стандартные растворы

Приготовление эталонов

Эталоны готовят из пяти стандартных растворов путем разбавления их 1% раствором хлористоводородной кислоты.

Отмеривание исходных и стандартных растворов для приготовления шкал производят при помощи калиброванной пипетки или бюретки с точностью до 0,02 мл.

Эталоны для определения степени окраски жидкостей по методу I хранят в ампулах из бесцветного прозрачного нейтрального стекла с наружным диаметром 12 мм, в защищенном от света месте в течение 1 года.

Эталоны, используемые для определения степени окраски жидкостей по методу II, готовят из соответствующих стандартных растворов непосредственно перед использованием.

Количества компонентов для приготовления эталонов цветности приведены в табл. 16.2-16.6.

Таблица 16.2

Эталоны коричневых оттенков (шкала B)

Таблица 16.3

Эталоны коричневато-желтых оттенков (шкала BY)

Таблица 16.4

Эталоны желтых оттенков (шкала Y)

Таблица 16.5

Эталоны зеленовато-желтых оттенков (шкала GY)

Таблица 16.6

Эталоны красных оттенков (шкала R)

Сравнение степени окраски жидкости с эталонами (B, BY, Y, GY, R) обычно проводят по методу I; в случае использования эталонов B4-9, (BY, Y, GY, R)4-7 применяют метод II.

Степень окраски испытуемого раствора не должна превышать степень окраски соответствующего эталона. Цвет испытуемого образца должен быть максимально приближен к цвету соответствующего эталона.

При сравнении окраски испытуемого раствора с эталонами указывают, кроме номера эталона, букву шкалы. Например, окраска раствора не должна превышать эталон B7.

При необходимости могут быть использованы другие эталоны, приготовленные путем смешения стандартных растворов разных цветовых шкал с точным указанием их объемов для достижения нужной окраски, приближенной к окраске испытуемого раствора, если это предусмотрено частной статьей.

Для оценки окраски жидкостей возможно использование спектрофотометрического метода, при этом должны быть указаны: длина волны, при которой наблюдается максимум поглощения в видимой области спектра, толщина кюветы и значение оптической плотности с допустимыми отклонениями, если это предусмотрено частной фармакопейной статьей.

17. ПРОЗРАЧНОСТЬ И СТЕПЕНЬ МУТНОСТИ ЖИДКОСТЕЙ (ОФС 42-0051-07)

Прозрачность и степень мутности жидкостей определяют путем сравнения испытуемой жидкости с растворителем или эталонами визуально или инструментальным методом.

Испытание проводят в пробирках с притертой пробкой из прозрачного бесцветного стекла с внутренним диаметром около 15 мм. Для сравнения берут равные объемы эталона и испытуемой жидкости (5 или 10 мл). Испытание проводят при освещении электрической лампой матового стекла мощностью 40 Вт, расположенной над образцом, просматривая растворы перпендикулярно вертикальной оси пробирок на черном фоне через 5 мин. после приготовления эталона.

Испытуемую жидкость считают прозрачной, если она по прозрачности не отличается от воды или растворителя, используемого при приготовлении испытуемой жидкости, или выдерживает сравнение с эталоном I, т.е. ее опалесценция (мутность) не превышает опалесценцию (мутность) эталона I при просмотре в описанных выше условиях.

Эталонами служат взвеси из гидразина сульфата и гексаметилентетрамина.

Приготовление раствора гидразина сульфата. 0,50 г гидразина сульфата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор выдерживают в течение 4-6 ч.

Приготовление раствора гексаметилентетрамина. 3,00 г гексаметилентетрамина растворяют в 30,0 мл воды.

Приготовление исходного эталона. К 25,0 мл раствора гидразина сульфата прибавляют 25,0 мл раствора гексаметилентетрамина, перемешивают и оставляют на 24 ч.

Исходный эталон стабилен в течение 2 мес. при хранении в стеклянной посуде, не имеющей дефектов поверхности (взвесь не должна прилипать к стеклу), с притертой пробкой.

Приготовление основного эталона. 15,0 мл исходного эталона помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.

Срок годности основного эталона - 24 ч.

Приготовление эталонов сравнения. Отмеренное количество основного эталона, указанное в приведенной ниже таблице, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.

Таблица 17.1

Состав эталонов сравнения

Примечание. Перед применением исходный, основной и эталоны сравнения перемешивают и встряхивают в течение 3 мин.

Эталоны сравнения I, II, III и IV должны быть свежеприготовленными.

Для оценки прозрачности и степени мутности жидкостей допускается использование специальных приборов типа турбидиметров или эквивалентных, если это предусмотрено частной фармакопейной статьей.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА В ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ МЕТОДОМ КЪЕЛЬДАЛЯ (ОФС 42-0052-07)

Метод основан на минерализации лекарственного средства под воздействием серной кислоты концентрированной при нагревании в присутствии катализаторов. При этом азот превращается в аммония сульфат. При добавлении натрия гидроксида выделяется аммиак, который перегоняют с паром в приемник, содержащий кислоту для его поглощения: борную - в методе прямого титрования (1 и 2); серную или хлористоводородную - в методе обратного титрования (3). В методах 1 и 2 поглощенный аммиак титруют раствором кислоты (хлористоводородной или серной), в методе 3 избыток кислоты оттитровывают раствором натрия гидроксида. По результатам титрования рассчитывают содержание азота.

Различают следующие варианты метода: 1 - метод Къельдаля, 2 - микрометод Къельдаля, 3 - метод Къельдаля (обратное титрование).

Прибор для определения азота (рис. 18.1 - не приводится) состоит из парообразователя - круглодонной колбы (1) вместимостью 3 л с предохранительной трубкой (2), сменных колб Къельдаля с длинным горлом (3) для конденсации водяных паров и защиты от потери вещества, воронки (4) с зажимом или краном (5) для добавления щелочи, брызгоуловителя (6), прямого холодильника (7) и сменных конических колб-приемников (8). Стеклянная посуда должна быть термостойкой. Прибор помещают в вытяжной шкаф.

Вместо описанного прибора могут быть использованы приборы для автоматического определения азота по Къельдалю. В таком случае определение проводят в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору.

1. Метод Къельдаля

В колбу Къельдаля (3) вместимостью 200-300 мл (другие объемы от 50 до 500 мл должны быть указаны в частной фармакопейной статье) помещают точную навеску или точный объем образца лекарственного средства (0,5-10,0 мл) с содержанием азота около 14-35 мг (если требуется пробоподготовка, она должна быть описана в частной фармакопейной статье), три стеклянных шарика для пенящихся веществ и 1 г растертой смеси калия сульфата и меди сульфата, взятых в соотношении 10:1 (другой состав смеси катализаторов должен быть указан в частной фармакопейной статье). Для трудно сжигаемых веществ дополнительно в колбу (3) добавляют 0,05 г металлического селена и/или 1 мл водорода пероксида. Прибавляют 7 мл серной кислоты концентрированной и осторожно вращают колбу для стекания кислоты со стенок и ее перемешивания с содержимым колбы. Постепенно нагревают колбу (3), закрытую стеклянной воронкой, на асбестовой сетке над открытым пламенем газовой горелки или в электронагревательном приборе и далее кипятят содержимое в течение нескольких часов до получения раствора светло-зеленого цвета. На стенках колбы не должно оставаться обугленного вещества. Кипячение продолжают еще 30 мин. или более до просветления раствора. Если при кипячении происходит сильное пенообразование, то рекомендуется снять колбу Къельдаля с нагревательного прибора и дать пене осесть, затем снова продолжают нагревание, не допуская попадания пены в горло колбы. После охлаждения колбы Къельдаля в нее осторожно добавляют 20 мл воды, вращая колбу для перемешивания содержимого, вновь охлаждают и присоединяют колбу к собранному аппарату (рис. 18.1), заранее промытому путем пропускания через него пара. В парообразователь наливают воду не менее половины объема, подкисленную 0,5 М или 0,05 М раствором серной кислоты по индикатору метиловому красному (2-3 капли) до слабо-розового цвета, для связывания аммиака, который может попасть из воздуха. Для обеспечения равномерного кипения воды в парообразователь помещают стеклянные шарики. В приемник перед началом отгонки наливают 20 мл 4% раствора борной кислоты и прибавляют 0,25 мл (5 капель) смешанного индикатора. Нижний конец внутренней трубки холодильника должен быть опущен в раствор, находящийся в приемнике. После сборки прибора в холодильник пускают воду и доводят до кипения воду в парообразователе. Затем в колбу (3) из воронки медленно по каплям прибавляют 40 мл 30% раствора натрия гидроксида, следя за тем, чтобы раствор в колбе (3) энергично перемешивался поступающим паром. Для обеспечения большей герметичности прибора в воронке следует оставлять некоторый избыток 30% раствора натрия гидроксида. Собирают около 100 мл отгона (или количество, указанное в частной фармакопейной статье). Во время отгонки колбу Къельдаля нагревают так, чтобы объем жидкости в ней оставался постоянным. По окончании отгонки опускают приемник, трубку холодильника выводят из жидкости, промывают снаружи водой, продолжая подачу пара в колбу (3) в течение 1-2 мин.; промывную воду собирают в тот же приемник. После этого прекращают нагревание парообразователя и немедленно отсоединяют колбу Къельдаля от прибора. По окончании отгонки дистиллят титруют 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты или 0,05 М раствором серной кислоты (должно быть указано в частной фармакопейной статье) до перехода окраски смешанного индикатора из зеленой в красно-фиолетовую.

Проводят контрольный опыт таким же образом и с теми же реактивами, но без испытуемого образца; полученный результат используют для внесения поправки при расчете содержания азота.

1 мл 0,1 М раствора хлористоводородной или 0,05 М раствора серной кислоты соответствует 1,401 мг азота.

2. Микрометод Къельдаля

В колбу Къельдаля вместимостью от 50 до 250 мл помещают точную навеску или указанный в частной фармакопейной статье объем образца лекарственного средства с содержанием азота 1,4-3,5 мг. Остальные операции проводят, как указано выше в методе 1, используя описанную ранее смесь катализаторов или (например, в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами) 0,25 г смеси калия сульфата, меди сульфата и натрия селената в соотношении 20:5:8,5; в этом случае вместо 7 мл прибавляют 2 мл серной кислоты концентрированной.

В случае указанных лекарственных средств минерализацию проводят до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. После этого нагревание продолжают еще 30 мин. В конце минерализации, когда вода испарится, прибавляют 1-3 капли водорода пероксида и продолжают нагревание в течение 10 мин. до обесцвечивания раствора.

Титрование выделенного аммиака проводят 0,01 М раствором хлористоводородной или 0,005 М раствором серной кислоты.

1 мл 0,01 М раствора хлористоводородной или 0,005 М раствора серной кислоты соответствует 0,1401 мг азота.

3. Метод Къельдаля (обратное титрование)

А. После разложения образца лекарственного средства в методах 1 или 2 в приемник помещают точно отмеренное количество (от 10,0 до 25,0 мл) взятой в избытке хлористоводородной или серной кислоты (объем и молярность раствора кислоты зависят от содержания азота в препарате; указывают в частной фармакопейной статье).

По окончании отгонки аммиака содержимое приемника титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида (или 0,01 М, что должно быть указано в частной фармакопейной статье) в присутствии смешанного индикатора, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, до перехода окраски из красно-фиолетовой в зеленую.

Проводят контрольный опыт таким же образом и с теми же реактивами, но без испытуемого образца или используя 0,050 г глюкозы, о чем указывают в частной фармакопейной статье.

    Содержание  азота в лекарственном средстве в процентах (X ) или в мг/мл
(X ) вычисляют по формулам:                                  1

2

                                                 -3

                           (V  - V ) x K x 1,401 x 10   x 100
                             0    1
                      X  = -----------------------------------,
                       1                    m

                           (V  - V ) x K x 1,401
                             0    1
                      X  = ----------------------,
                       2             V

где:

V — объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедший на титрование 0 контрольного раствора, мл;

V — объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедший на титрование 1 испытуемого раствора, мл;

K — поправочный коэффициент раствора натрия гидроксида;

1,401 — титр азота по соответствующей методике, мг/мл;

m — навеска образца лекарственного средства, г;

V — объем раствора, взятый для анализа, мл.

Б. Данный метод применяют преимущественно в препаратах крови.

В колбу Къельдаля с помощью калиброванной пипетки вносят 0,5-1 мл испытуемого раствора, содержащего 8-32 мг азота (или 50-200 мг белка), затем вносят растертую смесь (около 1 г) калия сульфата и меди сульфата (3:1) и от 2 до 4 мл серной кислоты концентрированной в зависимости от содержания белка. Содержимое колбы кипятят. Для ускорения сжигания несколько раз прибавляют по 5 капель пергидроля и продолжают кипятить, пока раствор не станет голубым или бесцветным. По окончании сжигания смесь охлаждают. В парообразователь наливают воду, нагревают до кипения и проверяют аппарат на герметичность. Присоединяют колбу Къельдаля к прибору для перегонки аммиака или количественно переносят содержимое колбы в реакционный сосуд аппарата, используя 30 мл воды. Отгон собирают в приемник, куда предварительно наливают от 10,0 до 25,0 мл 0,05 М раствора серной кислоты в зависимости от содержания белка. Приемник присоединяют так, чтобы нижний конец трубки холодильника был опущен в раствор. Воду в парообразователе нагревают до кипения. В колбу или в реакционный сосуд аппарата с минерализатом через воронку прибавляют около 20 мл 15 М раствора натрия гидроксида до появления коричневой окраски минерализата. После этого быстро и герметично закрывают зажим воронки и отгоняют аммиак в течение 5 мин. Затем опускают приемник с 0,05 М раствором серной кислоты так, чтобы нижний конец трубки холодильника не касался поверхности жидкости, и продолжают перегонку еще 5 мин. Отгон титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до перехода сиреневой окраски в зеленую (индикатор — 0,05 мл смешанного индикатора). Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида соответствует 1,401 мг азота.

(объяснение в тексте)

Рисунок не приводится.

19. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА (ОФС 42-0053-07)

Определение содержания белка проводят в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами.

Для лекарственных средств, в которых белки не являются основными компонентами или имеют необычную первичную структуру (например, протамины), могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в частных фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами лекарственного средства.

Для количественного определения белка используют следующие методы:

1. Спектрофотометрические методы, в которых измерение проводят при одной длине волны (метод А) или при двух длинах волн (метод Б). Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении светопоглощения растворов белков при 280 нм (поглощение ароматических аминокислот) или в области 205-220 нм (поглощение пептидных групп).

2. Колориметрические методы

1. Метод с биуретовым реактивом. Метод универсален, мало зависит от природы белка, но имеет низкую чувствительность.

2. Метод Лоури. Преимущественно используется для ферментных препаратов. Отличается высокой чувствительностью, но определению мешают многие вещества. В последнем случае применяют метод с предварительным осаждением белка (Б). Зависимость поглощения белка от его концентрации нелинейная, однако, в области малых концентраций ее можно считать линейной. Определение проводят по калибровочному графику, построенному по растворам стандартного образца белка, который воспроизводят при каждом анализе.

3. Метод Бредфорда используется для белков и пептидов с молекулярной массой более 3000 Да. Метод имеет высокую чувствительность, но степень связывания красителя в значительной степени зависит от индивидуальных свойств белка.

4. Метод с бицинхониновой кислотой альтернативен методу Лоури, но отличается более высокой стабильностью реагента, чем реактив Фолина, и меньшей зависимостью от природы белка и сопутствующих соединений.

Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в частной фармакопейной статье: в эксикаторе под вакуумом над фосфора(V) оксидом, в вакуумном шкафу при 60 град. C или в термостате при 100-105 град. C).

Раствор стандартного образца. Стандартный образец белка растворяют в том же растворителе и в той же концентрации, что и в испытуемом растворе.

Испытуемый раствор. Растворяют или разводят лекарственное средство в воде, 0,9% растворе натрия хлорида или буферном растворе до концентрации, указанной в частной фармакопейной статье.

3. Методы определения белка по содержанию азота

1. Метод Къельдаля — титриметрический (А — микрометод, Б — обратное титрование).

2. Метод с реактивом Несслера (колориметрический). В качестве стандартного образца, содержащего азот, используют аммония сульфат.

Для многокомпонентных препаратов, содержащих другие вещества, в состав которых входит азот, перед определением белка необходимо предварительно проводить пробоподготовку: осаждение трихлоруксусной или фосфорновольфрамовой кислотой.

4. Метод определения белка по аминокислотному составу.

1. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Результаты достоверны в области линейной зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка.

Метод А. Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина) в молекуле белка поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны около 280 нм.

При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам; в этом случае в раствор препарата добавляют неионный детергент, указанный в частной фармакопейной статье, или предварительно концентрируют испытуемый раствор, избегая денатурации белка.

Готовят испытуемый раствор с содержанием белка 0,2-2 мг/мл.

Методика. Выдерживают при комнатной температуре испытуемый раствор, раствор стандартного образца и раствор сравнения в течение 10 мин.

Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения.

Рассеяние света. Точность определения содержания белка в УФ-области уменьшается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250-300 нм). Рассеяние светового луча приводит к увеличению поглощения испытуемого раствора, поэтому дополнительно вычисляют оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм, обусловленную рассеянием света. С этой целью проводят определение оптической плотности испытуемого раствора при длинах волн 320, 325, 330, 335, 340 и 350 нм. Строят график зависимости логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую до lg 280 нм и определяют lg оптической плотности. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света, которое вычитают из оптической плотности раствора, полученной при 280 нм, для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе.

Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле:

                                  C = C   x A/A   ,
                                       ст.     ст.

где:

C — концентрация белка в растворе стандартного образца, в мг/мл; ст.

A и A — значения оптической плотности испытуемого раствора и ст. раствора стандартного образца при длине волны 280 нм соответственно, после вычитания оптической плотности за счет рассеяния света.

Мутные растворы для уменьшения светового рассеяния перед определением содержания белка фильтруют через фильтры из поливинилиденфторида или указанные в частной фармакопейной статье с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующие белок, или центрифугируют.

Метод Б. Метод измерения оптической плотности растворов при двух длинах волн используют как для растворов чистых белков, так и для их смесей, в области концентраций 0,0015-0,0450 мг/мл, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

    Готовят   серию  разведений  (не  менее  трех)  образца  лекарственного
средства  с  равными интервалами и измеряют оптическую плотность полученных

растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм. Концентрацию белка (C ) в каждом i растворе в мг/мл вычисляют по формуле:

                    C  = (A215 - A225) x P  x 0,144,
                     i                    i

где:

A215 и A225 — оптическая плотность разведенного раствора при 215 нм и 225 нм соответственно;

P — разведение; i

0,144 — эмпирически вычисленный коэффициент для белков при измерении оптической плотности растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм.

Рассчитывают среднее значение.

2. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Метод с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.

Методика. К 1 мл испытуемого раствора, приготовленного растворением испытуемого вещества в 0,9% растворе натрия хлорида, с содержанием белка от 2 до 8 мг прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм (или указанной в частной фармакопейной статье, в пределах 540-650 нм).

Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно-аммиачных комплексов, а также с растворами, в которых появляется мутность или образуется осадок. Для устранения влияния посторонних веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объема 50% раствора трихлоруксусной кислоты, удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.

Метод может использоваться в различных вариантах: с построением калибровочной кривой или с использованием стандартного образца.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

2. Метод Лоури

Метод основан на биуретовой реакции белков с солями меди(II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (или реактива Фолина) в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка (главным образом тирозина, а также триптофана и фенилаланина и в меньшей степени цистеина). Развитие окраски достигает максимума через 20-30 мин. при комнатной температуре, в дальнейшем идет уменьшение ее интенсивности. Степень окрашивания зависит от природы белка. Определению мешают некоторые соли, тиоловые соединения, углеводы, липиды, неионные детергенты, органические растворители, комплексоны и другие соединения. Для уменьшения влияния веществ, мешающих определению, проводят дополнительное разведение раствора или осаждение белков трихлоруксусной кислотой.

Метод А (без предварительного осаждения белка). К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,020-0,100 мг белка; к 1 мл каждого раствора стандартного образца белка и к 1 мл используемого для приготовления испытуемого раствора растворителя, помещенным в отдельные пробирки, прибавляют по 5 мл реактива B. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку прибавляют 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива, разбавленного перед употреблением водой в 2 раза, быстро и тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Примечания

1. Приготовление реактива А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 г натрия карбоната, растворяют в 0,1 М растворе натрия гидроксида и доводят объем до метки этим же раствором.

Срок годности раствора — 1 мес.

2. Приготовление реактива Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г меди сульфата и растворяют в 1% растворе: калия-натрия тартрата, или натрия тартрата, или натрия цитрата (должно быть указано в частной фармакопейной статье).

Срок годности раствора — 2 мес.

3. Приготовление реактива В. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива Б.

Метод Б (с предварительным осаждением белка). Метод рекомендован для лекарственных средств, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа (фенол, ароматические аминокислоты, трис-буфер, цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота, этилендиаминтетраацетат; тритон X-100, твин-20, соли, сахара и др.).

Методика. В центрифужную пробирку помещают 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,10-0,30 мг белка, прибавляют 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18-20 ч при температуре 4-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин. при температуре около 5 град. C и скорости вращения 2000 об/мин., промывают 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют в тех же условиях. Осторожно сливают надосадочную жидкость, оставшийся осадок растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой до 1 мл. К 0,5 мл полученного раствора, содержащего 0,050-0,150 мг белка, прибавляют 0,5 мл воды, перемешивают, вносят 5 мл реактива В и далее поступают, как описано выше в методе А.

В качестве раствора сравнения используют пробу, содержащую 0,1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 0,9 мл воды, 5 мл реактива В и 0,5 мл разбавленного в 2 раза фосфорномолибденово-вольфрамового реактива.

Примечание. Приготовление 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 150 г ТХУ растворяют в 100 мл воды. 1 мл полученного раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида с индикатором фенолфталеин и рассчитывают концентрацию трихлоруксусной кислоты в полученном растворе (приблизительно 80% раствор трихлоруксусной кислоты).

1 мл 1 М раствора натрия гидроксида соответствует 0,1634 г трихлоруксусной кислоты.

Срок годности полученного раствора — 1 год.

Раствор разводят водой до концентрации 20%.

Срок годности 20% раствора трихлоруксусной кислоты — 1 мес.

Метод В (с натрия додецилсульфатом). Определение проводят, как описано в методе А, но вместо 5 мл реактива В к растворам прибавляют по 1 мл щелочного реагента меди.

Примечание. Приготовление щелочного реагента меди. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 0,2 г меди сульфата и 0,4 г натрия тартрата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 1 объем полученного раствора смешивают с 2 объемами 5% раствора натрия додецилсульфата и 1 объемом 3,2% раствора натрия гидроксида.

Срок годности — 2 недели при комнатной температуре.

3. Метод Бредфорда

Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90 с белком при длине волны 595 нм. Связывание красителя происходит в анионной форме преимущественно с остатками аргинина и в меньшей степени с остатками лизина, гистидина, триптофана и фенилаланина белка.

Методика. 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,04-0,05 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорда, тщательно перемешивают и через 10 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорда. Окраска стабильна в течение 1 часа. Для соблюдения линейной зависимости оптической плотности определяемого белка от его концентрации конечная концентрация белка в растворе красителя должна быть 0,008-0,010 мг/мл. В частных фармакопейных статьях допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорда с соблюдением данного условия.

Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному в пределах от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка в 0,1 мл раствора.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечание. Приготовление реактива Бредфорда. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90, растворяют в 25 мл спирта 96%, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.

Реактив хранят при комнатной температуре во флаконе темного стекла. Срок годности — 2 недели.

Перед использованием реактив фильтруют.

Допускается использование коммерческого реактива Бредфорда.

4. Метод с бицинхониновой кислотой

Метод основан на восстановлении двухвалентного иона меди в одновалентный при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса CU+ с бицинхониновой кислотой (2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота-БХК). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть уменьшено разбавлением испытуемого раствора или устранено отделением белка путем его осаждения, описанного в методе Лоури. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, поэтому белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.

Методика. К 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,025-0,05 мг белка; 0,1 мл раствора стандартного образца белка и к 0,1 мл растворителя, используемого для приготовления испытуемого раствора, прибавляют 2 мл реагента меди с БХК. Выдерживают растворы при 37 град. C в течение 30 мин., охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин. (от конца выдержки при 37 град. C) измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Содержание белка в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику.

Примечания

1. Приготовление БХК-реагента. В мерной колбе вместимостью 1 л в воде растворяют 10 г бицинхониновой кислоты (БХК) или ее динатриевой соли, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; pH полученного раствора должен быть 11,25. При необходимости pH доводят раствором натрия гидроксида 10% или натрия гидрокарбоната 5%.

2. Приготовление реагента меди с БХК. Смешивают 1 мл 4% раствора меди сульфата и 50 мл БХК-реагента.

3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО СОДЕРЖАНИЮ АЗОТА

Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25.

Другие азотсодержащие вещества, присутствующие в испытуемом образце, будут оказывать влияние на результаты определения.

Определение белка по содержанию азота основано на разложении испытуемого образца при проведении анализа. При нагревании азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить количественно.

1. Метод Къельдаля

А. Микрометод. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях» (раздел 2 - микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10-20 мг белка.

Б. Метод Къельдаля (обратное титрование). Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях» (раздел 3, подраздел Б - определение азота преимущественно в препаратах крови) из точного объема испытуемого раствора, содержащего 50-200 мг белка.

2. Метод с реактивом Несслера

Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера.

Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом.

Метод А. Точную навеску лекарственного средства, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Къельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5-1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без испытуемого образца.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,03 до 0,07 мг в 25 мл конечного раствора.

Метод Б (с использованием фосфорновольфрамовой кислоты). В центрифужную термостойкую пробирку вместимостью 10 мл вносят от 0,5 до 3 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,07 до 3,0 мг, доводят при необходимости объем 0,9% раствором натрия хлорида до 3 мл, прибавляют 0,3 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты и 0,3 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивают и оставляют на 18-20 ч при температуре 2-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 2000 об/мин. в течение 30 мин. при температуре 4-6 град. C. Осадок промывают смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл серной кислоты концентрированной, 0,1 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты, затем центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком или стеклянной воронкой и минерализуют на песчаной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически прибавляют по 1-2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (8-10 ч или указанного в частной фармакопейной статье времени), окраска которого не изменяется в течение последних 1-1,5 ч. Пробирку охлаждают, доводят объем минерализата водой до 10 мл и перемешивают. 0,5 мл полученного раствора переносят в мерную пробирку, доводят водой до объема 9,5 мл и перемешивают; прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор, приготовленный аналогичным образом из контрольной пробы.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,005 до 0,025 мг в 10 мл и воспроизводят при каждом анализе.

4. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО АМИНОКИСЛОТНОМУ СОСТАВУ

Метод включает кислотный гидролиз (обычно в 6 М растворе хлористоводородной кислоты при 110 град. C в течение 18-72 ч) белков до аминокислот, которые затем хроматографически разделяют в соответствии с инструкцией, прилагаемой к аминокислотному анализатору, и количественно определяют в сравнении со стандартами аминокислот.

Необходимо учитывать, что при кислотном гидролизе разрушается триптофан и частично треонин и серин. Количество треонина и серина определяют путем экстраполяции данных к нулевому времени гидролиза. Пептидная связь между остатками валина, лейцина и изолейцина более устойчива к гидролизу, чем у других аминокислот, поэтому их количество определяют после гидролиза в течение 72 час. При определении цистеина и метионина необходимо их предварительно окислять соответственно в цистеиновую кислоту и метионинсульфон или использовать другие методы анализа: для цистина (1/2 цистеина) — гидразинолиз с последующим проведением цветной реакции с реактивом висмута, описанным в частной фармакопейной статье; для метионина — проведение гидролиза в отдельной навеске большой массы (около 0,5 г) с последующей цветной реакцией с натрия нитропруссидом. Триптофан определяют после щелочного гидролиза в отдельной навеске и проводят цветную реакцию с n-диметиламинобензальдегидом.

Расчет содержания белка проводят следующим образом: зная содержание каждой аминокислоты (A ) в мкг/мг и мкМ/мг, рассчитывают сумму аминокислот. i Затем рассчитывают величину средней молекулярной массы аминокислот (M ), ср. поделив сумму аминокислот в мкг (SUM A ) на сумму аминокислот в мкМ : i1 (SUM A ): i2

                               SUM A
                                    i1

                          M    = ----------.
                           ср.     SUM A

                                    i2

Из полученного значения M вычитают 18 (молекулярная масса воды, ср. которая присоединяется к пептидной связи во время гидролиза с ее разрывом и

образованием   концевых  групп  аминокислот),  получают  величину  среднего
аминокислотного остатка (A   ):

                      ср.

                          A    = M    - 18.
                           ср.    ср.

    Затем  полученное  значение  A    умножают на сумму аминокислот в  мг и

                              ср.

делят на значение M , в результате получают содержание белка в мг (Б): ср.

                        A    x SUM A
                         cp.        i1

Б = -----------------, 1000 x М ср.

где 1000 — перевод мкг в мг.

Для определения содержания белка (X) в мг в 1 мг образца лекарственного средства делят значение Б с учетом разведения (P), проводимого в ходе анализа, на навеску образца (m) в мг, которая обычно составляет около 10 мг:

                             Б x P

X = -------. m

20. НИТРИТОМЕТРИЯ (ОФС 42-0054-07)

Нитритометрия — метод титриметрического анализа, при котором в качестве реактива для титрования используется раствор натрия нитрита.

Применяется для количественного определения соединений, содержащих первичную или вторичную ароматическую аминогруппу, для определения гидразидов, а также ароматических нитросоединений после предварительного восстановления нитрогруппы до аминогруппы.

Методика. Если не указано иначе, точную навеску образца лекарственного средства, указанную в частной фармакопейной статье, растворяют в смеси 10 мл воды и 10 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%. Прибавляют воду до общего объема 80 мл, 1 г калия бромида и при постоянном перемешивании титруют 0,1 М раствором натрия нитрита. В начале титрования прибавляют раствор натрия нитрита со скоростью 2 мл/мин., а в конце (за 0,5 мл до эквивалентного количества) — 0,05 мл/мин.

Титрование проводят при температуре раствора 15-20 град. C, однако в некоторых случаях требуется охлаждение до 0-5 град. C.

Точку эквивалентности определяют электрометрическими методами (потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование) или с помощью внутренних индикаторов.

При потенциометрическом титровании в качестве индикаторного применяют платиновый электрод, при этом в качестве электродов сравнения используют хлорсеребряный или насыщенный каломельный электрод.

На электроды накладывают разность потенциалов 0,3-0,4 В, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

В качестве внутренних индикаторов используют тропеолин 00 (4 капли раствора), тропеолин 00 в смеси с метиленовым синим (4 капли раствора тропеолина 00 и 2 капли раствора метиленового синего), нейтральный красный (2 капли в начале и 2 капли в конце титрования).

Титрование с тропеолином 00 проводят до перехода окраски от красной к желтой, со смесью тропеолина 00 с метиленовым синим — от красно-фиолетовой к голубой, с нейтральным красным — от красно-фиолетовой к синей. Выдержку в конце титрования с нейтральным красным увеличивают до 2 мин.

Параллельно проводят контрольный опыт.

ИСПЫТАНИЕ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ

21. ОБЩАЯ ЗОЛА (ОФС 42-0055-07)

Около 1 г испытуемого вещества или 3-5 г измельченного лекарственного растительного сырья (точная навеска) помещают в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель, равномерно распределяя вещество по дну тигля. Затем тигель осторожно нагревают, давая сначала веществу сгореть или улетучиться при возможно более низкой температуре. Сжигание оставшихся частиц угля проводят также при возможно более низкой температуре; после того как уголь сгорит почти полностью, увеличивают пламя. При неполном сгорании частиц угля остаток охлаждают, смачивают водой или насыщенным раствором аммония нитрата, выпаривают на водяной бане и остаток прокаливают. В случае необходимости такую операцию повторяют несколько раз.

Прокаливание проводят в муфельной печи при температуре около 600 град. C до постоянной массы, избегая появления пламени, сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

22. СУЛЬФАТНАЯ ЗОЛА (ОФС 42-0056-07)

Точную навеску испытуемого вещества (около 1 г, если нет других указаний в частной фармакопейной статье) помещают в предварительно прокаленный и точно взвешенный фарфоровый, кварцевый или платиновый тигель, смачивают 1 мл серной кислоты концентрированной и осторожно (избегая сильного вспенивания вещества) нагревают на пламени или песчаной бане до удаления паров серной кислоты. Продолжают нагревание при более высокой температуре до исчезновения темных частиц. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при температуре около 600 град. C до постоянной массы, избегая появления пламени, сплавления золы и спекания ее со стенками тигля. По окончании прокаливания тигель охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

В случае трудного сгорания, прибавление серной кислоты концентрированной и прокаливание повторяют.

23. ОСТАТОЧНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ РАСТВОРИТЕЛИ (ОФС 42-0057-07)

Остаточные органические растворители — это растворители, которые используются на любой стадии производства лекарственного средства и полностью не удаляются после завершения технологического процесса.

Контролю на содержание органических растворителей подвергаются лекарственные и вспомогательные вещества, а также лекарственные препараты независимо от способа применения, если при их получении или очистке используются органические растворители или они могут образоваться в процессе производства.

Нормативная документация (НД), регламентирующая качество таких лекарственных и вспомогательных веществ, а также лекарственных препаратов, должна иметь раздел «Остаточные органические растворители».

Отсутствие такого раздела в НД должно быть обосновано.

Предельно допустимое содержание органических растворителей в лекарственных средствах определяется степенью их возможного риска для здоровья человека. Эти факторы положены в основу классификации органических растворителей:

1 класс — высокотоксичные растворители (генотоксичные канцерогены), применяемые в фармацевтическом производстве в исключительных случаях, когда нельзя избежать их использования (табл. 23.1);

2 класс — негенотоксичные растворители. Нормирование их в лекарственных средствах обусловлено максимально допустимым количеством, принимаемым в составе суточной дозы лекарственного средства (табл. 23.2);

3 класс — растворители низкой токсичности, содержание которых до 0,5% не требует подтверждения (табл. 23.3). Содержание таких растворителей допускается и в более высоких пределах, если это регламентировано правилами Надлежащей производственной практики или иными стандартами производства.

Определение содержания остаточных органических растворителей может быть осуществлено любыми валидированными методами. Наиболее часто для этих целей используется метод газовой хроматографии.

Содержание остаточных органических растворителей в лекарственных средствах регламентируется следующим образом:

1. при наличии растворителей 1 класса каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно;

2. при наличии растворителей 2 класса каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно;

3. при наличии растворителей 3 класса, если их содержание не превышает 0,5%, для определения допускается применение неспецифического метода «Потеря в массе при высушивании»; при наличии растворителей 3 класса, если их содержание превышает 0,5%, каждый из них должен быть идентифицирован и определен количественно.

Условия проведения анализа на остаточные органические растворители должны быть описаны в соответствующих НД.

Указание на необходимость определения в фармацевтической субстанции или готовой лекарственной форме иных органических растворителей и условия проведения их анализа должны содержаться в соответствующих НД.

Таблица 23.1

1 класса токсичности

Таблица 23.2

2 класса токсичности

Таблица 23.3

настоящей ОФС

24. ИСПЫТАНИЯ НА ЧИСТОТУ И ДОПУСТИМЫЕ ПРЕДЕЛЫ ПРИМЕСЕЙ

Определение примесей в лекарственных средствах и оценку их содержания проводят путем сравнения с эталонными растворами, устанавливающими предел содержания данной примеси, после проведения реакции. Окраска или опалесценция/муть испытуемого раствора должна быть не интенсивнее окраски или опалесценции/мути эталонного раствора.

Общие замечания

1. Вода и все реактивы должны быть свободны от ионов, на содержание которых проводят испытания.

2. Пробирки, в которых проводят наблюдения, должны быть бесцветными и одинакового диаметра (около 1,5 см, если не указано иначе).

3. Если не указано иначе, навески для приготовления эталонных растворов отвешивают с точностью до 0,001 г.

4. Наблюдения мути и опалесценции растворов проводят в проходящем свете на темном фоне, а окраски — по оси пробирок при дневном отраженном свете на матово-белом фоне.

5. Прибавление реактивов к испытуемому и эталонному растворам должно проводиться одновременно и в одинаковых количествах.

6. В случае, когда в соответствующей фармакопейной статье указано, что в данной концентрации раствора не должно обнаруживаться той или иной примеси, поступают следующим образом. К 10 мл испытуемого раствора прибавляют применяемые для каждой реакции реактивы, указанные в методике, кроме основного реактива, открывающего данную примесь. Затем раствор делят на две равные части: к одной из них прибавляют основной реактив и оба раствора сравнивают между собой. Между ними не должно быть заметной разницы.

24.1. ЖЕЛЕЗО (ОФС 42-0058-07)

Химические методы определения примеси железа в лекарственных средствах основаны на образовании окрашенных растворов при взаимодействии ионов железа с различными реагентами.

С сульфосалициловой кислотой соли двух- и трехвалентного железа в зависимости от концентрации образуют в аммиачной среде желтые или коричнево-красные растворы сульфосалицилатных комплексов (метод 1); в зависимости от природы испытуемого образца используются различные модификации этого метода.

С тиогликолевой кислотой в аммиачной среде (метод 2) или с аммония тиоцианатом в кислой среде (метод 3) соли трехвалентного железа в зависимости от концентрации образуют розовые или красные растворы соответствующих соединений. В этих методах двухвалентное железо переходит в трехвалентное под действием тиогликолевой кислоты или аммония персульфата.

Интенсивность окраски испытуемого раствора сравнивают с окраской эталонного раствора. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать окраску эталонного раствора.

Предельно допустимое содержание солей железа, метод испытания, условия подготовки испытуемого образца и концентрация стандартного раствора железа должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

Определение железа в растворах лекарственных средств

Метод 1

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 1 мл 10% раствора аммиака, перемешивают и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Определение солей железа в соединениях магния

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 0,5 мл 10,7% раствора аммония хлорида, 1 мл 10% раствора аммиака и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Определение солей железа в соединениях алюминия

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (3 мкг/мл). К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 5 мл 10% раствора сульфосалициловой кислоты, 2 мл 10% раствора натрия гидроксида и сравнивают окраску растворов.

Метод 2

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. 10 мл стандартного раствора железо(III)-иона (1 мкг/мл).

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 2 мл 20% раствора лимонной кислоты и 0,1 мл тиогликолевой кислоты, перемешивают, добавляют раствор аммиака до щелочной реакции, разбавляют водой до 20 мл, перемешивают и через 5 мин. сравнивают окраску растворов.

Метод 3

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. К 3 мл стандартного раствора железо(III)-иона (1 мкг/мл) прибавляют 7 мл воды.

К испытуемому и стандартному растворам прибавляют по 0,5 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 10 мг аммония персульфата и 1,5 мл 15% раствора аммония тиоцианата, перемешивают и сравнивают окраску растворов.

органических соединений

Испытуемый раствор. Зольный остаток, полученный после сжигания навески испытуемого образца с серной кислотой концентрированной, обрабатывают при нагревании на водяной бане 2 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и прибавляют 2 мл воды.

Содержимое тигля, если нужно, фильтруют в пробирку, тигель и фильтр промывают 3 мл воды, присоединяя промывные воды к фильтрату. Раствор нейтрализуют аммиаком водным и доводят объем раствора водой до 10 мл.

Эталонный раствор. В тигель помещают серную кислоту в количестве, взятом для сжигания испытуемого образца, и далее поступают как с испытуемым препаратом, но объем раствора доводят водой до 9 мл, после чего прибавляют 1 мл стандартного раствора железо(III)-иона (30, 10 или 3 мкг/мл в зависимости от метода определения).

Далее определение проводят любым из описанных выше методов определения железа в растворах лекарственных средств.

Стандартные растворы железо(III)-иона

Стандартный раствор 200 мкг/мл железо (III)-иона

0,8634 г железа(III) аммония сульфата или количество железа(III) аммония сульфата (X), соответствующее 100,0 мг железо(III)-иона, рассчитанное по формуле X = 100,0/Q, где Q — содержание железо(III)-иона в миллиграммах в 1 грамме железа(III) аммония сульфата (см. Примечание), растворяют в 25 мл раствора серной кислоты разведенной 9,8% при нагревании, переносят количественно в мерную колбу вместимостью 500 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 30 мкг/мл железо(III)-иона

15 мл стандартного раствора (200 мкг/мл железо(III)-иона) перед использованием помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 20 мкг/мл железо(III)-иона

10 мл стандартного раствора (200 мкг/мл железо(III)-иона) перед использованием помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 10 мкг/мл железо(III)-иона

5 мл стандартного раствора (200 мкг/мл железо(III)-иона) перед использованием помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 3 мкг/мл железо(III)-иона

15 мл стандартного раствора (20 мкг/мл железо(III)-иона) перед использованием помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 1 мкг/мл железо(III)-иона

5 мл стандартного раствора (20 мкг/мл железо(III)-иона) перед использованием помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Примечание. Определение содержания железо(III)-иона в железа(III) аммония сульфате. Около 2,5 г железа(III) аммония сульфата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 20 мл полученного раствора переносят в колбу с притертой пробкой, прибавляют 10 мл хлористоводородной кислоты и 2 г калия йодида. Смесь взбалтывают и оставляют в темном месте на 30 мин., затем прибавляют 50 мл воды и титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата (индикатор — крахмал).

1 мл 0,1 М раствора натрия тиосульфата соответствует 5,585 мг железо(III)-иона.

24.2. ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ (ОФС 42-0059-07)

Описанные ниже методы определения содержания примесей тяжелых металлов (свинец, ртуть, висмут, сурьма, олово, кадмий, серебро, медь, молибден, ванадий, рутений, платина, палладий) в лекарственных средствах основаны на образовании окрашенных сульфидов. Кроме указанных элементов окрашенные сульфиды дают железо в количестве более 0,05% и мышьяк.

В качестве источника сульфидов используют раствор натрия сульфида (метод 1) или тиоацетамидный реактив (метод 2).

После проведения реакции интенсивность окраски испытуемого раствора сравнивают с окраской эталонного раствора. Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не должна превышать окраску эталонного раствора.

Определение считается достоверным, если в эталонном растворе наблюдается слабое коричневое окрашивание по сравнению с контрольным раствором.

Определение тяжелых металлов в растворах лекарственных средств возможно для субстанций, образующих прозрачные, бесцветные растворы и не влияющих на взаимодействие ионов металлов с сульфид-ионом вследствие комплексообразующих свойств. В остальных случаях определение проводят из сульфатной золы или после другого способа минерализации испытуемого лекарственного средства, описанного в частной фармакопейной статье.

Предельно допустимое содержание тяжелых металлов, метод испытания и условия подготовки испытуемого образца должны быть указаны в частной фармакопейной статье.

лекарственных средств

Испытуемый раствор. 10 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в частной фармакопейной статье.

Эталонный раствор. К 2 мл стандартного раствора свинец-иона (5 мкг/мл) прибавляют 8 мл воды.

Контрольный раствор. 10 мл воды.

Примечание. Если при приготовлении испытуемого раствора используется органический растворитель, то эталонный, контрольный и стандартный растворы свинец-иона готовят с использованием того же растворителя.

Метод 1. К полученным растворам прибавляют по 1 мл уксусной кислоты разведенной 30%, 2 капли 2% раствора натрия сульфида, перемешивают и через 1 мин. сравнивают окраску растворов.

В сравниваемых растворах допустима лишь слабая опалесценция от выделившейся серы.

Метод 2. К полученным растворам прибавляют по 2 мл ацетатного буферного раствора pH 3,5, перемешивают, прибавляют по 1 мл тиоацетамидного реактива, перемешивают и через 2 мин. сравнивают окраску растворов.

органических лекарственных средств

Испытуемый раствор. Зольный остаток, полученный после сжигания 1 г (если не указано иначе в частной фармакопейной статье) испытуемого образца в присутствии серной кислоты концентрированной, обрабатывают при нагревании на сетке 2 мл насыщенного раствора аммония ацетата, нейтрализованного раствором натрия гидроксида, прибавляют 3 мл воды и фильтруют в пробирку через беззольный фильтр, предварительно промытый 1% раствором уксусной кислоты, а затем горячей водой. Тигель и фильтр промывают 5 мл воды, пропуская ее через тот же фильтр в ту же пробирку.

Эталонный раствор. В тигель помещают серную кислоту, концентрированную в количестве, взятом для сжигания испытуемого образца, и далее поступают, как с испытуемым образцом, но промывание тигля и фильтра производят лишь 3 мл воды, после чего к фильтрату прибавляют 2 мл стандартного раствора свинец-иона (5 мкг/мл).

Контрольный раствор. Готовят так же, как и испытуемый раствор, но без испытуемого образца.

Далее определение проводят любым из описанных выше методов определения тяжелых металлов в растворах лекарственных средств.

Примечание. Определению тяжелых металлов из зольного остатка наличие солей железа в препаратах не мешает.

Стандартные растворы свинец-иона

Стандартный раствор 100 мкг/мл свинец-иона

0,0799 г свинца нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 500,0 мл и растворяют в 50 мл воды с добавлением 0,5 мл азотной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 5 мкг/мл свинец-иона

5,0 мл стандартного раствора свинца нитрата (100 мкг/мл свинец-иона) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок хранения — 1 сут.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

25. АНОМАЛЬНАЯ ТОКСИЧНОСТЬ (ОФС 42-0060-07)

Основной тест

Испытание проводят на 5 здоровых белых мышах обоего пола массой 19-21 г, которые ранее не использовались в экспериментах. Условия содержания и кормления должны обеспечивать нормальную жизнедеятельность животных.

Испытуемое лекарственное средство растворяют или разводят, в случае необходимости, раствором натрия хлорида 0,9% для инъекций. Тест-доза должна содержаться в объеме 0,5 мл испытуемого раствора, подогретого до 37 град. C, который вводят в хвостовую вену животного со скоростью 0,1 мл в секунду. Тест-дозу указывают в частной фармакопейной статье. Период наблюдения за животными составляет 48 ч.

Если в частной фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Лекарственное средство выдерживает испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из подопытных мышей.

Лекарственное средство не выдерживает испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения погибнет более чем одно животное.

В случае гибели одного животного, эксперимент повторяют на 5 мышах массой 20,0 +/- 0,5 г. Если при повторном испытании не погибнет ни одна мышь, лекарственное средство выдерживает испытание.

Тест для вакцин и сывороток

Испытание проводят на 5 здоровых белых мышах массой 17-20 г.

Испытуемое лекарственное средство вводят внутрибрюшинно в одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 1,0 мл каждому из животных. Сухой лекарственный препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указаниями на этикетке.

Период наблюдения за животными составляет 7 сут.

Если в частной фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Лекарственное средство выдерживает испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из подопытных мышей, ни у одного из животных не проявятся признаки интоксикации и не будет отмечено уменьшении массы тела.

Если более чем одно животное погибнет, лекарственное средство не выдерживает испытание. Если одно животное погибнет, проявятся признаки интоксикации или будет отмечено снижение массы тела, то испытание повторяют. Лекарственное средство выдерживает испытание, если ни одно животное из второй группы не погибнет, не проявятся признаки интоксикации и не будет отмечено уменьшение массы тела за период наблюдения.

Испытание лекарственного средства также должно быть проведено на двух здоровых морских свинках с массой тела 250-300 г.

Каждому животному вводят внутрибрюшинно одну максимальную разовую дозу испытуемого лекарственного средства для человека, но не более чем 5,0 мл.

Сухой лекарственный препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указаниями на этикетке.

Период наблюдения за животными составляет 7 сут.

Если в частной фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Лекарственное средство выдерживает испытание, если ни у одного из животных не проявятся признаки интоксикации и не будет отмечено уменьшение массы тела. Если оба животных погибнут, лекарственное средство не выдерживает испытание. Если одно животное погибнет, проявятся признаки интоксикации или будет отмечено снижение массы тела, то испытание повторяют. Лекарственное средство выдерживает испытание, если ни одно животное из второй группы не погибнет или не проявятся признаки интоксикации и не будет отмечено уменьшение массы тела за период наблюдения.

26. ПИРОГЕННОСТЬ (ОФС 42-0061-07)

Испытание на пирогенность инъекционных растворов и субстанций, из которых они изготавливаются, основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции.

испытания

Каждого кролика содержат в отдельной клетке на полноценном пищевом рационе, ограждая от раздражающих воздействий (акустических, оптических и других). Перед испытанием проводят осмотр животных и отбирают здоровых кроликов одного пола, не альбиносов, с массой тела от 2,0 до 3,5 кг, которые не теряли в массе в течение предыдущей недели.

В помещениях, где находятся животные и проводятся испытания, поддерживают постоянную температуру воздуха 20 +/- 3 град. C.

За 18 ч до испытания кроликов лишают корма без ограничения воды. Во время опыта животные не получают ни корма, ни воды. Кроликов, впервые предназначенных для опыта или не участвовавших в опыте более четырех недель, предварительно готовят к процедуре испытания, осуществляя все рабочие операции (осмотр, взвешивание, измерение температуры тела) за исключением инъекции.

Кролики, ранее бывшие в опыте, могут быть использованы повторно через трое суток, если введенное им лекарственное средство было апирогенным. При повышении температуры тела у животного на 0,6 град. C и более, кролик может быть использован для дальнейших опытов не ранее, чем через две недели.

Если испытуемое лекарственное средство обладает антигенными свойствами, то порядок повторного использования животных для испытаний указывают в частной фармакопейной статье.

Материалы и оборудование

Посуда для разведения, шприцы и иглы для инъекций должны быть стерильными и апирогенными, что обеспечивается нагреванием при температуре 250 град. C в течение 30 мин. или 200 град. C в течение 60 мин.

Для разведения испытуемых лекарственных средств используют раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций, если в частной фармакопейной статье не указан другой растворитель. Все растворители должны быть стерильными и апирогенными.

Ректальную температуру у кроликов измеряют с точностью до 0,1 град. C медицинским максимальным ртутным или электронным термометром с термочувствительным датчиком. Термометр или датчик вводят в прямую кишку кролика на глубину от 5 до 7,5 см в зависимости от массы тела животного.

Введение испытуемого лекарственного средства

Испытуемое лекарственное средство вводят в ушную вену кролика, если в частной фармакопейной статье не указан другой путь введения. Объем инъецируемого раствора должен составлять не менее 0,2 мл и не более 10 мл на 1,0 кг массы тела животного. Перед введением раствор подогревают до 37,0 +/- 2 град. C. Весь объем лекарственного средства вводят за период времени не более 2 мин.

Тест-дозу испытуемого лекарственного средства, объем вводимого раствора и, если необходимо, скорость введения указывают в частной фармакопейной статье.

Проведение испытания

Испытание лекарственного средства проводят на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5-39,5 град. C.

Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин., у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2 град. C. В противном случае кролика исключают из испытания. За исходную температуру принимают величину последнего результата измерения.

Раствор испытуемого лекарственного средства вводят животным сразу после второго измерения температуры.

Измерения температуры после внутривенного введения испытуемого лекарственного средства проводят с интервалом не более 30 мин. на протяжении трех часов. При других путях парентерального введения — на протяжении пяти часов.

Учет результатов

Испытание лекарственного средства можно проводить поэтапно. На каждом этапе используют трех кроликов. Максимальное число этапов не должно превышать четырех.

По окончании каждого из этапов испытания определяют максимальное изменение температуры (дельта t) тела у кролика по сравнению с исходным значением.

Изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нуль и не учитывают.

Для трех кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур (SUM дельта t). Значения SUM дельта t, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в табл. 26.1.

• После первого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 град. C (колонка 4).
• Если результат, полученный на первом этапе, превышает 1,2 град. C (колонка 5) или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры более 0,5 град. C — хотя бы у одного из трех кроликов (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
• После второго этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 2,8 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у одного из шести кроликов (колонка 4).
• Если результат, полученный на втором этапе испытания, больше 2,8 град. C, но меньше 4,3 град. C (колонка 5), или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у одного животного (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
• После третьего этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 4,5 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у двух из девяти кроликов (колонка 4).
• Если результат, полученный на третьем этапе испытания, больше 4,5 град. C, но меньше 6,0 град. C (колонка 5), или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у двух животных (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания.
• После четвертого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 6,6 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у трех из двенадцати кроликов (колонка 4).
• Лекарственное средство признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в колонке 7.
• Лекарственное средство признают пирогенным и в том случае, если в результате четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у трех кроликов из двенадцати.

Таблица 26.1

Оценка результатов испытания

<*> При индивидуальном повышении температуры свыше 0,5 град. C более чем у трех кроликов из двенадцати, лекарственное средство признают пирогенным.

27. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ (ОФС 42-0062-07)

Настоящая статья описывает метод определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения, и субстанциях, используемых для их изготовления.

Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). В результате реакции с эндотоксином происходит помутнение реакционной смеси и увеличение ее вязкости вплоть до формирования плотного геля, образование которого служит индикатором наличия в пробе бактериальных эндотоксинов. Проводимый таким образом анализ называется гель-тромб тест. Этот метод может быть использован для определения соответствия содержания бактериальных эндотоксинов предельному содержанию бактериальных эндотоксинов, указанному в частной фармакопейной статье («Метод А. Качественный анализ»), и для определения содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве («Метод В. Количественный анализ»).

Качественный анализ является основным методом проведения анализа на соответствие показателю «Бактериальные эндотоксины». Этот же метод является арбитражным.

Допускается использование других методов и/или модификаций ЛАЛ-теста, если они указаны в частной фармакопейной статье и валидированы для данного лекарственного средства.

Посуда и ее подготовка

Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции.

Рекомендуемым режимов депирогенизации является нагревание при температуре 250 град. C не менее 30 мин. в соответствии с валидированной процедурой.

Стандарты эндотоксина

Содержание бактериальных эндотоксинов выражается в единицах эндотоксина (ЕЭ) Международного стандарта эндотоксина. При проведении анализа может использоваться Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ) активность которого установлена по Международному стандарту эндотоксина.

Контрольный стандарт эндотоксина должен быть предназначен для проведения анализа с данной партией ЛАЛ-реактива (ТАЛ-реактива) <*>. Растворение и хранение КСЭ осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

<*> Контрольный стандарт эндотоксина и ЛАЛ-реактив или ТАЛ-реактив должны быть зарегистрированы в Минздравсоцразвития РФ.

ЛАЛ-реактив

Необходимо использовать ЛАЛ-реактив, предназначенный для проведения фармакопейного анализа с помощью гель-тромб теста. В случае проведения анализа методом, отличным от основного, необходимо использовать реактив, предназначенный для данного метода.

Чувствительность реактива (лямбда) выражена в единицах эндотоксина [ЕЭ/мл] и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом.

ЛАЛ-реактив представляет собой лиофилизированный препарат. Растворение и хранение реактива осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя.

Вода для ЛАЛ-теста

Для приготовления растворов реактивов и разведений испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.

Максимально допустимое разведение испытуемого лекарственного средства

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства.

Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:

              Предельное содержание           Концентрация
           бактериальных эндотоксинов  x  испытуемого раствора

МДР = -----------------------------------------------------,
                           лямбда

где:

предельное содержание бактериальных эндотоксинов — допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в частной фармакопейной статье;

концентрация испытуемого раствора — концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов;

лямбда — чувствительность ЛАЛ-реактива [ЕЭ/мл].

Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:

                                                    K
Предельное содержание бактериальных эндотоксинов = ----,
                                                    M

где:

M — максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного ч (в мг, мл, ЕД на 1 кг массы тела). Дозу, выраженную на 1 кв. м, пересчитывают с учетом того, что поверхность человека со средней массой тела 70 кг составляет 1,8 кв. м;

K — пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 ч для испытуемого лекарственного препарата, если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального. При интратекальном пути введения лекарственного препарата K составляет 0,2 ЕЭ/кг.

Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых парентерально (внутривенно), предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывается, как 175/V, где V — максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V.

Для субстанций рассчитывают предельное содержание бактериальных эндотоксинов, используя величину М, выбранную для лекарственной формы.

Подготовка испытуемого образца

Каждый отобранный образец испытывается индивидуально.

Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если не указано иного в частной фармакопейной статье. Испытуемый раствор должен иметь pH в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0-8,0. В случае необходимости pH доводят растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции.

Процедура анализа

В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы ЛАЛ-реактива и испытуемого раствора (по 0,1 мл). Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 +/- 1 град. C в течение 60 +/- 2 мин. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180 град. C Отрицательная реакция (-) характеризуется отсутствием такого геля.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ

Для подтверждения достоверности и точности результатов определения бактериальных эндотоксинов, проводимых с помощью ЛАЛ-реактива, необходимо подтвердить чувствительность реактива, указанную на этикетке, а также убедиться в том, что испытуемое лекарственное средство не содержит факторов, мешающих проведению реакции.

ЛАЛ-реактива

Анализ проводят для каждой новой серии используемого ЛАЛ-реактива, а также при изменении условий эксперимента, используемых материалов и реактивов, способных повлиять на результаты теста.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы C и D по схеме, приведенной в табл. 27.1.

Таблица 27.1

Растворы C — серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (проверка чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D — Вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

• для раствора D (отрицательный контроль) во всех повторностях получены отрицательные результаты;
• для раствора C с концентрацией 0,25 лямбда получены отрицательные результаты.

Конечной точкой реакции для каждой из повторностей растворов C является положительный результат, полученный для раствора c наименьшей концентрацией КСЭ. По этим результатам рассчитывается среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива по следующей формуле:

 Среднее геометрическое значение             SUM e
концентраций КСЭ в конечной точке = antilog (------),
           реакции                             f

где SUM e — сумма логарифмов концентраций КСЭ в конечной точке реакции в каждой из повторностей, f — число повторностей.

Заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива считается подтвержденной и используется в дальнейших расчетах в том случае, если полученное в эксперименте значение чувствительности ЛАЛ-реактива не менее 0,5 лямбда и не более 2 лямбда.

Мешающие факторы

Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента.

Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.2.

Раствор A — испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов).

Растворы B — серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции).

Растворы C — серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D — вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Таблица 27.2

Схема эксперимента «Мешающие факторы»

Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Результаты и интерпретация. Результаты эксперимента считаются достоверными, если:

• для раствора D получены отрицательные результаты во всех повторностях;
• для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда;
• для раствора A получены отрицательные результаты во всех повторностях.

По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов B, рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5 лямбда и не более 2 лямбда, испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами, и может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если присутствие мешающих факторов обнаружено для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно снять действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения.

Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому КСЭ к раствору испытуемого лекарственного средства добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ Мешающие факторы. Если после обработки выбранным способом результаты анализа Мешающие факторы окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов.

Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье.

Анализ проводят с лекарственным средством в одном разведении, в котором был проведен анализ Мешающие факторы, или в большем разведении, но не превышающем значения МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.3.

Раствор A — испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР.

Раствор B — испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Раствор C — раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2 лямбда (положительный контроль).

Раствор D — вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.3

Схема эксперимента «Качественный анализ»

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

• для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;
• для раствора C (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты;
• для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты.

Если для раствора A в обеих повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания.

Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в разведении, равном МДР.

• Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела «Бактериальные эндотоксины» частной фармакопейной статьи.

Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора A, то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для обеих повторностей получены отрицательные результаты.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД B)

Задачей этого анализа является определение содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве. Для этого используется серия последовательных разведений испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, для которого был проведен анализ Мешающие факторы, или большего, но не превышающего МДР.

Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.4.

Растворы A — разведение испытуемого лекарственного средства, начиная с разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР.

Раствор B — испытуемое лекарственное средство в наименьшем из проверяемых в тесте разведений, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства).

Растворы C — серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива).

Раствор D — вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль).

Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа.

Таблица 27.4

Схема эксперимента «Количественный анализ»

Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если:

• для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях;
• для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда;
• для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в обеих повторностях;
• для растворов A конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства.

Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (лямбда) равно концентрации эндотоксина в растворе A, полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива.

Если во всех повторностях серии растворов A получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве менее чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наименьший фактор разведения.

Если во всех повторностях серии растворов A получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве более чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наибольший фактор разведения.

Лекарственное средство считают выдержавшим испытания, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье.

28. ИСПЫТАНИЕ НА ГИСТАМИН (ОФС 42-0063-07)

Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.

Подготовка изолированного органа

В опыт берут морскую свинку-самца с массой тела 200-350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют воду. После эвтаназии свинку обескровливают путем декапитации. Вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место ее перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1-2 см до этого места.

Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают ее основание и отрезают ножницами. Отсеченный конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая ее, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая ее. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10-15 см, ближайшие к слепой кишке.

Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Им осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от +2 до +4 град. C (примечание 2).

Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа).

испытуемого лекарственного средства <*>

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться «испытуемый препарат».

1. <a id="p101828"></a>Разведения стандартного образца

В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид в -6

трех  разведениях:  разведение  1  (1,25 x 10   г/мл); разведение 2 (2,50 x
  -6                                   -6
10   г/мл)  разведение  3  (5,00  x  10   г/мл), вызывающие  50, 75  и 100%
сокращение  кишки  соответственно.  В качестве растворителя используют 0,9%

раствор натрия хлорида.

2. <a id="p101830"></a>Разведение испытуемого препарата (ИП)

    Испытанию  подвергают  неразведенный  ИП,  когда максимально допустимая
нормативной    документацией   концентрация   гистамина   в   неразведенном

                                                      -6

лекарственном средстве находится в диапазоне от 1,25 x 10 г/мл до 2,50 x -6

10   г/мл. При необходимости  ИП разводят 0,9% раствор натрия хлорида таким
образом,  чтобы  предполагаемая  концентрация  гистамина  дигидрохлорида  в

                              -6

разведении ИП составляла 2,50 x 10 г/мл.

Регистрирующая система

Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение стандартного образца и ИП используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде (35 град. C), а также электронного датчика с самописцем или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% O2 и 5% CO2) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500-800 мг. В случае использования механического рычага, для ее вычисления следует применять правило равновесия:

Сила x Плечо силы = Нагрузка x Плечо нагрузки.

Проведение опыта

Изолированный отрезок подвздошный кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один — к крючку на дне ванночки, а другой — к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее трех раз сменить в ванночке раствор Тироде.

1. Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к субмаксимальной дозе гистамина

В термостатируемую ванночку вводят стандартный образец в разведении 3 в объеме, равном 1/100 от ее емкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объемом раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объемом раствора. Не менее чем через 4 мин. после первого введения снова повторяют цикл «введение-экспозиция-два отмывания». Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными.

2. Испытание ИП на гистамин

Предварительное испытание

После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение стандартного образца в разведении 3, проводят испытание ИП на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин. однократно, в случайном порядке вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП. Циклы «введение-экспозиция-два отмывания» такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.

В случае если пик, полученный в ответ на введение ИП, по высоте не меньше, чем пик стандартного образца в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИП (2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИП, меньше пика стандартного образца в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (2.2).

2.1 Количественное испытание ИП на гистамин

В случайном порядке поочередно вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП до получения не менее чем четырех пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на стандартный образец от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют, какой концентрации гистамина в разведении ИП соответствует средняя высота его пика и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном ИП (см. подраздел «Статистическая обработка результатов испытания на гистамин» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний»).

ИП считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое нормативной документацией (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).

2.2 Контрольное испытание

    Схема  его  проведения  такая  же, как и при количественном определении
содержания  гистамина  в  ИП, за исключением того, что вместо ИП используют
стандартный   образец   в  разведении  2.  Если  средняя  высота  его  пика
соответствует  вводимой  концентрации  гистамина  дигидрохлорида  в  данном

                   -6

разведении (2,50 x 10 г/мл), то результаты опыта следует признать достоверными.

Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих случаев:

    1)   Средняя  высота  пика  стандартного  образца  в  разведении  2  не
соответствует  вводимой  концентрации  гистамина  дигидрохлорида  в  данном

                 -6

разведении (2,50 x 10 г/мл).

2. При количественном определении содержания гистамина в ИП отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИП.

3. В процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4).

В каждом из этих трех случаев следует провести испытание ИП на вещества депрессорного действия (см. «Испытание на депрессорные вещества»).

Примечания

1. Состав и приготовление гипокальциевого раствора Тироде

Состав:

                   NaCl                                80,00 г
                   NaHCO3                              10,00 г
                   D-глюкоза                           11,00 г
                   KCl                                  2,00 г
                   CaCl2 x 2H20                         1,30 г
                   MgCl2 x 6H20                         2,10 г
                   NaH2PO4 x H20                        0,58 г
                   Воды дистиллированной               до 10 л

Приготовление

В мерном цилиндре объемом 1 л растворяют в дистиллированной воде навески NaCl, NaHCO3 и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объем раствора водой до 1 л и переливают содержимое цилиндра в 10-литровый стеклянный или полиэтиленовый сосуд с притертой пробкой или завинчивающейся крышкой.

Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды дистиллированной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:

               1) <a id="p101858"></a>KCl

               2) <a id="p101859"></a>CaCl2 x 2H20

               3) <a id="p101860"></a>MgCl2 x 6H20

               4) <a id="p101861"></a>NaH2PO4 x H2O

Затем доливают воду дистиллированную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.

Полученный раствор может храниться при температуре от +3 до +5 град. C не более 24 ч. Помутнение недопустимо.

Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать дистиллированной водой. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.

2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед тем как отрезки использовать в опыте, их следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин. выдерживают при комнатной температуре и в течение 20 мин. в термостате (35 град. C). После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается легкими поглаживающими движениями в продольном направлении.

3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причем направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.

Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты — 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа, писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.

4. Каждую серию, состоящую не менее чем из четырех пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять на дрейф с помощью теста Нойманна:

                             n - 1              2
                           n SUM   (x  - x     )
                             i = 1   1    i + 1

D = -------------------------,

                             n     2           2
                          n SUM   x  - (SUM x )
                            i = 1            i

где: x — высота пика на введение одного и того же раствора;

n — число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора.

Значение D должно быть (p < 0,05):

при n = 4 — меньше 0,78;

при n = 5 — меньше 0,82;

при n = 6 — меньше 0,89.

29. ИСПЫТАНИЕ НА ДЕПРЕССОРНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ОФС 42-0064-07)

Настоящая статья распространяется на определение веществ депрессорного действия in vivo в лекарственных средствах для парентерального применения.

Подготовка животного к опыту

В опыт берут здоровых кошек любого пола массой не менее 2 кг. Самки не должны быть беременными или лактирующими. За 24 ч до опыта животное лишают корма, но оставляют свободный доступ к воде. В качестве наркоза используют гексенал в дозе 350-400 мг/кг, который вводят внутримышечно. Можно использовать любой другой наркоз, не оказывающий существенное влияние на величину артериального давления.

Животное фиксируют в станке в положении на спине. Препарируют сонную артерию, в которую вставляют канюлю, заполненную раствором, предупреждающим свертывание крови (в качестве антикоагулянта используют 25% раствор магния сульфата или раствор гепарина, содержащий 50 ЕД в 1 мл и др.). Канюлю соединяют при помощи системы трубок, заполненных тем же раствором, с ртутным манометром или электронным датчиком для регистрации кровяного давления. Запись давления производят на ленте кимографа или другого регистрирующего устройства. Испытуемое лекарственное средство <*> вводят через иглу, вставленную в отпрепарированную бедренную вену.

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться «испытуемый препарат».

испытуемого препарата (ИП)

В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид. Все разведения следует проводить в пересчете на гистамин-основание (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038). Для разведения стандартного образца используют тот же растворитель, что и для ИП: воду для инъекций или 0,9% изотонический раствор натрия хлорида для инъекций, в зависимости от растворителя, указанного в соответствующем частном нормативном документе. Концентрация рабочих разведений стандартного образца в пересчете на гистамин-основание должна составлять 0,5 мкг/мл (разведение 1) и 1,0 мкг/мл (разведение 2).

Проведение опыта

Введение растворов на протяжении всего опыта проводят со скоростью 0,1 мл в секунду и интервалом между введениями не менее 5 мин.

В начале опыта проверяют чувствительность животного к гистамину. Для этого в вену последовательно вводят стандартный образец в разведении 1 и разведении 2 в объеме 0,2 мл на 1 кг массы. Животных, у которых при введении стандартного образца в разведении 2 в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы величина артериального давления снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают.

После проверки чувствительности животного к гистамину определяют величину гипотензивной реакции введением стандартного образца в разведении 1 в объеме 0,2 мл раствора на 1 кг массы тела. Введение гистамина повторяют, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимают за стандартное в данных условиях опыта.

Затем кошке однократно вводят раствор ИП. Тест-доза и растворитель указаны в частном нормативном документе.

ИП считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение стандартного образца в разведении 1.

При испытании на одном животном двух и более ИП необходимо периодически проводить определение величины снижения артериального давления в ответ на введение стандартного образца в разведении 1. В случае значительного уменьшения величины реакции артериального давления по сравнению со стандартной величиной, полученной в начале опыта, необходимо вновь проверить чувствительность животного к действию стандартного образца в разведении 2, как описано выше. Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм рт. ст., испытание ИП продолжают в соответствии с указанными выше требованиями.

30. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ (ОФС 42-0065-07)

Биологической оценке подлежат:

1. Листья наперстянки пурпуровой, крупноцветковой и их лекарственные препараты.

2. Лекарственные препараты наперстянки шерстистой.

3. Трава, лекарственные препараты горицвета.

4. Трава, листья, цветки ландыша, лекарственные препараты ландыша, сложные лекарственные формы, содержащие настойку ландыша.

5. Семена и лекарственные препараты строфанта.

6. Трава и семя желтушника раскидистого (серого), сложные лекарственные формы, содержащие лекарственные препараты желтушника серого.

Принцип метода биологической оценки

Биологическая оценка указанных выше лекарственных средств основана на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах систолическую остановку сердца животных.

Активность сердечных лекарственных средств оценивают по сравнению с активностью стандартных образцов и выражают в единицах действия (ЕД).

Испытания проводят на лягушках или кошках. Устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемого лекарственного средства <*>, вызывающие систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1 г испытуемого препарата (ИП), если испытываются лекарственное растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке — при испытании таблеток или в 1 мл, если испытываются жидкие лекарственные формы.

<*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться «испытуемый препарат».

Стандартные образцы и понятие единицы действия

Стандартным образцом при испытании травы, листьев, цветков ландыша, лекарственных препаратов ландыша, сложных лекарственных форм, содержащих настойку ландыша, служат специально изготовленные спиртовые экстракты ландыша, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ.

Стандартными образцами при испытании листьев и лекарственных препаратов наперстянки пурпуровой и крупноцветковой, травы, цветков, листьев и лекарственных препаратов служат специально изготовленные спиртовые экстракты наперстянки названных видов, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ.

Стандартными образцами при испытании других лекарственных растений и полученных из них лекарственных препаратов служат индивидуальные кристаллические гликозиды: при испытании лекарственных препаратов наперстянки шерстистой — целанид-стандарт; при испытании травы, лекарственных препаратов горицвета — цимарин-стандарт; при испытании семян и лекарственных препаратов строфанта — строфантин G-стандарт; при испытании травы и семян желтушника серого — эризимин-стандарт.

Биологическую активность стандартных образцов устанавливают на лягушках-самцах (Rana temporaria) массой 28-33 г при подкожном введении в октябре-ноябре (таких лягушек условно называют «стандартными» или «нормальными»), а также на кошках в определенных условиях опыта.

При испытании на лягушках, разведения стандартных образцов подбирают с таким расчетом, чтобы одна лягушачья единица действия (1 ЛЕД) соответствовала дозе стандартного образца, вызывающей в определенных условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства стандартных подопытных лягушек.

Под 1 ЛЕД ландыша или наперстянки подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртового образца, разведенного в 4 раза водой. Неразведенные стандартные образцы наперстянки и ландыша содержат в 1 мл 13,33 ЛЕД.

Под 1 ЛЕД цимарина, целанида подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации:

                       цимарина                     1:13333
                       целанида                     1:5000

Под 1 ЛЕД строфантина G, эризимина подразумевают специфическую биологическую активность 0,4 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации:

                       строфантина G                1:20000
                       эризимина                    1:25000

При испытании сердечных лекарственных средств на кошках активность ИП выражают в кошачьих единицах действия.

Под одной кошачьей единицей действия (1 КЕД) подразумевают дозу стандартного образца или ИП из расчета на 1 кг массы животного, вызывающую систолическую остановку сердца кошки и устанавливаемую в определенных условиях опыта. Эта доза является смертельной.

Разведения стандартного образца или ИП подбирают с таким расчетом, чтобы 1 КЕД содержалась примерно в 15 мл раствора.

НА ЛЯГУШКАХ

Отбор лягушек и их содержание

Для опытов пригодны лягушки-самцы видов: травяная (Rana temporaria) массой 28-40 г; водяная — озерная (Rana ridibunda) и прудовая (Rana esculenta) массой 30-70 г.

Лягушек содержат в течение зимы в бассейне с проточной водой, в полутемном помещении при температуре от 3 до 8 град. C.

Сохраняемые зимой в бассейне лягушки могут быть сразу использованы для опыта. Весной и летом свежепойманные лягушки должны быть выдержаны до начала опыта в бассейне с проточной водой в течение 2-3 сут. Температура воды в бассейне в теплое время года не должна превышать 15 град. C. Помещение лаборатории, где проводят биологические испытания, должно быть светлым, но защищенным от попадания прямых солнечных лучей, температура воздуха в нем — 15-22 град. C. В лаборатории должна быть раковина для содержания подопытных лягушек, в которую их помещают за 1-1,5 ч до проведения опыта.

Техника испытания и принцип расчета

Отбирают партию лягушек одного вида, возможно близких друг к другу по массе. Взвешивание животных проводят непосредственно перед опытом с точностью до 0,5 г с отклонениями от средней массы в группе не более чем на +/- 2,5 г: 28-33, 30-35, 35-40 и до 65-70 г.

Лягушек по 5 штук укрепляют на досках брюшком кверху с предельно вытянутыми конечностями, булавки вкалывают в верхнюю часть морды и в суставы передних и задних конечностей.

Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней треугольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сторону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просвечивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже места наложения пинцета, так что образуется узкое поперечное оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким (глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сердечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими надавливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При препарировании следят за тем, чтобы через образованное отверстие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце свободно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное сердце каждые 15-20 мин. смачивают 0,6% раствором натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли на обнаженное сердце).

Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу) или в сердце (в полость желудочка); на водяных — в сердце (в полость желудочка) или в вену; под кожу — только растворы, содержащие гликозиды ландыша.

Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят одинаковые дозы испытуемого раствора.

Испытуемые препараты предварительно разводят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора содержали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц действия лекарственного средства умножают на количество миллилитров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, если в 1 мл препарата «Коргликон раствор 0,06% для инъекций» содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 x 0,3 = 3,99), то препарат следует развести 1:4.

1. Метод испытания при введении под кожу. Растворы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности.

После введения раствора наблюдают за лягушками и определяют наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку сердца у большинства (3-4) из 5 лягушек данной группы в течение 1 ч, если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета, или в течение 2 ч, если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты строфанта или желтушника. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, продолжают наблюдение еще 10 мин. (при длительности наблюдения 1 ч) и учитывают также количество лягушек, у которых остановка сердца наступила в дополнительное время. Длительность систолической остановки сердца должна быть не менее 15 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 15 мин. после остановки, в расчет не принимают.

В протоколах опытов отмечают время введения ИП и результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое отдельное испытание начинают с определения чувствительности данной партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью нескольким группам лягушек с одинаковой массой тела, по 5 животных в каждой, вводят различные дозы стандартного образца: первой группе — дозу, соответствующую 1 ЛЕД (по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от образца); другим — на 0,05 + 0,1 мл больше. Находят наименьшую дозу стандартного образца, вызывающую остановку сердца у большинства из 5 лягушек. Если остановка наблюдается у всех лягушек, то переходят к испытанию меньшей дозы, а если остановки были у 1 или 2 животных или не наблюдались вообще, то доза ИП увеличивается. Таким образом, определяется чувствительность опытной партии лягушек по сравнению со стандартными лягушками. Затем в тех же условиях опыта группе из 5 лягушек той же партии вводят раствор ИП в дозе, соответствующей найденной наименьшей дозе стандартного образца, и наблюдают за животными в течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какое лекарственное средство испытывается). Если в результате наблюдений будет установлено, что введенная доза недостаточна или слишком велика, дозу увеличивают или уменьшают, причем разница между дозами должна быть не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет найдена наименьшая доза ИП, вызывающая систолическую остановку сердца у большинства из 5 лягушек.

Далее рассчитывают содержание единиц действия (X) в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке ИП.

Для лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов наперстянки, ландыша, горицвета расчет проводят по формуле:

                            B x K

X = --------, 0,3 x A

где: A — наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора ИП;

B — наименьшая доза в миллилитрах, установленная для раствора стандартного образца;

0,3 — доза в миллилитрах, соответствующая 1 ЛЕД;

K — число, обозначающее разведение ИП.

Для лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов строфанта и желтушника расчет проводят по формуле:

                            B x K

X = --------. 0,4 x A

2. Метод испытания при введении в полость желудочка сердца. Испытуемые растворы, предварительно освобожденные от избытка спирта (не должен превышать 10%) и летучих веществ, в соответствующем разведении вводят лягушкам непосредственно в полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в 5 с, проколов его в момент диастолы тонкой иглой, соединенной со шприцем с делением 0,02 мл. Иглу вынимают из полости желудочка во время систолы, чтобы избежать кровотечения в месте укола.

Для определения наименьшей дозы раствора стандартного образца и ИП травяным лягушкам вводят примерно 0,2 мл лекарственного препарата наперстянки, ландыша, горицвета или 0,3 мл лекарственного препарата строфанта, желтушника. Допустимое отклонение между вводимыми дозами — 0,02 мл.

При определении активности на водяных лягушках рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела. Для того чтобы не рассчитывать каждый раз дозу на введение, предлагается таблица расчетных доз (табл. 30.1). Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.

Таблица 30.1

внутривенным путем

Длительность наблюдения за лягушками — 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника — 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 5 мин. после остановки, в расчет не принимают.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке испытуемого образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но значения A и B зависят от принципа расчета доз, т.е. от вида применяемых лягушек:

A — наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора ИП;

B — наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора стандартного образца.

3. Метод испытания при введении в вену. У лягушек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней поверхности после отведения в сторону лоскутов кожи с каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее колено петли вены лягушки.

При введении лягушкам внутривенным способом растворов cтандартных образцов и ИП в соответствующем разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих веществ, рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела (табл. 30.1).

Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену одинаковые дозы раствора cтандартного образца или ИП тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл, со скоростью 0,1 мл за 5 с. После каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки — 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника — 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин.; о результатах судят по изменениям, наступающим в дополнительное время.

Определение наименьшей дозы стандартного образца и ИП, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства лягушек (не менее 3) из 5, проводят так же, как при введении под кожу. Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки.

Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.

Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке ИП по формулам, приведенным для подкожного введения, но с другими обозначениями A и B:

A — наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора ИП;

B — наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора cтандартного образца.

НА КОШКАХ

Отбор кошек и их содержание

Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беременных и не лактирующих, массой 2,0-3,5 кг, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 2-3 сут. За 16-20 ч до начала опыта животных лишают пищи, но не воды.

Техника испытания и принцип расчета

Опыт проводят под легким наркозом (например, 200-250 мг/кг гексенала в мышцу бедра). В отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю, соединенную тонкой каучуковой трубкой, с градуированной бюреткой вместимостью 50-100 мл, откуда поступает раствор ИП, приготовленный на 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций. На пути между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик, помещенный на водяную баню с температурой 39 град. C для поддержания постоянной температуры (37 град. C) вводимого раствора. В резиновую трубку, соединяющую стеклянный змеевик с канюлей, вставляют с помощью стеклянного тройника термометр, показывающий температуру жидкости, поступающей к животному. Жидкость из бюретки вытекает под постоянным давлением, что достигается введением в бюретку стеклянного капилляра внешним диаметром не более 1 мм, укрепленного при помощи каучуковой пробки в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда Мариотта). Длина капилляра должна быть такова, чтобы его нижний конец доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость вытекания жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима, наложенного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким образом, чтобы в вену животного в 1 мин. поступал 1 мл испытуемого раствора. Можно использовать другое оборудование, позволяющее соблюдать указанную скорость введения и температуру испытуемого раствора. Введение раствора проводят до наступления остановки сердца. Длительность опыта должна составлять не менее 30 и не более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по исчезновению сердечного толчка и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. При наличии патологических изменений в органах опыт в расчет не принимают.

Оценку активности ИП можно проводить двумя способами:

1. по сравнению со стандартным образцом;

2. в кошачьих единицах действия (КЕД).

1. Оценка активности ИП по сравнению со стандартным образцом.

В опыт берут не менее 12 кошек: по 6 животных, как для стандартного образца, так и для ИП. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут. без повторного испытания.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу «Обработка результатов определения биологической активности сердечных гликозидов на кошках» общей фармакопейной статьи «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний».

Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если отношение _ стандартного отклонения среднего результата S_ к средней смертельной дозе y y не превышает 5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов.

    ИП  считают прошедшим испытание, если отношение средних смертельных доз
ИП  и  стандартного  образца составляет 90-110%, а их разность не превышает
величины S  x t.

      d

2. Определение активности ИП в КЕД. Для выражения активности ИП в кошачьих единицах действия (КЕД) расчет проводят для каждого животного по формуле:

                       K x m

A = ------, a

где: K — разведение ИП;

m — масса животного в килограммах;

a — доза разведенного ИП в миллилитрах.

Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД и вычисляют (в КЕД и процентах) отклонения результатов отдельных опытов от среднего числа КЕД.

Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет меньше максимально допустимого отклонения для данного числа опытов, указанного в табл. 30.2.

Таблица 30.2

от среднего значения

Из табл. 30.2 следует, что испытания можно проводить на 3 кошках (минимальное число опытов), но только в том случае, если полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4%. В противном случае, число опытов следует увеличить.

Таблица 30.3

раствора строфантина K 0,05% для инъекций

Среднее число КЕД = 3,33

31. СТЕРИЛЬНОСТЬ (ОФС 42-0066-07)

Лекарственные средства для инъекций и инфузий, глазные капли, мази, пленки и другие препараты и субстанции, в отношении которых имеются соответствующие указания в документации, должны быть стерильными, то есть не содержать микроорганизмов.

Методы контроля стерильности применяют для испытания всех лекарственных средств независимо от их природы и лекарственной формы.

1. Условия проведения испытания

Испытание на стерильность проводят в асептических условиях, чтобы избежать микробной контаминации во время посева, используя, например, ламинар-бокс класса А, расположенный в зоне класса В, или изолятор. Можно применять и другие меры, предотвращающие контаминацию, при условии, что они не оказывают пагубное влияние на микроорганизмы, которые могут содержаться в исследуемых образцах. Условия проведения испытания регулярно контролируют в соответствии с правилами GMP.

2. Определение антимикробного действия

До проведения испытания на стерильность следует определить, обладает ли исследуемый образец антимикробным действием, которое может существенно повлиять на результаты испытания.

Для этого готовят взвеси культур тест-микроорганизмов (табл. 31.4) с конечной концентрацией не более 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Испытание проводят дважды с каждым микроорганизмом в отдельности.

В пробирки с 10 мл питательной среды, рекомендованной для испытания, вносят по 1 мл приготовленной взвеси тест-микроорганизма.

В две пробирки с инокулированной средой вносят по 1 мл исследуемого образца, в две другие вносят по 1 мл соответствующего растворителя — положительный контроль. Посевы на тиогликолевой среде инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 3-х сут. Посевы на жидкой соево-казеиновой среде и среде Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут.

Сравнивают рост тест-микроорганизмов в контрольных и опытных посевах при визуальном просмотре. Если результаты неодинаковые, то есть, в контроле наблюдают рост тест-микроорганизма, а в опыте рост отсутствует, считают, что исследуемый образец обладает бактериостатическим или фунгистатическим действием.

2.1 Устранение антимикробного действия

При наличии антимикробного действия исследуемого образца используют специфические инактиваторы, указанные в нормативных документах. Например, парааминобензойная кислота для сульфаниламидов, бета-лактамаза для пенициллинов и цефалоспоринов.

Неспецифические инактиваторы (твин-20, твин-80, яичный лецитин, гистидина гидрохлорид, натрия тиосульфат и другие) добавляют в буферный раствор и (или) в питательные среды, как правило, до стерилизации.

Для разведения исследуемого образца перед испытанием на стерильность можно использовать нейтрализующую жидкость, приготовленную в лаборатории или промышленного производства, следующего состава:

    Полисорбата-80 (твина-80)                             - 30,0 г
    Лецитина яичного (или соевого)                        - 3,0 г
    L-гистидина гидрохлорида                              - 1,0 г
    Пептона (мясного или казеинового)                     - 1,0 г
    Натрия хлорида                                        - 4,3 г
    Калия фосфата однозамещенного                         - 3,6 г
    Натрия фосфата двузамещенного                         - 7,2 г
    Воды                                                  - 1000 мл

Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации.

pH после стерилизации 7,0 +/- 0,2.

Если разведение в вышеприведенном растворе не устраняет антимикробное действие исследуемого образца, то увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина. Альтернативно допускается добавление в буферный раствор специфических инактиваторов, устраняющих антимикробное действие лекарственных средств или консервантов (табл. 31.1).

Таблица 31.1

Инактиваторы антимикробного действия консервантов

При отсутствии инактиватора исследуемый образец разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды, или используют метод мембранной фильтрации.

3. Испытание на стерильность

3.1 Отбор образцов для анализа

Для испытания отбирают образцы лекарственного средства в количестве, указанном в табл. 31.2, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Таблица 31.2

исследуемого образца для проведения анализа

При вскрытии образцов не допускают их контаминации микроорганизмами, которые могут находиться на его внешней поверхности. Ампулы и пробки флаконов протирают спиртом этиловым ректификованным 96% и фламбируют.

3.2. Для посева на каждую питательную среду используют количество исследуемого образца, приведенное в табл. 31.3, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Таблица 31.3

питательные среды

3.3 Метод мембранной фильтрации

При определении стерильности лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным действием, и лекарственных средств в сосудах вместимостью более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. Исключение составляют лекарственные средства с антимикробным действием, нерастворимые в воде или изопропилмиристате.

Испытание проводят с использованием фильтрационной установки, которая должна быть смонтирована таким образом, чтобы исследуемый раствор (жидкость) можно было ввести и профильтровать в условиях асептики. После окончания фильтрации мембрану асептически переносят в 100 мл питательной среды. Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при скорости вытекания воды 55-75 мл в 1 мин.

Допускается использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую систему и работающего также по принципу фильтрации растворов, с мембраной, вмонтированной в канистру, в которую после фильтрования добавляют стерильную среду. Используют мембранные фильтры с размером пор 0,45 +/- 0,02 мкм и внешним диаметром 47 мм. Фильтры из нитрата целлюлозы используются для водных, масляных и слабых спиртовых растворов, фильтры из ацетата целлюлозы — для концентрированных спиртовых растворов и др. Гидрофобный край фильтра и низкая сорбционная способность сводят к минимуму потери препарата при фильтрации.

Для лекарственных средств, не обладающих бактериостатическим или фунгистатическим действием, можно использовать фильтры без гидрофобного края, увлажняя их перед фильтрацией, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Установки и фильтры стерилизуют и хранят в условиях, гарантирующих сохранение стерильности.

При исследовании лекарственных средств в виде раствора в масле, фильтр и установка перед анализом должны быть тщательно высушены.

3.3.1 Пробоподготовка водных растворов

Лекарственное средство в упаковке перемешивают, отбирают необходимое для испытания количество исследуемого образца (табл. 31.3) и асептически переносят на один или несколько фильтров.

Мембранную фильтрацию проводят с помощью вакуума или давления. Фильтры асептически снимают с фильтродержателя и помещают в обе среды. При использовании замкнутой системы канистры заполняют равным объемом сред. При этом следует избегать аэрации тиогликолевой среды.

Если исследуемый образец обладает антимикробным действием или в его состав входит консервант, то для промывания фильтров используют раствор натрия хлорида изотонический 0,9% или жидкость № 1 (раздел 3.4.). Испытание проводят, исключая контаминацию микроорганизмами последней порции жидкости для промывания.

3.3.2 Пробоподготовка жидкостей, не смешивающихся с водой

Испытание проводят, как указано в разделе 3.3.1.

Перед помещением на фильтр вязких жидкостей или суспензий для увеличения скорости фильтрации к общей пробе асептически добавляют достаточное количество подходящего растворителя.

Если в состав исследуемого образца входят лецитин, масло или консервант и при наличии антимикробного действия, то для промывания фильтров используют жидкость № 2 (раздел 3.4.). Испытание проводят, исключая контаминацию микроорганизмами последней порции жидкости для промывания.

3.3.3 Пробоподготовка лекарственных средств, растворимых в изопропилмиристате (ИПМ)

Мази на жировой основе и эмульсии типа «вода в масле» растворяют в ИПМ, предварительно простерилизованном методом мембранной фильтрации с использованием мембран с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный растворитель и, если необходимо, исследуемый образец непосредственно перед фильтрацией нагревают до температуры не более 44 град. C.

Первоначально через мембрану пропускают стерильный ИПМ в количестве 5 мл. Затем фильтруют раствор препарата в ИПМ. Для максимальной эффективности процесса над фильтром постоянно должен быть слой раствора во время фильтрации. После фильтрации мембрану промывают вначале двумя порциями жидкости № 2, по 200 мл каждая, а затем 100 мл жидкости № 1.

При испытании в питательные среды добавляют твин-80 из расчета 1 г/л.

Если в состав лекарственного средства входит вазелин, для промывания фильтров используют жидкость № 3. Перед началом фильтрации через фильтр пропускают 200 мл жидкости № 3. Для максимальной эффективности процесса над фильтром постоянно должен быть слой раствора во время фильтрации. После фильтрации образца фильтр промывают тремя порциями жидкости № 3 (раздел 3.4.) по 100 мл каждая.

3.3.4 Пробоподготовка препаратов в шприц-тюбиках

Содержимое каждого шприц-тюбика переносят в две воронки установки для мембранной фильтрации или собирают общую пробу в стерильную пробирку для последующего переноса на фильтр.

3.3.5 Пробоподготовка твердых лекарственных форм для инъекций (кроме антибиотиков)

Готовят разведение в соответствии с инструкцией по применению. Испытание проводят в соответствии с разделами 3.3.1. и 3.3.2.

3.3.6. Пробоподготовка стерильных аэрозольных препаратов Содержимое препаратов в аэрозольной упаковке асептически извлекают и помещают в стерильную колбу нажатием на шток распылительного клапана. Если возможно, пропеллент удаляют путем испарения. Добавляют в колбу жидкость № 2 и осторожно перемешивают.

Испытание проводят, как указано в разделах 3.3.1. и 3.3.2.

3.4 Жидкости для промывания мембранных фильтров при контроле лекарственных средств, обладающих антимикробным действием

Для промывания фильтров можно использовать любой растворитель, не подавляющий рост микроорганизмов:

• Раствор натрия хлорида изотонического 0,9% стерильного pH 7,0.
• Жидкость № 1:1 г ферментативного пептона растворяют в 1000 мл воды, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают в сосуды и стерилизуют.

pH после стерилизации — 7,1 +/- 0,2.

При фильтровании образцов пенициллинов или цефалоспоринов (если необходимо) к жидкости № 1 добавляют определенное количество бета-лактамазы, указанное в частной фармакопейной статье, достаточное для инактивации остаточного антимикробного действия антибиотика на фильтре.

• Жидкость № 2:1 мл твина-80 добавляют к 1000 мл жидкости № 1, разливают в сосуды и стерилизуют.

pH после стерилизации — 7,1 +/- 0,2.

• Жидкость № 3:5 г ферментативного пептона, 3 г мясного экстракта и 10 г твина-80 растворяют в 1000 мл воды, разливают в сосуды и стерилизуют.

pH после стерилизации — 6,9 +/- 0,2.

3.5 Валидация метода мембранной фильтрации при контроле лекарственных средств, обладающих антимикробным действием

Фильтруют определенный объем исследуемого образца, используя для одного фильтра количество единиц (ампул, флаконов и т.д.), указанное в табл. 31.2. Фильтр промывают как минимум тремя порциями соответствующей жидкости по 100 мл каждая. В последнюю порцию жидкости для промывания вносят 1 мл приготовленной микробной взвеси тест-микроорганизмов: B.subtilis АТСС 6633 — для тиогликолевой среды; C.albicans NCTC 885-653 — для соево-казеинового бульона или жидкой среды Сабуро. Концентрация тест-штаммов — не более 100 КОЕ/мл. Фильтр помещают в колбу со 100 мл соответствующей питательной среды или добавляют среду в канистру замкнутой системы.

Посевы инкубируют при соответствующей температуре в течение не более 3-х сут. для бактерий и 5 сут. для грибов.

Определяют наличие роста тест-микроорганизма при визуальном просмотре. При наличии роста считают, что антимикробное действие полностью инактивировано, и проводят испытание на стерильность, используя то же количество препарата, количество единиц (ампул, флаконов и т.п.), объем жидкости для промывания и те же питательные среды.

При отсутствии роста тест-микроорганизма считают, что антимикробное действие не инактивировано, и испытание повторяют, увеличивая объем жидкости для промывания фильтра. Однако общий объем жидкости, пропущенный через мембрану, не должен превышать 1000 мл.

3.6 Метод прямого посева

3.6.1 Пробоподготовка нефильтрующихся жидкостей

Асептически отбирают объем исследуемого образца (табл. 31.3), достаточный для посева на питательные среды. Слегка перемешивают среду сразу после посева, чтобы не вызвать сильную аэрацию. Далее проводят испытание, как указано в разделе 3.7.

3.6.2 Пробоподготовка лекарственных средств, нерастворимых в изопропилмиристате (ИПМ)

Растворы в маслах. В питательную среду предварительно добавляют 10 г/л твина-80 или другого эмульгатора в концентрации, не оказывающей антимикробного действия в условиях испытания.

Мази и кремы. Отбирают 20 образцов и разделяют их на 2 группы по 10 в каждой. Исследуемые образцы эмульгируют в разведении 1:10 с помощью подходящего эмульгатора в соответствующем стерильном растворителе, например, жидкости № 1. Полученную эмульсию вносят в питательную среду, не содержащую эмульгатора.

Если исследуемый образец обладает антимикробным действием в условиях испытания, его устраняют путем добавления подходящих инактиваторов (например, твина-80, количество которого указывают в частной фармакопейной статье) или увеличивают количество питательной среды.

Посевы образцов растворов в маслах ежедневно аккуратно перемешивают. Однако в том случае, когда тиогликолевая или аналогичная ей среда применяется для выявления анаэробных микроорганизмов, встряхивание или перемешивание должно быть сведено к минимуму для того, чтобы не нарушать анаэробных условий.

Если в состав лекарственного средства входят трудноэмульгируемые жиросодержащие продукты, допускается использование определенного эмульгатора соответствующей концентрации в стерильном растворителе с одновременным нагреванием образца до 40 град. C (в исключительных случаях — до 45 град. C) в течение не более 30 мин.

3.6.3 Пробоподготовка твердых лекарственных форм

Лекарственное средство в виде порошка или суспензии (если в сосуд добавляют стерильный растворитель) переносят в количестве, указанном в табл. 31.3, в жидкую тиогликолевую среду, жидкую соево-казеиновую среду или жидкую среду Сабуро и осторожно перемешивают. Далее проводят испытание, как указано в разделе 3.7.

3.7 Условия инкубации посевов

Посевы инкубируют не менее 14 сут. при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C на жидкой тиогликолевой среде и при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C на жидкой соево-казеиновой среде или жидкой среде Сабуро (независимо от метода посева), периодически просматривая питательные среды.

Наличие роста микроорганизмов определяют визуально. Если исследуемый образец вызывает помутнение питательной среды и визуально нельзя определить наличие или отсутствие роста микроорганизмов, через 14 сут. после начала испытания переносят не менее 1 мл помутневшей среды в пробирки с той же стерильной средой. Инкубируют исходные и повторные посевы. Общее время инкубации должно составлять не менее чем 14 + 4 сут. от начала испытания.

3.8 Интерпретация результатов испытания

При отсутствии роста микроорганизмов считают, что исследуемый образец соответствует требованиям испытания.

При наличии роста микроорганизмов, наблюдаемом визуально и подтверждаемом микроскопическим исследованием, считают, что исследуемый образец не соответствует требованиям испытания на стерильность, если не доказана недостоверность испытания, вызванная причинами, не связанными с исследуемым образцом. Результаты испытания могут быть признаны недостоверными в случае, если выполняется одно или несколько условий:

1. получены неудовлетворительные результаты микробиологического контроля окружающей среды в ходе проведения испытания;

2. выявлены ошибки, допущенные в ходе испытания;

3. обнаружен рост микроорганизмов в отрицательном контроле;

4. после идентификации микроорганизмов, выделенных из исследуемого образца, однозначно признано, что причиной возникновения роста этого вида или видов являются материалы и/или технические приемы, использованные при испытании;

5. если питательная среда нестерильна и/или ее ростовые свойства неудовлетворительны.

Если результаты испытания признаны недостоверными, его повторяют на том же количестве образцов, что и первоначально.

Если в результате повторного испытания не обнаруживают роста микроорганизмов, считают, что препарат выдерживает испытание на стерильность.

Если в результате повторного испытания обнаруживают рост микроорганизмов, считают, что препарат не выдерживает испытание на стерильность.

4. Питательные среды

4.1 Состав и приготовление питательных сред

Для испытания используют жидкую тиогликолевую среду, жидкую соево-казеиновую среду или жидкую среду Сабуро. Жидкую тиогликолевую среду применяют для выявления аэробных и анаэробных бактерий. Жидкую соево-казеиновую среду или жидкую среду Сабуро применяют для выявления грибов.

Используют питательные среды, приготовленные в лаборатории, или сухие питательные среды промышленного производства. В этом случае следует строго придерживаться методики приготовления, рекомендованной производителем.

Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин. при температуре 121 град. C, при условии валидации процесса стерилизации.

Все среды проверяют на стерильность и определяют их ростовые свойства.

Жидкая тиогликолевая среда:

    L-цистина                                                   - 0,5 г
    Натрия хлорида                                              - 2,5 г
    Глюкозы моногидрата                                         - 5,5 г
    Агара гранулированного (влажность не более 15%)             - 0,75 г
    Дрожжевого экстракта (водорастворимого)                     - 5,0 г
    Панкреатического гидролизата казеина                        - 15,0 г
    Натрия тиогликолята                                         - 0,5 г
    или кислоты тиогликолевой                                   - 0,3 г
    Раствора резазурина натрия (1:1000)                         - 1,0 мл

свежеприготовленного

Воды — 1000,0 мл

pH после стерилизации — 7,1 +/- 0,2

Добавляют в воду L-цистин, агар, натрия хлорид, глюкозу, водорастворимый дрожжевой экстракт и панкреатический гидролизат казеина и нагревают до полного растворения. Добавляют натрия тиогликолят или тиогликолевую кислоту и, если необходимо, доводят pH среды 1 М раствором натра едкого. Добавляют раствор резазурина, перемешивают и разливают в пробирки соответствующего объема. Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации.

Жидкая соево-казеиновая среда:

    Панкреатического гидролизата казеина                        - 17,0 г
    Папаинового гидролизата соевой муки                         - 3,0 г
    Натрия хлорида                                              - 5,0 г
    Калия фосфата двузамещенного                                - 2,5 г
    Глюкозы                                                     - 2,5 г
    Воды                                                        - 1000,0 мл

pH после стерилизации — 7,3 +/- 0,2

Компоненты растворяют в воде, если необходимо при нагревании. Охлаждают при комнатной температуре. Если требуется, добавляют 1 М раствор натра едкого, чтобы после стерилизации pH среды был 7,3 +/- 0,2. Фильтруют для получения прозрачной среды, разливают по пробиркам и стерилизуют в автоклаве.

Жидкая среда Сабуро:

    Пептона ферментативного                                     - 10,0 г
    Глюкозы моногидрата                                         - 40,0 г
    Воды                                                        - 1000,0 мл

pH после стерилизации — 5,6 +/- 0,2

Пептон и глюкозу добавляют в воду и полностью растворяют при слабом нагревании. Охлаждают до комнатной температуры и доводят pH до требуемого значения. Фильтруют, если необходимо, и разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации.

Для определения стерильности некоторых антибиотиков (пенициллинов, цефалоспоринов) методом прямого посева асептически вносят в питательные среды определенное количество бета-лактамазы, указанное в частной фармакопейной статье, для инактивации антибиотика.

4.2 Стерильность питательных сред

После стерилизации не менее 5% пробирок от каждой партии питательной среды помещают в термостат и инкубируют в течение как минимум 14 сут. параллельно с посевом на стерильность.

4.3 Определение ростовых свойств питательных сред

Ростовые свойства питательных сред определяют для каждой серии питательной среды, выпущенной промышленностью и имеющей номер серии, и для каждой партии среды, приготовленной в лаборатории.

В 2 пробирки со средой вносят культуру тест-штамма, каждого отдельно, в количестве 10-100 КОЕ (табл. 31.4). Инкубируют в соответствии с условиями, описанными в табл. 31.4. Если в течение времени инкубации в инокулированных средах визуально отмечают рост микроорганизмов, среду считают пригодной для использования.

Таблица 31.4

питательных сред и определения антимикробного действия

АТСС — Американская коллекция типовых культур, США.

ГИСК — Государственная коллекция патогенных микроорганизмов

ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Россия.

NCTC — Национальная коллекция типовых культур.

4.4 Хранение питательных сред

Питательные среды, приготовленные в лаборатории, хранят при температуре от 2 до 25 град. C в защищенном от света месте в течение не более 1 мес. Если при хранении тиогликолевой среды, содержащей резазурин, верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет, то среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в течение 10-15 мин. до исчезновения розовой окраски, с последующим быстрым охлаждением. Если окраска не исчезает после нагревания, то среду считают не пригодной к употреблению. Регенерацию среды можно проводить только один раз.

Питательные среды промышленного производства, готовые к употреблению, хранят в плотно укупоренных сосудах при условии сохранения их стерильности и ростовых свойств в течение срока годности.

Сухие питательные среды промышленного производства хранят в соответствии с инструкцией по использованию и уничтожают по истечении срока годности, указанного производителем.

32. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧИСТОТА (ОФС 42-0067-07)

Нестерильные лекарственные средства (субстанции, различные формы препаратов — таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии, сиропы, мази, суппозитории и др., а также вспомогательные вещества) могут быть контаминированы микроорганизмами. В них допускается наличие лимитированного количества микроорганизмов, при отсутствии определенных видов бактерий, представляющих опасность для здоровья человека.

Приведенные ниже методы определения микробиологической чистоты распространяются на нестерильные лекарственные средства (субстанции и препараты), вспомогательные вещества и полупродукты, а также используются при определении эффективности антимикробных консервантов и мониторинге производственных помещений фармацевтических предприятий и лабораторий контрольных служб.

В табл. 32.1 и 32.2 приведены требования к лекарственным средствам (лекарственным препаратам и субстанциям), а также вспомогательным веществам, используемым в производстве лекарственных препаратов.

Таблица 32.1

Микробиологическая чистота лекарственных препаратов

Таблица 32.2

лекарственных препаратов

Примечания к табл. 32.1 и 32.2

1. В нормативных документах могут быть указаны в виде исключения и другие нормы в зависимости от состава препарата и особенностей технологического процесса производства.

2. В нормативных документах на препараты для детей должны быть введены более жесткие нормы, а именно: количество аэробных бактерий в 1 г или в 1 мл — в пределах от 100 до 500, количество грибов — от 10 до 50, отсутствие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

3. При обнаружении во время проведения испытания других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ не соответствует требованиям по показателю «микробиологическая чистота».

Испытание на микробиологическую чистоту включает способы подготовки образцов различных лекарственных форм перед испытанием, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных бактерий и грибов, выявление и идентификацию отдельных видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в нестерильных лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы и реактивы.

Испытание проводят в асептических условиях, чтобы предотвратить контаминацию исследуемых образцов.

1. Определение антимикробного действия лекарственного средства

Перед проведением контроля необходимо определить, обладает ли исследуемое лекарственное средство в условиях испытания на микробиологическую чистоту антимикробным действием, подавляющим рост отдельных видов бактерий и грибов, так как это может привести к неправильной оценке результатов анализа.

Для определения антимикробного действия используют тест-микроорганизмы, представленные в табл. 32.3.

Таблица 32.3

антимикробного действия

Кроме вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать и другие микроорганизмы из различных коллекций, типичные по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства.

1.2 Работа с тест-микроорганизмами

Ампулы с лиофилизированными культурами бактерий и грибов вскрывают в асептических условиях и вносят в них около 0,5 мл соответствующей жидкой питательной среды (например, среда № 8 — для бактерий, жидкая среда Сабуро — для C.albicans). Полученную взвесь тест-культур переносят в пробирки с теми же жидкими питательными средами и инкубируют при соответствующей температуре в течение 24 ч (бактерии) или 48 ч (C.albicans). После 2-3-х пассажей с бульона на бульон культуру микроорганизмов пересевают с помощью бактериологической петли на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше, считая полученную культуру исходной.

Культуру A.niger пересевают на агар Сабуро и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут. до появления конидий (экзогенных спор черного или темно-коричневого цвета).

Культуры бактерий пересевают каждый месяц, грибов — каждые 3 месяца, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего используют новую ампулу или исходную культуру со среды хранения.

Тест-штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град. C в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова.

Тест-культуру C.albicans хранят под слоем стерильного вазелинового масла на среде № 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 0,5%. Тест-культуру A.niger хранят на среде № 2.

При пересеве культур со сред хранения предварительно удаляют слой масла над агаром, бактериологической петлей снимают верхний слой агара с выросшей культурой и переносят его в пробирки со средой № 8 для бактерий, жидкой средой Сабуро — для C.albicans. Посевы на среде № 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро — при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч для C.albicans. Для получения конидий культуру A.niger пересевают на среду № 2 и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут.

1.2.1 Приготовление спор B.subtilis

Если не удается получить гомогенную взвесь клеток B.subtilis, используют споры, получаемые следующим образом.

Культуру B.subtilis выращивают в пробирке на скошенном соево-казеиновом агаре или среде № 1 в течение 24 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Смывают 5 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида со стерильными стеклянными бусами. Взвесь бактерий переносят в матрац с 300 мл скошенного питательного агара, содержащего для ускорения спорообразования марганца сульфат в количестве 1 мг/л среды. Посевы инкубируют в течение 7 сут. при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Для подтверждения достаточного образования спор выросшую культуру микроскопируют. Если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90% спор, делают смыв культуры, внося в матрац 45 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Нагревают полученную взвесь 30 мин. на водяной бане при температуре 65 град. C, центрифугируют при 4300 об./мин. в течение 15 мин., отмывают не менее 3 раз стерильным 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида до полной прозрачности надосадочной жидкости. Снова нагревают на бане при температуре 65 град. C в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин., ресуспендируют осадок (споры) в том же растворе, определяют количество спор в 1 мл чашечным агаровым методом. Хранят суспензию спор при (5 +/- 1) град. C в запаянных ампулах или пробирках не менее 8 недель.

1.3 Проведение испытания

Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов.

1.3.1 Разведение лекарственного средства

Готовят необходимые разведения лекарственного средства 1:10, 1:50, 1:100, 1:500 и 1:1000 методом последовательных разведений, используя фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0 (п. 4.2.).

1.3.2 Приготовление инокулята

    24-часовые  бульонные культуры бактерий на соево-казеиновом бульоне или
среде  N  8  и  48-часовую  культуру  C.albicans  на бульонной среде Сабуро
разводят  стерильным  раствором  натрия  хлорида  0,9% изотоническим 1:1000

(B.cereus, C.albicans) и 1:100000 (E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus) 4 до концентрации около 10 КОЕ/мл. Взвесь спор B.subtilis также разводят до 4

концентрации  10   в  1  мл.  Культуру  A.niger смывают со скошенного агара
Сабуро  или  со  среды  N  2 фосфатным буферным раствором с 0,05% твина-80.
Определяют  количество  конидий  в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или

                                                  4

чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 10 КОЕ/мл.

1.3.3 Метод определения антимикробного действия в условиях испытания на микробиологическую чистоту

Каждое разведение препарата в количестве 1 мл вносят в 6 чашек Петри диаметром 90 мм, в две из которых добавляют по 0,2 мл взвеси спор B.subtilis, в две другие — по 0,2 мл взвеси культуры C.albicans, в 2 последние — 0,2 мл взвеси конидий A.niger. Чашки с бактериями заливают 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (47,5 +/- 2,5) град. C питательного агара, чашки с культурами грибов — тем же количеством среды Сабуро. По 1,0 мл каждого разведения препарата вносят в пробирки с 10 мл жидких сред № 3 и № 8 (или аналогичных), куда затем добавляют по 1 мл взвеси Е.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus соответственно средам, каждый микроорганизм отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений препарата вносят такое же количество растворителя. Опыт ставят в двойной повторности. Посевы на средах № 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч (среды № 3, 8) и 5 сут. (среда № 1). Посевы на среде № 2 инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут.

После окончания сроков инкубации отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках без препарата и наличие или отсутствие роста тест-штаммов на средах с различными разведениями препарата. В случае помутнения или изменения окраски среды, затрудняющих учет результатов, делают пересевы на агаризованные среды. При росте типичных колоний E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus отмечают отсутствие антимикробного действия исследуемого препарата.

1.3.4 Метод репликаций

Для водонерастворимых (суспензии, эмульсии и др.) или окрашенных соединений предпочтительно использовать метод репликаций.

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого препарата. В контрольные чашки вносят по 1 мл разбавителя, используемого для получения разведений. В чашки Петри как в эксперименте, так и в контроле, добавляют по 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (45 +/- 2) град. C соево-казеинового агара или среды № 1, в другие — такое же количество среды Сабуро и тщательно перемешивают. Опыт ставят в двойной повторности.

После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды, на которую затем бактериологической петлей, пипеткой или репликатором наносят инокулят (п. 1.3.2.) каждого тест-штамма бактерий и грибов в виде бляшек на среды № 1 и № 2 (или аналогичные) соответственно. Чашки с соево-казиновым агаром или средой № 1 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч. Чашки со средой Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение не более 5 сут.

1.4 Учет и интерпретация результатов

Наличие такого же роста тест-микроорганизмов, как в контроле, обозначают знаком «+», отсутствие роста — знаком «-», слабый, замедленный или угнетенный рост — знаком «+/-». Если по сравнению с контролем на средах с препаратом наблюдают заметное уменьшение количества колоний на чашках (более 70%) или отсутствие роста тест-микроорганизмов, делают заключение о наличии антимикробного действия.

Первое из последовательных разведений препарата, в котором отсутствует антимикробное действие, используют для посева на соответствующую питательную среду.

1.5 Способы устранения антимикробного действия лекарственных средств

Для устранения антимикробного действия препаратов применяют следующие методы:

• Используют соответствующие специфические инактиваторы (например, парааминобензойную кислоту (ПАБК) и бета-лактамазу), нейтрализующие антимикробное действие препарата, но не угнетающие рост микроорганизмов, контаминирующих НЛС.
• Используют неспецифические инактиваторы, добавляя в буферный раствор и/или в питательные среды: твин-20, твин-80, соевый или яичный лецитин и др. Для разведения лекарственного средства перед испытанием на микробиологическую чистоту можно использовать стерильную нейтрализующую жидкость.

Если разведение в вышеприведенном растворе не инактивирует антимикробные свойства лекарственного средства, увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина. Альтернативно допускается добавление в буферный раствор других веществ, инактивирующих антимикробное действие лекарственных средств.

• Увеличивают разведение препарата, взяв больший объем растворителя в пределах норм допустимой микробной загрязненности.
• Применяют метод мембранной фильтрации с последующей промывкой фильтров, если позволяет природа исследуемого лекарственного средства, т.е. препарат растворим в воде или в изопропилмиристате (ИПМ).

1.5.1 Инактивация некоторых антибиотиков

Для инактивации пенициллинов и цефалоспоринов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспендирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды перед их употреблением, асептически вносят стерильный раствор бета-лактамазы в количестве, указанном в частной фармакопейной статье.

1.5.2 Инактивация сульфаниламидных препаратов

Для инактивации сульфаниламидных препаратов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспен-дирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды до стерилизации вносят парааминобензойную кислоту (ПАБК) из расчета 0,05 г/л среды, если антимикробное действие не удается устранить путем разведения.

1.5.3 Инактивация консервантов, входящих в состав лекарственных средств

Для инактивации консервантов, входящих в состав ряда лекарственных препаратов, в буферный раствор, в котором эмульгируют образец, а также в питательные среды до стерилизации вносят следующие неспецифические инактиваторы: 3% твина-80 или 0,3% лецитина (яичного или соевого) от объема среды. В случае, если в препарате имеется более 2 консервантов различной химической структуры, в среду вносят 0,3% лецитина; 3% твина-80; 0,1% L-гистидина и 0,5% натрия тиосульфата одновременно.

Инактиваторы антимикробного действия консервантов лекарственных средств указаны в табл. 32.4.

Таблица 32.4

лекарственных средств

В качестве растворителя для устранения антимикробного действия используют также нейтрализующую жидкость лабораторного или промышленного изготовления следующего состава:

    Твина-80                                                      - 30,0 г
    Лецитина (яичного или соевого)                                - 3,0 г
    Гистидина гидрохлорида                                        - 1,0 г
    Пептона (мясного или казеинового)                             - 1,0 г
    Натрия хлорида                                                - 4,3 г
    Калия фосфата однозамещенного                                 - 3,6 г
    Натрия фосфата двузамещенного                                 - 7,2 г
    Воды очищенной                                                - 1000 мл

Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации

pH после стерилизации — 7,6 +/- 0,2

Если в связи с природой лекарственного средства, нерастворимого в воде или изопропилмиристате, нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в отношении конкретного тест-микроорганизма неэффективны, этот вид испытания не проводят.

2. Особенности отбора и подготовки образцов для анализа

От каждой исследуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, отбирают образец для анализа из достаточного количества разных упаковок препарата (не менее 3-5).

2.1 Твердые лекарственные формы

2.1.1 Образец для анализа

При анализе препарата используют 10 г образца для определения общего числа бактерий и грибов в 1 г препарата, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus и E.coli, 10 г образца — для определения Salmonella, 10 г — для количественного определения других энтеробактерий, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

2.1.2 Таблетки, драже, гранулы, порошки и др.

10 г образца (если другое количество не указано в частной фармакопейной статье) измельчают (в случае необходимости) в стерильных фарфоровых ступках или с помощью специального оборудования и переносят в 100 мл буферного раствора. Далее проводят количественное и качественное определение микроорганизмов.

2.1.3 Капсулы

10 г образца переносят в 100 мл буферного раствора, содержащего не более 5% твина-80 и нагретого до температуры не выше 40 град. C. После суспендирования капсул в буферном растворе проводят количественное и качественное определение микроорганизмов.

2.2 Мягкие лекарственные формы

2.2.1 Образец для анализа

При анализе используют 10 г препарата для определения общего числа бактерий и грибов, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus, E.coli в 1 г препарата, 10 г образца — для испытания на наличие бактерий сем. Enterobacte-riaceae в 1 г препарата, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

2.2.2 Мази, линименты, кремы, суппозитории, легко смешиваемые с водой

10 г образца помещают в стерильную колбу, содержащую 100 мл буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов.

2.2.3 Мази, линименты, кремы, суппозитории, трудно смешиваемые с водой

10,0 г образца смешивают со стерильным твином-80, количество которого не должно быть более 1/2 объема образца (в данном случае 5 г). Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до температуры не выше 40 град. C (в исключительных случаях — до 45 град. C) и осторожно перемешивают. При этом время нагревания не должно превышать 30 мин. Добавляют необходимое количество предварительно нагретого до соответствующей температуры стерильного фосфатного буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь осторожно перемешивают для получения гомогенной эмульсии в разведении 1:10, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов.

При необходимости готовят последующие десятикратные разведения, используя фосфатный буферный раствор, содержащий соответствующую концентрацию стерильного твина-80.

2.3 Жидкие лекарственные формы

2.3.1 Образец для анализа

При анализе препарата используют 10 мл образца для определения общего числа бактерий и грибов в 1 мл препарата, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus и E.coli, 10 мл образца — для количественного и качественного определения E.coli и других энтеробактерий, 10 мл — для определения Salmonella.

2.3.2 Растворы, суспензии, сиропы, микстуры

10 мл образца переносят в 90 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов.

2.3.3 Растворы в маслах, эмульсии

10 мл образца помещают в стерильную колбу, содержащую 90 мл буферного раствора с твином-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов.

2.4 Аэрозоли

2.4.1 Образец для анализа

При анализе препарата используют 3 г образца для определения общего числа аэробных бактерий и грибов в 1 г препарата и испытания на наличие Raeruginosa, S.aureus, 3 г образца — для испытания на наличие бактерий семейства Enterobacteriaceae. Образец отбирают путем многократных нажатий на шток клапана (насадку).

2.4.2 Аэрозоли на основе спиртов

3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов.

2.4.3 Аэрозоли на основе масел

3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора с твином-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов.

2.4.4 Аэрозоли на основе твердых веществ

3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов.

2.5 Трансдермальные пластыри

2.5.1 Образец для анализа

При отборе трансдермальных пластырей используют образец, состоящий из 20 единиц.

2.5.2. С каждого из 10 пластырей снимают защитную пленку, пользуясь стерильными инструментами. При необходимости разрезают пластырь стерильными ножницами на более мелкие фрагменты, которые переносят в колбу емкостью 1000 мл, содержащую 500 мл стерильного буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм, нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C, энергично встряхивают в течение 30 мин.

50 мл полученного смыва используют для количественного определения микроорганизмов методом мембранной фильтрации, а также для выделения Raeruginosa, S.aureus.

Для выделения и количественного определения энтеробактерий используют следующие 10 пластырей, которые вносят в лактозный бульон (среду № 11).

Если известно, что пластырь обладает антимикробным действием, в разбавитель добавляют подходящий инактиватор (твин-80 и/или лецитин).

Если смыв с трансдермальных пластырей нерастворим и нельзя использовать метод мембранной фильтрации, применяют метод прямого посева на питательные среды.

2.6 Лекарственные растительные средства

Особенности пробоподготовки цельного, измельченного сырья, фильтр-пакетов, брикетов представлены в ОФС «Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья или нескольких (сборов) — фасованная продукция, а также растительного сырья „ангро“.»

3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов

Представленные методы предназначены для количественного определения мезофильных бактерий и грибов, которые растут в аэробных условиях.

3.2 Количественное определение микроорганизмов

В зависимости от природы лекарственного средства и его физико-химических свойств используют один из вариантов чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный, поверхностный, модифицированный глубинный), метод мембранной фильтрации или пробирочный метод наиболее вероятных чисел (НВЧ).

3.2.1 Чашечный агаровый метод

Для культивирования микроорганизмов используют агаризованные питательные среды: соево-казеиновый агар или среду № 1, сухую, для контроля микробной загрязненности — для выращивания бактерий, агар Сабуро или среду № 2, сухую, для контроля микробной загрязненности — для выращивания грибов.

Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, посевы на среде для выращивания бактерий инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C, а на среде для грибов — при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C.

Для каждого разведения образца используют не менее 2-х чашек Петри с определенной средой.

После расплавления среды охлаждают до температуры (45 +/- 5) град. C и вносят в чашки Петри в необходимом количестве.

Глубинный метод

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 15-20 мл агаризованной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют посевы.

Двухслойный метод

Агаризованные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают.

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в пробирку с 4 мл соответствующей расплавленной и охлажденной питательной среды, быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят на поверхность застывшего и подсушенного агара в чашке Петри, равномерно распределяя верхний слой среды вращательными движениями. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

Поверхностный метод

Расплавленные и охлажденные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. Поверхность агара в чашках подсушивают.

Образец, приготовленный для анализа, наносят на агар в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды.

Чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

Модифицированный глубинный метод

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 7-10 мл расплавленной и охлажденной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют. Учет результатов производят через 48-72 ч.

Учет результатов посевов чашечными методами

Посевы просматривают ежедневно. Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительный результат) и через 5 сут. (окончательный результат).

Для получения достоверных результатов отбирают чашки, где число колоний бактерий находится в пределах от 30 до 300, а колоний грибов — от 10 до 100. Если при учете результатов двух последующих разведений число колоний на чашках находится в указанных выше пределах, рассчитывают результаты из меньшего разведения.

Если в среднем на чашках выросло более 300 колоний бактерий или более 100 колоний грибов, делают ряд дальнейших последовательных разведений образца, выбирая подходящее для посева.

Если в среднем на чашках выросло менее 30 колоний бактерий и менее 10 колоний грибов, делают расчет количественного содержания бактерий и грибов по имеющимся результатам.

Если на питательной среде отсутствует рост микроорганизмов, результаты отмечают следующим образом: при посеве лекарственного средства в разведении 1:10 — «В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 10 бактерий (или грибов)», при посеве лекарственного средства в разведении 1:100 -«В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 100 бактерий (или грибов)» и т.д.

Количество микроорганизмов в 1 г или в 1 мл рассчитывают по формуле:

                               с

N = ---- x d, n

где: N — количество микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл;

c — сумма колоний на всех чашках;

n — число чашек;

d — коэффициент разведения образца.

    При  подсчете  количества микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл образца,
полученный  результат  выражают  в  виде  числа  в  пределах от 1,0 до 9,9,

               x

умноженного на 10 , где x — соответствующий показатель степени основания

10.                                 -2
    

Пример. При посеве из разведения 10 на двух чашках выросло 168 и 215 колоний:

                                 168 + 215      2
                             N = ---------- х 10  = 19150.

                                 2

Полученный результат округляют до двух значащих цифр — 19000 и 4 записывают как 1,9 х 10 .

Интерпретация результатов

При необходимости подсчета общего количества микроорганизмов (бактерий и грибов суммарно) в 1 г или в 1 мл лекарственного средства следует сложить число аэробных бактерий с числом грибов.

3.2.2 Метод мембранной фильтрации

Метод мембранной фильтрации используют для количественного определения микроорганизмов в лекарственных средствах, обладающих или не обладающих антимикробным действием. Метод применим только для растворов и водорастворимых лекарственных средств, а также для жиросодержащих препаратов, растворимых в изопропилмиристате.

Для посева используют мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм, способные эффективно задерживать микроорганизмы, что подтверждается валидацией. Установка для мембранной фильтрации должна быть такой конструкции, из которой можно извлечь фильтры и перенести их на питательные среды. Материал мембраны следует выбирать таким образом, чтобы компоненты исследуемого препарата не влияли на его эффективность. Фильтры из нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов (менее 30%), из ацетата целлюлозы — для спиртовых растворов (более 30%), кислот, щелочей. Мембранную фильтрацию проводят в асептических условиях с помощью вакуума.

Образец, как правило, растворяют в буферном растворе в соотношении 1:10. В воронку фильтровальной установки вносят сначала промывную жидкость (примерно 5 мл) для смачивания фильтра. Добавляют 10 мл препарата в разведении 1:10, соответствующее 1 г образца, и немедленно фильтруют. В случае наличия антимикробного действия лекарственного средства для отмывания мембраны используют жидкости № 1, 2 или 3. Через фильтр пропускают минимум три порции по 100 мл подходящей стерильной промывной жидкости. При необходимости к промывной жидкости могут быть добавлены поверхностно-активные вещества (например, твин-80) или инактиваторы антимикробного действия. Через одну мембрану можно пропустить не более 1000 мл жидкости. Допускается использование для отмывания мембран менее трех порций промывной жидкости при условии валидации метода.

Смыв с трансдермальных пластырей пропускают через мембранные фильтры по 50 мл (соответствует 1 пластырю) через каждую мембрану. По окончании процесса фильтрации мембраны переносят на соответствующие питательные среды, разлитые в чашки Петри. Чашки с фильтрами переворачивают и инкубируют в термостате.

Учет результатов

Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительные результаты) и через 5 сут. (окончательные результаты). Отбирают чашки, где число колоний бактерий на фильтрах не превышает 100, а грибов — 50, и рассчитывают число микроорганизмов на 1,0 г, или на 1,0 мл образца, или на 1 пластырь. Если на фильтре большее количество микроорганизмов, то делают ряд последовательных разведений образца и выбирают подходящее.

Для того, чтобы определить, полностью ли отмыты мембраны от фильтруемого препарата, обладающего антимикробным действием, после фильтрации раствора в последнюю порцию промывной жидкости вносят по отдельности по 1 мл взвеси B.subtilis ATCC 6633 и С.albicans ATCC 885-653, содержащей от 10 до 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл.

Рост тест-штаммов на фильтрах подтверждает отсутствие антимикробного действия лекарственного средства. Напротив, отсутствие роста определенного микроорганизма свидетельствует о сохранении антимикробного действия лекарственного средства в отношении данного вида микроорганизмов. В этом случае используют специфические или неспецифические инактиваторы или увеличивают объем промывной жидкости.

Жидкости для промывания фильтров

Раствор натрия хлорида изотонического 0,9% стерильного pH 7,0.

Жидкость № 1: 1 г мясного пептона растворяют в 1000 мл воды, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации — 7,0 +/- 0,2.

Жидкость № 2: 1 мл твина-80 добавляют к 1000 мл жидкости № 1, разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации — 6,9 +/- 0,2. Жидкость применяют, если в составе препарата имеется масло.

Жидкость № 3: 5 г мясного пептона, 3 г мясного экстракта и 10 г твина-80 растворяют в 1000 мл воды. Разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации — 6,9 +/- 0,2.

3.2.3 Метод наиболее вероятных чисел (НВЧ)

Исследуемый образец готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, используя подходящий растворитель. Жидкую питательную среду разливают в 12 стерильных пробирок, по 9 мл в каждую. Пробирки ставят в штатив в 4 ряда по 3 пробирки.

В первый ряд пробирок вносят по 1 мл испытуемого образца в разведении 1:10, во второй ряд — по 1 мл в разведении 1:100, в третий ряд — по 1 мл в разведении 1:1000. В пробирки четвертого ряда вносят по 1 мл разбавителя, который используют для растворения, суспендирования или эмульгирования образца. Посевы инкубируют в течение не более 5 сут.

Учет результатов

Отмечают число пробирок в первом, втором и третьем рядах, в которых визуально наблюдают рост микроорганизмов. Среда в пробирках четвертого ряда (контроль разбавителя) должна оставаться стерильной. Полученное трехзначное число соответствует наиболее вероятному количеству жизнеспособных микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл лекарственного средства, приведенному в табл. 32.5.

Таблица 32.5

Наиболее вероятное число микроорганизмов

Пример. В первом ряду рост микроорганизмов наблюдается в 3-х пробирках, во втором ряду — в 2-х пробирках, в третьем ряду — в 1 пробирке. Полученное число «321» по табл. 32.5 соответствует цифре «150».

Следовательно, наиболее вероятное число бактерий в 1 г или 1 мл исследуемого образца — 150. Если учет результатов не может быть определен точно в связи с природой исследуемого препарата (помутнение среды, изменение ее цвета и т.п.), делают пересев на соответствующую жидкую или агаризованную среду, чтобы убедиться в наличии роста микроорганизмов.

Варианты чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный и модифицированный глубинный) можно использовать при испытании различных лекарственных форм, независимо от уровня микробной загрязненности.

Поверхностный агаровый метод предпочтительнее использовать при испытании нестерильных лекарственных средств с высоким уровнем микробной контаминации.

Для количественного определения в ускоренные сроки бактерий и грибов, колонии которых склонны к сливному росту, используют модифицированный глубинный агаровый метод посева.

Метод мембранной фильтрации используют при испытании растворов водорастворимых лекарственных средств и жиросодержащих лекарственных средств, растворимых в изопропилмиристате.

Метод НВЧ используют при испытании лекарственных средств с низким уровнем микробной контаминации, а также в тех случаях, когда нельзя применить другие методы. Метод НВЧ менее чувствителен и точен по сравнению с чашечным агаровым методом или методом мембранной фильтрации. Метод используется только для определения общего числа бактерий, так как результаты, полученные для определения общего числа грибов, особенно плесневых, считаются недостоверными.

3.2.4 Повторение испытания

В случае необходимости при повышенном уровне контаминации испытание повторяют, используя удвоенное количество препарата.

4. Определение отдельных видов бактерий

Испытание включает использование селективных и дифференциально-диагностических питательных сред, а также сред для предварительной инкубации посевов исследуемых образцов.

4.1 Энтеробактерии и подобные им грамотрицательные микроорганизмы

При выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae могут быть выделены другие подобные им виды микроорганизмов, например, бактерии рода Aeromonas и рода Pseudomonas.

4.1.1 Выделение бактерий

Для восстановления жизнеспособности микроорганизмов, поврежденных во время технологического процесса, используют предварительную инкубацию образца в жидкой питательной среде.

10,0 г или 10,0 мл исследуемого образца переносят в 100 мл лактозного бульона (среда № 11), перемешивают и инкубируют в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. После инкубации перемешивают содержимое флакона (гомогенат А) и переносят 10 мл (количество, соответствующее 1 г или 1 мл образца) в 100 мл среды обогащения (бульон Мосселя, среда № 3). Посев инкубируют в течение 18-48 ч. При появлении роста делают пересев бактериологической петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда № 4), которую инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч.

При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей 10 пластырей помещают в 500 мл лактозного бульона (среда № 11), осторожно встряхивают, избегая вспенивания среды, в течение не менее 15 мин. 50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл среды обогащения (бульон Мосселя, среда № 3) и инкубируют в течение 18-24 ч. При наличии роста в жидкой среде пересевают петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда № 4), которую инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч для выделения энтеробактерии и других грамотрицательных микроорганизмов.

Появление на плотной среде колоний грамотрицательных палочек является свидетельством того, что исследуемый образец контаминирован вышеупомянутыми бактериями.

4.1.2 Количественное определение

Для посева используют три пробирки с 9 мл бульона Мосселя или среды № 3 в каждой. Гомогенат А в количестве 1 мл (соответствует 0,1 г образца) вносят в первую пробирку, тщательно перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,01 г образца) во вторую пробирку, снова перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,001 г образца) в третью пробирку, меняя пипетку после каждого шага (рис. 32.1). Посевы инкубируют в течение 24-48 ч.

энтеробактерий

<pre class="legal-pre">      ┌───────────────────┐   ┌─────────────┐   ┌────────────┐
      │       1 мл        │   │    1 мл     │   │   1 мл     │
      │                   \/  │             \/  │            \/
      │                 ┌──────┐          ┌──────┐        ┌──────┐
  ┌─────────┐           │      │          │      │        │      │
  │         │           │      │          │      │        │      │
  │         │           │      │          │      │        │      │
  │         │           │      │          │      │        │      │
  │         │           │      │          │      │        │      │
  │         │           └──────┘          └──────┘        └──────┘
  └─────────┘           ср. N 3           ср. N 3         ср. N 3</pre>

Гомогенат А 0,1 г 0,01 г 0,001 г

В случае роста, для подтверждения наличия энтеробактерий делают пересев петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда № 4) и инкубируют чашки Петри в течение 18-24 ч. Появление на плотной среде колоний грамотрицательных палочек является положительным тестом, отсутствие роста этих колоний — отрицательным тестом. Наиболее вероятное количество энтеробактерий и других грамотрицательных микроорганизмов в 1 г или 1 мл образца определяют по табл. 32.6.

Таблица 32.6

грамотрицательных бактерий в образце

Обозначения: (+) — положительный тест

(-) — отрицательный тест

4.2 Выявление Escherichia coli

Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон, среда № 8), перемешивают и инкубируют в течение 18-48 ч. 1 мл содержимого флакона переносят в 10 мл бульона Мак-Конки или среды № 3. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч.

При наличии роста, в случае равномерного помутнения среды в пробирках, делают пересев петлей на плотные среды — агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в течение 18-48 ч (агар Мак-Конки) или 18-24 ч (среда № 4). На агаре Мак-Конки E.coli образует красные неслизистые колонии, на среде № 4 — малиновые колонии с металлическим блеском, окруженные малиновыми зонами, неслизистые. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии на плотных средах микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отдельные колонии отсевают на скошенный в пробирках соево-казеиновый агар (среду № 1) и инкубируют в течение 18-24 ч.

Для подтверждения используют биохимические тесты. Из пробирок с чистой культурой делают пересевы на агар Симмонса (среда № 14) и соево-казеиновый бульон (среда № 15), а также проводят тест на наличие фермента цитохромоксидазы. Через 18-24 ч инкубации отмечают бактериальный рост или его отсутствие на агаре Симмонса (среда № 14). Утилизацию цитрата устанавливают по смещению pH-среды в щелочную сторону (изменению цвета среды из зеленого в синий). Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности соево-казеинового бульона (среды № 15) при добавлении реактива Ковача.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано E.coli.

4.2.1 Количественное определение E.coli

Количественное определение E.coli проводят таким же образом, как количественное определение других энтеробактерий (раздел 4.1.2.), делая пересев из гомогената А в пробирки с бульоном Мак-Конки или средой № 3. В случае равномерного помутнения среды в пробирках для подтверждения наличия E.coli из каждой пробирки делают пересев петлей на плотную среду (агар Мак-Конки, среда № 4). Посевы инкубируют в течение 18-48 ч (агар Мак-Конки) или 18-24 ч (среда № 4).

Появление на средах характерных для E.coli колоний грамотрицательных палочек (раздел 4.2.) является положительным тестом, отсутствие роста этих колоний — отрицательным тестом. Наиболее вероятное количество клеток E.coli в 1 г или в 1 мл образца определяют по табл. 32.6.

4.3 Выявление бактерий рода Salmonella

10,0 г или 10,0 мл исследуемого образца переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды № 8, перемешивают и инкубируют в течение 18-24 ч. При наличии роста 1 мл после перемешивания переносят в 10 мл тетратионатного бульона или среды № 12 и инкубируют в течение 16-24 ч. Делают пересев петлей минимум на 2 из 4-х плотных диагностических сред (Дезоксихолат-цитрат агар, Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар, Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой, Висмут-сульфит агар — среда № 5) и инкубируют в течение 24-48 ч. На Дезоксихолат-цитрат агаре бактерии из рода Salmonella образуют хорошо развитые бесцветные колонии. На Ксилоза-лизин-дезоксихолат агаре — хорошо развитые красные колонии с черными центрами или без них. На Агаре с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой — мелкие, блестящие, бесцветные, розовые или опалово-белые колонии, часто окруженные розовой или красной зоной. На Висмут-сульфит агаре (среда № 5) бактерии из рода Salmonella образуют, как правило, черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет.

Колонии, подозрительные на принадлежность к роду Salmonella, микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек 2-3 характерные колонии (каждую отдельно) пересевают на трехсахарный агар с солями железа (среда № 13), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик, не касаясь дна пробирки. Через 24 ч инкубации отмечают изменение цвета из красного в желтый в столбике питательной среды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода — типичном признаке видов рода Salmonella. Параллельно ставят тест на наличие фермента «цитохромоксидаза», используя чистую культуру со скошенного соево-казеинового агара или среды № 1. Если требуется дополнительное подтверждение, можно использовать подходящие биохимические и серологические тесты.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом «цитохромоксидаза», не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано бактериями рода Salmonella.

4.4 Выявление Pseudomonas aeruginosa

Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон, среда № 8), перемешивают и инкубируют в течение 24-48 ч. При наличии роста пересевают петлей на селективную питательную среду для выделения синегнойной палочки (цетримидный агар, цетилпиридиний хлорид (ЦПХ) агар — среда № 16). Выросшие колонии грамотрицательных палочек пересевают на среду № 9 для выявления сине-зеленого пигмента пиоцианин. Посевы инкубируют в течение 24-48 ч.

Для подтверждения видовой принадлежности используют биохимический тест на наличие фермента «цитохромоксидаза» и способность выделенной культуры расти на соево-казеиновом бульоне или среде № 8 при температуре (42 +/- 1) град. C в течение 18-24 ч.

При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей 10 пластырей помещают в 500 мл фосфатного буферного раствора, осторожно встряхивают в течение не менее 15 мин. 50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды № 8 и инкубируют в течение 24-48 ч. После инкубации, при наличии роста, пересевают петлей на селективные среды — цетримидный или ЦПХ-агары. Дальнейшую идентификацию проводят, как указано выше.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, образующие сине-зеленый пигмент пиоцианин, обладающие ферментом «цитохромоксидаза» и растущие при температуре (42 +/- 1) град. C, считают, что лекарственное средство контаминировано P.aeraginosa.

4.5 Выявление Staphylococcus aureus

Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон или среда № 8), перемешивают и инкубируют в течение 24-48 ч. При наличии роста пересевают петлей на селективные питательные среды: агар Фогеля-Джонсона, Берда-Паркера или среду № 10 и инкубируют в течение 24-48 ч. Черные блестящие колонии грамположительных кокков, окруженные желтыми зонами, на среде Фогеля-Джонсона, черные колонии на среде Берда-Паркера или золотисто-желтые колонии, окруженные желтыми зонами, на среде № 10 свидетельствуют о наличии S.aureus.

Для идентификации используют реакцию плазмокоагуляции с чистой культурой стафилококка, отсеянной на соево-казеиновый агар или среду № 1.

При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей, 10 пластырей помещают в 500 мл фосфатного буферного раствора, осторожно встряхивают в течение не менее 15 мин.

50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды № 8 и инкубируют в течение 24-48 ч. После инкубации при наличии роста пересевают петлей на агар Фогеля-Джонсона, Берда-Паркера или среду № 10 для выделения S.aureus.

Если в образце обнаружены грамположительные кокки, ферментирующие маннит (среда Фогеля-Джонсона, среда № 10), обладающие ферментом коагулаза, считают, что лекарственное средство контаминировано S.aureus.

5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов

5.1 Тест на наличие цитохромоксидазы

Реактив: 1% раствор N,N-диметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида.

Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. C во флаконах нейтрального светозащитного стекла. Раствор должен быть бесцветным.

Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом. Платиновой петлей или стеклянной палочкой наносят 24-часовую чистую культуру исследуемых бактерий, выросших на соево-казеиновом агаре или среде № 1. Темно-красное окрашивание, появляющееся в течение 1 мин., свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Положительным контролем служит культура P.aeruginosa, отрицательным — культура E.coli.

5.2 Тест на наличие индола

Реактив Ковача:

    Спирта амилового или изоамилового                               - 75 мл
    Пара-диметиламинобензальдегида                                  - 5 г
    Хлористоводородной кислоты конц.                                - 20 мл

Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной бане при 50-55 град. C), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 град. C. Реактив должен быть желтого цвета. При неправильном хранении цвет реактива становится коричневым, и реактив непригоден для использования.

В пробирку с соево-казеиновым бульоном или со средой № 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача и слегка встряхивают. Через несколько минут при наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке. Положительным контролем является культура E.coli, отрицательным — культура S.abony.

5.3 Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции)

Сухую цитратную кроличью плазму разводят согласно приложенной инструкции 0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В пробирку помещают 1 петлю суточной культуры выделенных кокков, выращенных на соево-казеиновом агаре или на среде № 1. Положительным контролем служит культура S.aureus, отрицательным — культура S.epidermidis. Необходимо поставить также контроль неконтаминированной плазмы. Пробирки инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Реакцию плазмокоагуляции отмечают через каждый час в течение 4-6 ч, слегка наклоняя пробирку, но, не встряхивая ее.

При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции удлиняют время инкубации до 24 ч для получения окончательных результатов.

Тест на наличие коагулазы считается положительным при коагуляции плазмы.

селективных свойств

Для испытания лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.

Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры, а сухие питательные среды — согласно инструкции по применению предприятия-изготовителя. Необходимый pH питательных сред устанавливают при температуре (25 +/- 2) град. C. Среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин. при температуре 121 град. C, если нет других указаний, при условии валидации процесса стерилизации.

Определение ростовых и селективных свойств проводят для каждой серии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории.

Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств.

6.1 Рекомендуемые растворы и питательные среды

• Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0

  Калия фосфата однозамещенного                              3,6 г
  Натрия фосфата двузамещенного                              7,2 г
  Натрия хлорида                                             4,3 г
  Пептона (мясного или казеинового)                          1,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл

• Полужидкий агар для хранения тест-микроорганизмов

  Панкреатического гидролизата казеина                       8,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Агара                                                      5,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,0 +/- 0,2

• Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest Agar)

  Панкреатического гидролизата казеина                       15,0 г
  Папаинового гидролизата бобов сои                          5,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Агара                                                      15,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,3 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания аэробных бактерий — среда № 1 для

контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками (Sabouraud Glucose Agar with antibiotics)

  Пептона (мясного и казеинового)                            10,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        40,0 г
  Агара                                                      15,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      5,6 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов — среда № 2 (агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

Перед употреблением добавляют 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и 0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных растворов или добавляют альтернативно 50 мг хлорамфеникола (левомицетина) на 1 л среды перед стерилизацией.

• Бульон Мосселя для обогащения энтеробактерий (Enterobacteria Enrichment Broth — Mossel)

  Панкреатического гидролизата желатина                      10,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        5,0 г
  Бычьей желчи сухой                                         20,0 г
  Калия фосфата однозамещенного                              2,0 г
  Натрия фосфата двузамещенного                              8,0 г
  Бриллиантового зеленого                                    0,015 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH                                                         7,2 +/- 0,2

Среду нагревают при 100 град. C в течение 30 мин. с последующим быстрым охлаждением.

Отечественная среда обогащения для энтеробактерий — среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Агар Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agai)

  Дрожжевого экстракта                                       3,0 г
  Панкреатического гидролизата казеина                       7,0 г
  Солей желчи                                                1,5 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        10,0 г
  Агара                                                      15,0 г
  Нейтрального красного                                      0,03 г
  Кристаллического фиолетового                               0,002 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH                                                         7,4+/-0,2

Нагревают до кипения. Нельзя нагревать в автоклаве.

Отечественная среда для выделения энтеробактерий — среда № 4 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Бульон Мак-Конки (MacConkey Broth)

  Панкреатического гидролизата желатина                      20,0 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Бычьей желчи сухой                                         5,0 г
  Бромкрезолового пурпурного                                 10,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,3 +/- 0,2

Отечественная среда обогащения для энтеробактерий — среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Агар Мак-Конки (MacConkey Agar)

  Панкреатического гидролизата желатина                      17,0 г
  Пептона (мясного и казеинового)                            3,0 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Солей желчи                                                1,5 г
  Агара                                                      13,5 г
  Нейтрального красного                                      0,03 г
  Кристаллического фиолетового                               0,001 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,1 +/-0,2

Перед стерилизацией кипятят 1 мин., постоянно встряхивая.

Отечественная среда для выделения энтеробактерий — среда № 4 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Дезоксихолат цитрат агар (Deoxycholate Citrate Agar)

  Мясного экстракта                                          10,0 г
  Мясного пептона                                            10,0 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Натрия цитрата                                             20,0 г
  Железа цитрата                                             1,0 г
  Натрия дезоксихолата                                       5,0 г
  Агара                                                      13,5 г
  Нейтрального красного                                      0,02 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH                                                         7,3 +/- 0,2

Доводят до кипения на медленном огне и кипятят в течение 1 мин., охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри. Нельзя нагревать в автоклаве.

• Ксилоза, лизин, дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar)

  Ксилозы                                                    3,5 г
  L-лизина                                                   5,0 г
  Лактозы моногидрата                                        7,5 г
  Сахарозы                                                   7,5 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Дрожжевого экстракта                                       3,0 г
  Фенолового красного                                        0,08 г
  Агара                                                      13,5 г
  Натрия дезоксихолата                                       2,5 г
  Натрия тиосульфата                                         6,8 г
  Железа аммоний цитрата                                     0,8 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH                                                         7,4 +/- 0,2

Доводят до кипения, охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри.

Нельзя нагревать в автоклаве.

• Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, лактозой и сахарозой (Brilliant Green Agar Medium)

  Пептона (мясного и казеинового)                            10,0 г
  Дрожжевого экстракта                                       3,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Сахарозы                                                   10,0 г
  Агара                                                      20,0 г
  Фенолового красного                                        0,08 г
  Бриллиантового зеленого                                    0,0125 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      6,9 +/- 0,2

Кипятят 1 мин. Используют сразу после автоклавирования.

• Висмут-сульфит агар (Bismuth Sulfite agar)

  Мясного экстракта                                          5,0 г
  Мясного пептона                                            10,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        5,0 г
  Натрия фосфата двузамещенного                              4,0 г
  Железа сульфата                                            0,3 г
  Бриллиантового зеленого                                    0,025 г
  Висмута сульфита                                           8,0 г
  Агара                                                      15,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH                                                         7,6 +/- 0,2

Среду не автоклавируют. Приготовленная среда мутная, зеленого цвета.

Отечественная среда для выделения сальмонелл — среда № 5 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Бульон с глюкозой (Dextrose Broth)

  Мясного пептона                                            10,0 г
  Мясного экстракта                                          3,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        10,0 г
  Бромкрезола пурпурного                                     0,02 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации энтеробактерий — среда № 6 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Нитратный бульон (Nitrate Broth)

  Мясного пептона                                            8,6 г
  Натрия хлорида                                             6,4 г
  Калия нитрата                                              1,5 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации энтеробактерий — среда № 7 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth)

  Панкреатического гидролизата казеина                       17,0 г
  Папаинового гидролизата бобов сои                          3,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Калия фосфата двузамещенного                               2,5 г
  Глюкозы моногидрата                                        2,5 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,3 +/- 0,2

Отечественная среда для выращивания бактерий — среда № 8 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Цетримидный агар (Cetrimide Agar)

  Панкреатического гидролизата желатина                      20,0 г
  Магния хлорида                                             1,4 г
  Калия сульфата двузамещенного                              10,0 г
  Цетримида (цетилпиридиния бромида)                         0,3 г
  Агара                                                      13,6 г
  Глицерина                                                  10,0 мл
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для выделения синегнойной палочки — ЦПХ-агар для выделения синегнойной палочки, сухая.

• ЦПХ-агар

  Пептона сухого ферментативного                             20,0 г
  Калия сернокислого                                         7,6 г
  Магния сернокислого семиводного                            2,4 г
  Соды кальцинированной                                      1,0 г
  Фенозан-кислоты                                            0,2 г
  ЦПХ (N-цетилпиридиния хлористого 1-водного)                0,3 г
  Агара                                                      8 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  рН                                                         7,2 +/- 0,2

Среду не стерилизуют.

• Агар для выявления пиоцианина Pseudomonas (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin)

  Панкреатического гидролизата желатина                      20,0 г
  Магния хлорида безводного                                  1,4 г
  Калия сульфата безводного                                  10,0 г
  Агара                                                      15,0 г
  Глицерина                                                  10,0 мл
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде. Нагревают при перемешивании и кипятят 1 мин. Добавляют глицерин и стерилизуют.

Отечественная среда для идентификации синегнойной палочки — среда № 9 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Агар Берда-Паркера (Baird-Parker Agar)

  Панкреатического гидролизата казеина                       10,0 г
  Мясного экстракта                                          5,0 г
  Дрожжевого экстракта                                       1,0 г
  Лития хлорида                                              5,0 г
  Агара                                                      20,0 г
  Глицина                                                    12,0 г
  Натрия пирувата                                            10,0 г
  Воды очищенной                                             950 мл
  pH после стерилизации                                      6,8 +/- 0,2

После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 10 мл стерильного 1% раствора калия теллурита и 50 мл коммерческой желточной эмульсии.

• Агар Фогеля-Джонсона (Vogel-Johnson Agar Medium)

  Панкреатического гидролизата казеина                       10,0 г
  Дрожжевого экстракта                                       5,0 г
  Маннита                                                    10,0 г
  Калия фосфата двузамещенного                               5,0 г
  Лития хлорида                                              5,0 г
  Глицина                                                    10,0 г
  Агара                                                      16,0 г
  Фенолового красного                                        0,025 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 20 мл 1% стерильного раствора калия теллурита.

Отечественная среда для выделения золотистого стафилококка — среда № 10 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Лактозный бульон (Lactose Monohydrate Broth)

  Мясного экстракта                                          3,0 г
  Панкреатического гидролизата желатина                      5,0 г
  Лактозы моногидрата                                        5,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      6,9 +/- 0,2

После стерилизации следует быстро охладить среду.

Отечественная среда для предварительного обогащения энтеробактерий — среда № 11 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Тетратионатный желчный бульон с бриллиантовым зеленым (Tetra-thionate Bile Brilliant Green Broth)

  Пептона                                                    8,6 г
  Бычьей желчи сухой                                         8,0 г
  Натрия хлорида                                             6,4 г
  Кальция карбоната                                          20,0 г
  Калия тетратионата                                         20,0 г
  Бриллиантового зеленого                                    0,07 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  рН                                                         7,0 +/- 0,2

Нагревают до кипения. Нельзя перегревать. Перед употреблением к 1000 мл среды добавляют 20 мл раствора йода с калия йодидом (6 г йода металлического, 5 г калия йодида, 20 мл воды очищенной).

Отечественная среда для выделения сальмонелл — среда № 12 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar-Iron -Agar)

  Мясного экстракта                                          3,0 г
  Дрожжевого экстракта                                       3,0 г
  Пептона (казеинового и мясного)                            20,0 г
  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Лактозы моногидрата                                        10,0 г
  Сахарозы                                                   10,0 г
  Глюкозы моногидрата                                        1,0 г
  Железо-аммоний цитрата                                     0,3 г
  Натрия тиосульфата                                         0,3 г
  Фенолового красного                                        0,025 г
  Агара                                                      12,0 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,4 +/- 0,2

Среду разливают в пробирки, наполняя их на 1/3 объема. После стерилизации среду скашивают таким образом, чтобы образовались столбик и косяк.

Отечественная среда для идентификации сальмонелл — среда № 13 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

• Цитратный агар Симмонса

  Натрия хлорида                                             5,0 г
  Магния сульфата                                            0,2 г
  Аммония дигидрофосфата                                     1,0 г
  Калия гидрофосфата                                         1,0 г
  Натрия цитрата                                             3,0 г
  Бромтимолового синего                                      0,08 г
  Агара                                                      20 г
  Воды очищенной                                             1000 мл
  pH после стерилизации                                      7,2 +/- 0,2

Отечественная среда для идентификации E.coli — среда № 14 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.

Примечание. Входящие в состав питательных сред индикаторы и красители добавляют в виде растворов определенной концентрации.

6.2 Ростовые и селективные свойства питательных сред

Основными биологическими критериями качества питательных сред являются их ростовые и селективные свойства, определяемые с помощью микроорганизмов и стандартных питательных сред. В качестве стандартных используют среды, готовые к употреблению, с сертификатом производителя, а также аттестованные в лаборатории среды высокого качества.

Ростовые свойства — это способность питательной среды обеспечивать эффективный и типичный рост соответствующих микроорганизмов.

Селективные свойства — это способность питательной среды частично или полностью подавлять рост сопутствующих микроорганизмов (ассоциантов) при обеспечении роста тест-штаммов.

Тест-микроорганизмы, штаммы-ассоцианты и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред представлены в табл. 32.7.

Приготовление рабочей взвеси микроорганизмов

    Культуры  бактерий  и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара
стерильным  0,9%  раствором  натрия  хлорида.  Готовят  стандартные  взвеси
каждого  тест-штамма,  соответствующие  10 Единицам по стандартному образцу
мутности  ОСО  42-28-85.  Для  культур Bacillus subtilis, Bacillus cereus и

                                       7

Candida albicans — это концентрация 10 КОЕ/мл, для Escherichia coli, 9

Salmonella  abony,  Pseudomonas  aeruginosa,  Staphylococcus  aureus  - 10
КОЕ/мл.  Стандартные  взвеси  методом  последующих десятикратных разведений
                                                                    2     3
доводят  стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 10  и 10

КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации рабочих взвесей бактерий и 3 C.albicans, высевают поверхностным методом из концентрации 10 КОЕ/мл по 0,1 мл на чашку с соответствующей агаризованной средой.

Для смыва конидий A.niger с агара Сабуро используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий в 1 мл взвеси определяют с помощью камеры Горяева или посевом подходящего разведения на агар Сабуро.

Для посева готовят рабочую взвесь A.niger с концентрацией конидий 3 0,5 x 10 в 1 мл, которую высевают поверхностным методом по 0,1 мл на чашки с агаром Сабуро.

Приготовленные рабочие взвеси монокультур используют для определения ростовых и селективных свойств питательных сред. Для определения селективных свойств дополнительно готовят посевную дозу, состоящую из равных количеств рабочих взвесей тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта, при этом количество КОЕ штамма-ассоцианта должно быть на 2 порядка выше.

Определение ростовых свойств агаризованных сред

    Испытуемую  и  стандартную  агаризованные среды разливают в чашки Петри
диаметром  90  мм  по  15  мл,  подсушивая агар после застывания. По 0,1 мл

                                                      3

рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 10 КОЕ/мл засевают поверхностным методом на чашки с испытуемой и стандартной средами в тройной повторности.

На агаризованных средах после инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по формуле:

                             N

К = ----, № o

где:

    N - среднее арифметическое  число колоний на чашке с испытуемой средой;
    N  - среднее  арифметическое  число  колоний  на чашке  со  стандартной
     o   средой.

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой.

Определение ростовых свойств жидких сред

    Жидкие   испытуемые   и   стандартные  питательные  среды  разливают  в
стерильные  пробирки  размером 15x150 мм по 10 мл. По 1,0 мл рабочей взвеси

                                     2

тест-микроорганизма  с  концентрацией  10  КОЕ/мл  засевают в 3  пробирки с
каждой  средой.  Рост  микроорганизмов  определяют  визуально по помутнению

и/или изменению цвета среды после периода инкубации. Из пробирок, в которых 3 наблюдается рост, после предварительного разведения до 10 КОЕ/мл делают пересев по 0,1 мл на соответствующую стандартную агаризованную среду. После

инкубации   описывают  морфологические  особенности  колоний,  подсчитывают
колонии   тест-микроорганизмов  и  определяют  коэффициент  прорастания  по

указанной выше формуле.

Испытуемая жидкая среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Определение селективных свойств

Для оценки селективных свойств питательных сред испытуемую и стандартную среды заражают взвесью тест-микроорганизмов (монокультура) и параллельно смесью тест-штамма и штамма-ассоцианта в определенной пропорции. В случае нескольких штаммов-ассоциантов каждый из них смешивают с тест-микроорганизмом отдельно.

    Посев  на  агаризованные  среды осуществляют поверхностным методом. В 3
чашки  с  каждой средой (испытуемой и стандартной) вносят по 0,1 мл рабочей

                                      3

взвеси  монокультуры,  содержащей около 10  КОЕ/мл. Параллельно в 3 чашки с
каждой   средой   вносят   по  0,1  мл  посевной  дозы,  содержащей  взвеси
тест-микроорганизма  и  штамма-ассоцианта.  На  всех засеянных чашках после
оптимального  срока инкубации при соответствующей температуре отмечают рост
характерных  колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста

штамма-ассоцианта.

Для посева на жидкие питательные среды (стандартную и испытуемую) аналогично используют монокультуру тест-микроорганизма и посевную дозу тест-микроорганизма со штаммом-ассоциантом. В 3 пробирки каждой среды вносят по 1 мл рабочей взвеси монокультуры тест-микроорганизма. Параллельно в 3 пробирки вносят по 1 мл посевной дозы тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта.

Для качественной оценки селективных свойств среды через 24 ч инкубации делают пересев из каждой пробирки, в которой наблюдают рост, бактериологической петлей на чашки с соответствующей агаризованной средой. После инкубации на чашках должен наблюдаться рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма-ассоцианта.

Для характеристики питательных сред учитывают коэффициент прорастания и селективные свойства, а также морфологию выросших колоний.

Таблица 32.7

питательных сред

ATCC - Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection), Соединенные Штаты Америки.

ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Россия.

IHE - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, Чехия.

CCM - Чешская коллекция микроорганизмов.

Требование к ростовым свойствам питательных сред

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. Испытуемая жидкая (полужидкая) среда считается годной к употреблению, если после инкубации рабочей взвеси и пересеве подходящего разведения на агаризованную среду коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Требование к селективным свойствам питательных сред

Испытуемая селективная питательная среда при посеве тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта должна обеспечивать доминирующий рост тест-микроорганизма при частичном или полном угнетении роста штамма-ассоцианта.

Стерильность

Не менее 10% емкостей (флаконов, пробирок) от каждой партии приготовленной питательной среды контролируют на стерильность, выдерживая их при соответствующей температуре в течение 48-72 ч. При обнаружении микробного роста хотя бы в одной из емкостей, испытанию на стерильность подлежит вся приготовленная партия среды.

Хранение питательных сред

Сухие питательные среды необходимо хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-30 град. C герметично закрытыми. После вскрытия упаковки на флаконе необходимо написать дату и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности.

Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранятся 1 месяц при комнатной температуре или 3 месяца при (5 +/- 1) град. C.

Срок годности сред, разлитых в чашки, составляет 7 дней при температуре (5 +/- 1) град. C.

Исключение составляют чашки со средой N 4, срок годности которых не более 3 сут. без доступа света.

33. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР (ОФС 42-0068-07)

Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата.

<*> Далее "стандартный образец" следует читать "Государственный стандартный образец".

Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мкг". Для большинства антибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных фармакопейных статьях.

При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами.

Стандартные образцы антибиотиков хранятся и используются в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке стандартного образца.

Метод определения. Тест-микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания указаны в табл. 33.1.

В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест-микробом. Если культура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то температура расплавленной среды, в которую вносят тест-микроб, должна быть (49 +/-1) град. C, при использовании суспензии спор - 65-70 град. C. К среде следует добавить такое количество суспензии вегетативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный рост тест-микроба и четкость зон угнетения его роста.

Таблица 33.1

Характеристика культуральных свойств тест-микроба