--- title: "Директива N 2009/156/ЕС Совета Европейского Союза" number: "2009/156/ЕС" issuer: "Европейский Союз" status: утратил силу canonical: "https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24" --- # Статья 24 #### Статья 24 Настоящая Директива адресована государствам-членам ЕС.
Совершено в Брюсселе 30 ноября 2009 г.
От имени Совета ЕС Председатель **S.O.LITTORINEN**
Приложение I **СПИСОК**
**ЗАБОЛЕВАНИЙ, В ОТНОШЕНИИ КОТОРЫХ ОБЯЗАТЕЛЬНО УВЕДОМЛЕНИЕ**
В отношении следующих заболеваний обязательно предоставление уведомления: - дурина;
- сап;
- энцефаломиелит лошадей (все виды, включая вирусный);
- инфекционная анемия лошадей; - бешенство; - сибирская язва; - африканская чума лошадей; - везикулярный стоматит.
Приложение II ТИПОВОЕ ВЕТЕРИНАРНОЕ СВИДЕТЕЛЬСТВО [<а>](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100273) Номер паспорта _____
Я, нижеподписавшийся, подтверждаю, что [b](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100274) идентифицированное ниже животное соответствует следующим требованиям:
a) при проведенном сегодня обследовании животного не было обнаружено клинических признаков болезни;
b) животное не предназначено для забоя в рамках национальной программы уничтожения инфекционных и заразных заболеваний;
c) - животное не ввозится с территории или части территории государства-члена ЕС, в отношении которой установлены ограничения, связанные с африканской чумой лошадей, либо
животное ввозится с территории или части территории государства-члена ЕС, в отношении которой были установлены ветеринарные запреты и были получены удовлетворительные результаты проведенных в отношении животного анализов, предусмотренных [статьей 5 (5)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100117) Директивы 2009/156/ЕС на станции карантина ________ в период с_______ по __________ [c](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100275)
- животное не было привито против африканской чумы лошадей, либо животное было привито против африканской чумы лошадей _________ (дата) [c](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100275) [d](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100276); d) животное не ввозится из хозяйства, в отношении которого были установлены ветеринарные запреты, и не имело контактов с животными семейства лошадиных из хозяйства, в отношении которого были установлены ветеринарные запреты: - в отношении животного, если имеются подозрения о возможности заражения дуриной, - в течение шести месяцев начиная с даты последнего фактического или потенциального контакта с больным животным. Однако в отношении жеребцов запрет применяется до кастрации животного, - в случае сапа или энцефаломиелита - в течение шести месяцев, начиная с даты, когда заболевшие животные были забиты, - в случае инфекционной анемии - до даты, когда после забоя заболевших животных были получены негативные результаты повторного анализа Коггинса, проведенного в отношении оставшихся животных три месяца спустя после первого, - в случае везикулярного стоматита - в течение шести месяцев с даты последнего случая заболевания, - в случае бешенства - в течение одного месяца с даты последнего случая заболевания, - в случае сибирской язвы - в течение 15 дней с даты последнего случая заболевания, - если все животные, подверженные обнаруженному в хозяйстве заболеванию, были забиты и на территории хозяйства проведена дезинфекция, - в течение 30 дней начиная с даты, когда животные были забиты и проведена дезинфекция, за исключением случаев сибирской язвы, когда запрет действует в течение 15 дней; e) насколько мне известно, животное не имело контактов с животным семейства лошадиных, у которого имеется инфекционное или заразное заболевание, в течение 15 дней до даты составления данного свидетельства; f) на дату обследования животное находится в надлежащем состоянии для транспортировки по запланированному маршруту в соответствии с положениями [Регламента](https://bukva.ai/docs/reglament-12005/statya-1) (ЕС) 1/2005 [e](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100277) | Дата | Место | Печать и подпись официального ветеринара [<*>](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100272) | | --- | --- | --- | | | | | ---
<*> имя печатными буквами и должность.
a Настоящее свидетельство не требуется в случаях, когда имеется двустороннее соглашение в соответствии со [статьей 6](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-6#p100126) Директивы 2009/156/ЕС.
b Действует в течение 10 дней.
c Удалить неприменимое.
d Дата вакцинации должна быть указана в паспорте.
e Настоящее заявление не освобождает перевозчиков от их обязанностей в соответствии с действующим законодательством Сообщества, в частности, относительно состояния перевозимых животных.
Приложение III
**ТИПОВОЙ** **ВЕТЕРИНАРНЫЙ СЕРТИФИКАТ**
В целях торговли между государствами-членами ЕС
**ЖИВОТНЫЕ СЕМЕЙСТВА ЛОШАДИНЫХ**
Европейское сообщество Сертификат для торговли на территории Сообщества ```text ┌──────────┬────────────────────────────┬─────────────────┬────────────────┐ │Часть I: │I.1 отправитель │I.2 Номер │I.2.a Местный │ │подробная │имя │сертификата │номер │ │информация│ ├─────────────────┴────────────────┤ │о партии │адрес │I.3 Центральный компетентный орган│ │ │почтовый индекс ├──────────────────────────────────┤ │ │ │I.4 Местный компетентный орган │ │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │ │I.5 получатель │I.6 Номер связанных сертификатов, │ │ │имя │Номера сопроводительных документов│ │ │ ├──────────────────────────────────┤ │ │адрес │I.7 │ │ │почтовый индекс │ │ │ ├─────────────┬──────────────┼─────────────────┬────────────────┤ │ │I.8 │I.9 Регион │I.10 Страна │I.11 Регион │ │ │Страна │происхождения │назначения Код │назначения код │ │ │происхождения│код │ISO │ │ │ │Код ISO │ │ │ │ │ ├─────────────┴──────────────┼─────────────────┴────────────────┤ │ │I.12 Место происхождения / │I.13 Место назначения │ │ │место разведения │Хозяйство ┌─┐ Сортировочный │ │ │Хозяйство ┌─┐ Сортировочный │ └─┘ │ │ │ └─┘ │центр ┌─┐ Учреждение ┌─┐ Иное ┌─┐ │ │ │центр ┌─┐ Иное ┌─┐ │ └─┘ └─┘ └─┘ │ │ │ └─┘ └─┘ │ │ │ │Имя Номер одобрения │Имя Номер одобрения │ │ │Адрес │Адрес │ │ │Почтовый индекс │Почтовый индекс │ │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │ │I.14 место погрузки │I.15 Дата и время отправления │ │ │Почтовый индекс │ │ └──────────┼────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │I.16 Средство перевозки │I.17 Перевозчик: │ │Авиа ┌─┐ морская ┌─┐ ж/д ┌─┐│Имя Номер одобрения │ │ └─┘ └─┘ └─┘│Адрес │ │Автомобильная ┌─┐ Иное ┌─┐ │ │ │ └─┘ └─┘ │ │ │Идентификация │Почтовый индекс государство-член │ │ │ЕС │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │I.18 описание товара │I.19 Код товара (код CN) │ │ ├──────────────────────────────────┤ │ │I.20 Число/количество │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │I.21 │I.22 Число упаковок │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │I.23 Номер контейнера / │I.24 Тип упаковки │ │печати │ │ ├────────────────────────────┴──────────────────────────────────┤ │I.25 Товар сертифицирован для: │ │Разведение ┌─┐ Зарегистрированные животные семейства лошадиных │ │ └─┘ │ │┌─┐ Забой ┌─┐ │ │└─┘ └─┘ │ │Иное ┌─┐ │ │ └─┘ │ ├────────────────────────────┬──────────────────────────────────┤ │I.26 транзит через третью │I.27 транзит через государство - │ │страну ┌────┐ │член ЕС ┌────┐ │ │ └────┘ │ └────┘ │ │Третья страна код ISO │Государство код ISO │ │Место выезда код │Государство код ISO │ │Место въезда номер BIP │Государство код ISO │ │ │ │ ├────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤ │I.28 Экспорт ┌────┐ │I.29 Оценочное время перевозки │ │ └────┘ │ │ │Третья страна код ISO │ │ │Место выезда код │ │ ├────────────────────────────┴──────────────────────────────────┤ │I.30 Маршрут │ │Да ┌────┐ Нет ┌────┐ │ │ └────┘ └────┘ │ ├───────────────────────────────────────────────────────────────┤ │I.31 Идентификация товара │ │Виды (научное название) Система идентификации │ └───────────────────────────────────────────────────────────────┘ ``` Европейское сообщество Зарегистрированные, предназначенные для развода и размножения, а также для забоя животные семейства лошадиных
Часть II: сертификацияII. Ветеринарная информация <1>II.a номер сертификатаII.b местный номер
Я, нижеподписавшийся, подтверждаю, что описанное выше животное (описанные выше животные) соответствует (соответствуют) следующим требованиям:
II.1 животные были обследованы и при этом не было обнаружено клинических признаков заболевания;
II.2 животные не предназначены для забоя в рамках национальной программы уничтожения инфекционных и заразных заболеваний;
Либо [II.3 животные не ввозятся с территории или части территории государства-члена ЕС, в отношении которой установлены ограничения в связи с африканской чумой животных;]
Или II.3 если животные ввозятся с территории или части территории государства-члена ЕС, в отношении которой установлены ограничения в связи с африканской чумой лошадей, они как минимум в течение 40 дней содержались на карантинной станции ___________ ; в отношении животных был проведен анализ для выявления антител вируса африканской чумы лошадей в соответствии с [Приложением IV к Директиве 2009/156/ЕС, причем анализ проводился одновременно на двух образцах, которые были взяты с промежутком 21 день - 30 дней _____ (укажите дату) и в течение 10 дней до отправки _______ (укажите дату);]
Либо <3> [результаты анализа были негативными, если животные не были привиты от африканской чумы лошадей;]
Или <2> [анализ продемонстрировал, что количество антител не увеличилось, если животные были привиты от африканской чумы лошадей]
Либо <3> [II.4 животные не были привиты от африканской чумы лошадей;]
Или <2> II.4 животные были привиты от африканской чумы лошадей _______(укажите дату),
Либо [<3> как минимум за два месяца до сертификации;]
Или <2> как минимум за два месяца до отправки на станцию карантина;]
II.5 животные не ввозятся из хозяйства (хозяйств), в отношении которого (которых) установлены ветеринарные запреты в связи с наличием по крайней мере одного из следующих факторов:
Либо <3> не все животные вида, подверженного заболеваниям, перечисленным в [пунктах "a" - "g" ниже, были забиты в хозяйстве, и запрет продолжался как минимум:
a) в отношении животных, которые, возможно, заражены дуриной:
Либо <2> шесть месяцев с даты последнего фактического или возможного контакта с больным животным или животным, зараженным Trypanosoma equiperdom;]
Или <2> в отношении жеребца - пока животное не будет кастрировано;
b) в случае сапа - шесть месяцев с даты, когда было забито животное семейства лошадиных, зараженное либо показавшее положительные результаты анализа на наличие Burkholderia mallei или обнаружившее антитела к указанному патогену;
c) в случае лошадиного энцефаломиелита любого вида - в течение шести месяцев с даты забоя заболевшего животного, за исключением случая энцефалита Западного Нила, когда период начинает исчисляться с даты, когда пораженное животное умерло, было вывезено с хозяйства или полностью выздоровело;
d) в случае инфекционной анемии - до даты, когда после забоя заболевших животных были получены негативные результаты повторного анализа Коггинса, проведенного в отношении оставшихся животных три месяца спустя после первого;
e) в случае везикулярного стоматита - в течение шести месяцев с даты последнего случая заболевания;
f) в случае бешенства - в течение одного месяца с даты последнего случая заболевания;]
g) в случае сибирской язвы - в течение 15 дней с даты последнего случая заболевания;]
Или <2> [после обнаружения случаев дурины, сапа, лошадиного энцефаломиелита любого вида, инфекционной анемии лошадей, везикулярного стоматита, сибирской язвы или бешенства все животные видов, подверженных заболеванию, в хозяйстве были забиты, и запрет действовал в течение 30 дней (15 в случае сибирской язвы), начиная с даты, когда после забоя животных была успешно проведена дезинфекция;]
II.6 насколько мне известно, животные не имели контактов с животными семейства лошадиных, зараженными инфекционными или заразными болезнями в течение 15 дней до отправки;
II.7 во время обследования животные находились в надлежащем состоянии для транспортировки по намеченному маршруту в соответствии с положениями Регламента (ЕС) 1/2005 <3>.
Примечания
Часть I
Графа 1.6: соответствует номеру разрешения CITES в отношении животных семейства лошадиных, перечисленных в Вашингтонской конвенции об охраняемых видах.
Графа 1.16: регистрационный номер (ж/д вагоны, контейнеры и грузовые автомобили), номер рейса (авиаперевозка) или название (корабля).
Графа 1.19: используйте соответствующий код Гармонизованной системы (HS) Всемирной таможенной организации: 01.01.01 или 01.01.06.19.
Графа 1.31: виды - лошадь, осел, мул, лошак, зебра (включая виды, полученные путем их скрещивания).
Идентификационная система: до 31 декабря 2009 г. соответствует идентификационному номеру согласно статье 2 Решения 2000/68/ЕС Европейской комиссии, а с 1 января 2010 г. - уникальному номеру согласно статье 2 (2) "d" и разделу 1 (A) (4) приложения I к Регламенту (ЕС) 504/2008.
Часть II
<1> информация в графах 2.1 - 2.6 не требуется при наличии двустороннего договора в соответствии со статьей 6 Директивы 2009/156/ЕС.
<2> Удалите неприменимое.
<3> Настоящее заявление не освобождает перевозчиков от их обязанностей в соответствии с действующим законодательством Сообщества, в частности, относительно состояния перевозимых животных.
- Сертификат действителен в течение 10 дней
- Цвет печати и подписи должен отличаться от цвета остального текста сертификата
Официальный ветеринар или официальный инспектор
Имя (прописными буквами) Квалификация и должность
Местное ветеринарное подразделение Номер соответствующего LVU
Дата Подпись
Печать
Приложение IV **АФРИКАНСКАЯ ЧУМА ЛОШАДЕЙ** **ДИАГНОСТИКА** Реагенты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), описанного ниже, можно получить в Эталонной лаборатории Европейского сообщества или эталонных лабораториях Международного эпизоотического бюро по африканской чуме лошадей. Для выявления специфических антител к AHSV в сыворотках от видов лошадиных используют конкурентный ELISA. Поликлональная, иммунная анти-AHSV сыворотка морских свинок широкого спектра действия (далее "антисыворотка морских свинок") является специфичной в отношении серогрупп, и способна выявить все известные серотипы вируса AHS. Принцип теста заключается в прерывании реакции между антигеном AHSV и антисывороткой морской свинки при помощи образца тест-сыворотки. Антитела к AHSV в образце тест-сыворотки будут конкурировать с антителами в антисыворотке морской свинки, что приводит в результате к редуцированию ожидаемого цвета (после добавления меченых ферментом антител против морских свинок и субстрата). Сыворотки можно проверить в разовом разведении 1 к 5 (капельный метод) или титровать (метод титрования сывороток), чтобы получить конечные точки разведения. Показатели ингибирования выше 50% можно считать положительными. Протокол тестирования, описанный далее в настоящем документе, используется в Региональной эталонной лаборатории по африканской чуме лошадей в Пирбрайте (Соединенное Королевство). ##### 1.1.1 Подготовка планшетов 1.1.1.1. Сенсибилизировать планшеты ELISA антигеном AHSV, экстрагированным из зараженных культур клеток и разведенных в карбонатном/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Инкубировать планшеты ELISA в течение ночи при температуре 4 °C. 1.1.1.2. Промыть планшеты три раза фосфатно-буферным раствором (ФБР), pH 7,2 - 7,4 pH, промокнуть насухо абсорбирующей бумагой. ##### 1.1.2 Контрольные лунки 1.1.2.1. Титровать положительные контрольные сыворотки в серии двукратного разведения от 1 к 5 до 1 к 640 по колонке 1 в блокирующем буфере (PBS, содержащий 0,05% (о/о) Твин-20, 5,0% (в/о) сухого обезжиренного молока (Cadbury's Marvel TM) и 1% (о/о) сыворотки от взрослой коровы), чтобы полученный конечный объем составил 50 мкл/лунку. 1.1.2.2. Добавить 50 мкл отрицательной контрольной сыворотки, разведенной 1 к 5 (10 мкл сыворотки + 40 мкл блокирующего буфера), в лунки A и B колонки 2. 1.1.2.3. Добавить 100 мкл/лунку блокирующего буфера в лунки C и D колонки 2 (пустая). 1.1.2.4. Добавить 50 мкл блокирующего буфера в лунки E, F, G и H колонки 2 (контрольная морская свинка). ##### 1.1.3 Капельный метод 1.1.3.1. Добавить разведение 1 к 5 каждой тест-сыворотки в блокирующий буфер, чтобы удвоить лунки колонок 3 - 12 (10 мкл сыворотки + 40 мкл блокирующего буфера). Или ##### 1.1.4 Метод титрования сыворотки 1.1.4.1. Приготовить серию двукратного разведения каждого образца для испытания (1 к 5 до 1 к 640) в блокирующем буфере через 8 лунок отдельных колонок (3 до 12). Затем 1.1.5. Добавить 50 мкл антисыворотки морских свинок, предварительно разведенных в блокирующем буфере, во все лунки за исключением пустых лунок планшета ELISA (все лунки сейчас содержат конечный объем 100 мкл). ###### 1.1.5.1 Инкубировать на 1 час при 37 °C на орбитальном шейкере. ###### 1.1.5.2 Промыть планшеты три раза и промокнуть досуха, как ранее. 1.1.5.3. Добавить 50 мкл конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика против иммуноглобулина морской свинки, который был предварительно разведен в блокирующем буфере в каждой лунке. ###### 1.1.5.4 Инкубировать на 1 час при 37 °C на орбитальном шейкере. ###### 1.1.5.5 Промыть планшеты три раза и промокнуть насухо, как ранее. ##### 1.1.6 Хромоген Приготовить раствор хромогена (ортофенилдиамина ОФД) в соответствии с инструкциями производителя (0,4 мг/мл в стерильной дистиллированной воде) непосредственно перед использованием. Добавить субстрат (перекись водорода $H_{2}O_{2}$ ), чтобы получить итоговую концентрацию 0,05% (о/о) (1 к 2000 30% раствора $H_{2}O_{2}$ ). Добавить 50 мкл ОФД раствора в каждую лунку и оставить планшеты на рабочей поверхности на 10 минут при средней температуре. Остановить реакцию путем добавления 50 мкл/лунку 1М серной кислоты $(H_{2}SO_{4})$ . ##### 1.1.7 Считывание результатов Спектрофотометрическое считывание результатов при 492 нм. 1.2.1. Используя пакет программного обеспечения, распечатайте показатели оптической плотности (OD), процентного ингибирования (PI) для тестовых и контрольных сывороток на основе среднего показателя, записанного в четырех контрольных лунках с сыворотками от морских свинок. Сведения, выраженные через показатели OD и PI, используют для определения того, проведен ли тест в допустимых пределах. Верхние контрольные пределы (UCL) и нижние контрольные пределы (LCL) варьируются в промежутке показателей OD от 1,4 до 0,4 соответственно. Титр в конечной точке для положительного контроля, основанный на 50% ингибировании, должен быть 1 к 240 (в рамках от 1 к 120 до 1 к 480). Любой планшет, который не соответствует вышеупомянутым критериям, следует отбраковать. Однако если показатель титра положительной контрольной сыворотки больше чем 1 к 180 и образцы для тестирования по-прежнему отрицательные, тогда можно принять отрицательные образцы для тестирования. Лунки с отрицательной контрольной сывороткой в двух повторах и пустые лунки в двух повторах должны фиксировать показатели PI между + 25% и - 25%, между + 95% и 105% соответственно. Невозможность оказаться в этих пределах не позволяет считать планшет недействительным, но показывает образование фонового цвета. 1.2.2. Диагностический порог (точка разделения) для тест-сывороток составляет 50% (PI 50%). Образцы, фиксирующие PI показатели больше 50%, учитывают как положительные. Образцы, которые фиксируют PI показатели ниже 50%, записывают как отрицательные. Образцы, которые фиксируют PI показатели выше и ниже порога для лунок в двух повторах, считают сомнительными. Такие образцы можно повторно протестировать капельным методом и путем титрования. Положительные образцы можно также титровать, чтобы определить показатель степени положительности.
123456789101112
+ve cont.Тест-сыворотки
A1:5-ve cont.31323334353637383940
B1:10-ve cont.31323334353637383940
C1:20Пустая
D1:40Пустая
E1:80GP cont.
F1:160GP cont.
G1:320GP cont.12345678910
H1:640GP cont.12345678910
-ve cont - негативный контроль
+ve cont - позитивный контроль
GP cont. - контроль морской свинки
123456789101112
+ve cont.Тест-сыворотки
A1:5-ve cont.1:51:5
B1:10-ve cont.1:101:10
C1:20Пустая1:201:20
D1:40Пустая1:401:40
E1:80GP cont.1:801:80
F1:160GP cont.1:1601:160
G1:320GP cont.1:3201:320
H1:640GP cont.1:6401:640
-ve cont - негативный контроль
+ve cont - позитивный контроль
GP cont. - контроль морской свинки
Описанный ниже анализ соответствует описанию в главе 2.1.11 Руководства МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин, 4 издание, 2000 г. Рекомбинантный белок VP7 был использован в качестве антигена для выявления антител против вируса AHS с высоким индексом чувствительности и специфичности. Другие преимущества белка заключаются в том, что он стабилен и не является инфекционным. ##### 2.1.1 Твердая фаза 2.1.1.1. Планшеты ELISA сенсибилизируют рекомбинантным VP7 AHSV-4, разведенным в карбонатном/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Инкубировать планшеты в течение ночи при 4 °C. 2.1.1.2. Промыть планшеты пять раз, используя дистиллированную воду, содержащую 0,01% (о/о) Твин 20 (промывочный раствор). Аккуратно встряхните планшет над абсорбирующим материалом, чтобы удалить остатки промывочного раствора. 2.1.1.3. Блокировать планшеты фосфатно-буферным раствором (ФБР) + 5% (в/о) обезжиренного молока (Nestle Dry Skim Milk TM), 200 мкл/лунку на 1 час при 37 °C. 2.1.1.4. Удалите блокирующий раствор и аккуратно встряхните планшет над абсорбирующим материалом. ##### 2.1.2 Образцы для испытаний 2.1.2.1. Образцы сыворотки, которые необходимо протестировать, положительные и отрицательные контрольные сыворотки, разведены 1 к 25 в ФБР + 5% (в/о) обезжиренного молока + 0,05% (о/о) Твин 20, 100 мкл на лунку. Инкубировать на 1 час при 37 °C. Для проведения титрования приготовьте серию двукратного разведения из 1 к 25 (100 мкл/лунку), одна сыворотка на колонку планшета, сделать то же самое с положительными и отрицательными контролями. Инкубировать на 1 час при 37 °C. ###### 2.1.2.2 Промыть планшеты, как описано на [этапе 2.1.1.2](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100490). ##### 2.1.3 Конъюгат 2.1.3.1. Разлить 100 мкл/лунку конъюгированный пероксидазой хрена антилошадиный гамма-глобулин, разведенный в ФБР + 5% молоко Твин 20, pH 7,2. Инкубировать на час при 37 °C. ###### 2.1.3.2 Промыть планшеты, как описано в [пункте 2.1.1.2](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100490). ##### 2.1.4 Хромоген/Субстрат 2.1.4.1. Добавить 200 мкл/лунку раствора хромоген/субстрат (10 мл 80,6 мМ DMAB (диметиламинобензальдегида) + 10 мл 1,56 мМ MBTH (3-метил-2-бензтиазолинон-гидразон гидрохлорида) + 5 мкл $H_{2}O_{2}$ ). Проявление цвета останавливается при добавлении 50 мкл $3NH_{2}SO_{4}$ после приблизительно 5 - 10 минут (до тех пор, как отрицательный контроль начинает окрашиваться). Можно также использовать другие хромогены. Например, ABTS (2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты)), ТМВ (тетраметилбензидин), или OPD (ортофенилдиамин). ###### 2.1.4.2 Снимите показатели с планшетов при 600 нм (или 620 нм). 2.2.1. Рассчитать значение точки разделения путем добавления 0,6 к показателю отрицательного контроля (0,6 стандартное отклонение, полученное с группой 30 отрицательных сывороток). 2.2.2. Образцы для тестирования, дающие показатели абсорбции ниже, чем точка разделения, считают отрицательными. 2.2.3. Образцы для тестирования, дающие показатели абсорбции больше, чем точка разделения + 0,15 считают положительными. 2.2.4. Образцы для тестирования, дающие средние показатели абсорбции, являются сомнительными, и следует использовать второй метод, чтобы подтвердить результат. Блокирующий ELISA разработан, чтобы выявить специфические антитела к вирусу африканской чумы лошадей в сыворотках от восприимчивых видов. VP7 является основным антигенным вирусным белком AHSV и сохраняется в девяти серотипах. Так как моноклональные антитела также выявляют против VP7, то проба даст более высокий уровень чувствительности и специфичности. Далее, антиген рекомбинантного белка VP7 является абсолютно нетоксичным, следовательно, гарантирует высокую степень безопасности. Принцип теста заключается в прерывании реакции между рекомбинантным VP7 как антигеном, связанным с планшетом ELISA, и конъюгированными антителами, специфичными для VP7. Антитела в тестовых сыворотках заблокируют реакцию между антигеном и моноклональными антителами, что приводит в результате к редукции цвета. Тест, описанный далее в настоящем документе, проводят в Эталонной лаборатории Европейского сообщества по африканской чуме лошадей в Альхете, Испания. ##### 3.1.1 Планшеты ELISA 3.1.1.1. Сенсибилизировать планшеты ELISA рекомбинантным VP7 AHSV-4, разведенным в карбонатном/бикарбонатном буфере, pH 9,6. Инкубировать в течение ночи при 4 °C. 3.1.1.2. Промыть планшеты пять раз фосфатно-буферным раствором (ФБР), содержащим 0,05% (о/о) Твин 20 (ФБРТ). 3.1.1.3. Провести стабилизацию планшета путем его обработки стабилизирующим раствором (чтобы обеспечить долгосрочное хранение при 4 °C без потери активности) и промокнуть насухо абсорбирующим материалом. ##### 3.1.2 Образцы для тестирования и контрольные | 3.1.2.1 для скрининга | развести тест-сыворотки и контрольные сыворотки 1 к 10 прямо на планшете в ФБРТ, чтобы получить итоговый объем 100 мкл/лунку. Инкубировать на 1 час при 37 °C. | | --- | --- | | 3.1.2.2 для титрования | подготовить серию двукратного разведения тест-сывороток и положительных контрольных сывороток (100 мкл/лунку) с 1 к 10 до 1 к 280 через 8 лунок. Отрицательный контроль проверяют при разведении 1 к 10. | ##### 3.1.3 Конъюгат Добавить 50 мкл/лунку предварительно разведенных моноклональных антител, конъюгированных пероксидазой хрена (моноклональные антитела, специфические к VP7) в каждую лунку и аккуратно перемешать до получения однородной массы. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C. ##### 3.1.4 Промыть планшеты пять раз при помощи ФБРТ и промокнуть насухо. ##### 3.1.5 Хромоген/Субстрат Добавить 100 мкл/лунку раствора хромоген/субстрат (1 мл ABTS (2,2'-азино-бис 3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) 5 мг/мл + 9 мл субстратного буфера (0,1 М фосфат-цитратный буфер с pH 4, содержащий 0,03% $H_{2}O_{2}$ ) и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Проявление цвета остановить путем добавления 100 мкл/лунку 2% (в/о) SDS (додецилсульфата натрия). ##### 3.1.6 Считывание результатов Считать при 405 нм с помощью ELISA-ридера ##### 3.2.1 Валидация анализа Тест является валидным, когда оптическая плотность (OD) отрицательного контроля (ОК) выше 1,0 и OD положительного контроля (ПК) ниже 0,2. ##### 3.2.2 Расчет точки разделения
Положительная точка разделения = ОК - ((ОК-ПК) x 0,3)
Отрицательная точка разделения = ОК - ((ОК-ПК) x 0,2)
Где ОК является OD отрицательного контроля и ПК является OD положительного контроля. ##### 3.2.3 Интерпретация результатов Образцы с OD ниже, чем положительная точка разделения, необходимо считать положительными к антителам против вируса AHS. Образцы с OD выше, чем отрицательная точка разделения, необходимо считать отрицательными к антителам против вируса AHS. Образцы с OD между этими двумя показателями следует считать сомнительными, и следует повторно взять у животных образцы после 2 - 3 недель. Часть A Отмененная Директива со списком изменений (указана в [статье 22](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-22#p100228)) | Директива 90/426/ЕЭС Совета ЕС
(ОЖ N L 224, 18.8.1990, стр. 42) | | | --- | --- | | Директива 90/425/ЕЭС Совета ЕС
(ОЖ N L 224, 18.8.1990, стр. 29) | Только статья 15 (3) | | Директива 91/496/ЕЭС Совета ЕС
(ОЖ N L 268, 24.9.1991, стр. ) | Только в отношении ссылки на Директиву 90/426/ЕЭС в статье 26 (2) | | Решение 92/130/ЕЭС Европейской комиссии
(ОЖ N L 47, 22.2.1992, стр. 26) | | | Директива 92/36/ЕЭС Совета ЕС
(ОЖ N L 157, 10.6.1992, стр. 28) | Только статья 1 | | Акт о присоединении 1994 г., приложение I, пункт V.E.I.A 3
(ОЖ N С 241, 28.9.1994, стр. 132) | | | Решение 2001/298/ЕЭС Европейской комиссии
(ОЖ N L 102 12.4.2001, стр. 63) | Только в отношении ссылки на Директиву 90/426/ЕЭС в статье 1 (1), и приложении I, пункт 2 | | Решение 2002/160/ЕС Европейской комиссии
(ОЖ N L 53, 23.2.2007, стр. 37) | | | Регламент (ЕС) 806/2003 Совета ЕС (ОЖ N L 122, 16.5.2003, стр. 1) | Только приложение III, пункт 10 | | [Акт](https://bukva.ai/docs/dogovor-mezhdu-korolevstvom-belgiya/statya-1-2#p100054) о присоединении 2003 г., приложение II, пункт 6.B.I.16
(ОЖ N L 236, 23.9.2003, стр. 381) | | | Директива 2004/68/ЕС Совета ЕС
(ОЖ N L 139, 30.4.2004, стр. 321) | Только статья 15 | | Директива 2006/104/ЕС Совета ЕС
(ОЖ N L 363, 20.12.2006, стр. 352) | Только приложение, пункт 1.2 | | Директива 2008/73/ЕС Совета ЕС
(ОЖ N L 219, 14.8.2008, стр. 40) | Только статья 7 | Часть B Список сроков для преобразования в национальное право (указан в [статье 22](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-22#p100228)) | 90/426/ЕЭС
90/425/ЕЭС
91/496/ЕЭС
92/36/ЕЭС
2004/68/ЕС
2006/104/ЕС
2008/73/ЕС | 1 января 1992 г.
1 июля 1992 г.
1 июля 1992 г.
31 декабря 1992 г.
19 ноября 2005 г.
1 января 2007 г.
1 января 2010 г. | | --- | --- | Приложение VI
**КОРРЕЛЯЦИОННАЯ ТАБЛИЦА**
| Директива 90/426/ЕЭС | Настоящая Директива | | --- | --- | | Статья 1 | [Статья 1](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-1#p100050) | | Статья 2 "a" и "b" | [Статья 2 "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100054) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100055) | | Статья 2 "c" | [Статья 2 "c"i"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100059) и ["ii"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100060) | | Статья 2 "d" - "i" | [Статья 2 "d"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100061) - ["i"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-2#p100066) | | Статья 3 | [Статья 3](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-3#p100068) | | Статья 4 (1), (2) и (3) | [Статья 4 (1)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100076), [(2)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100077) и [(3)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100078) | | Статья 4 (4) "i" и "ii" | [Статья 4 (4) "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100080) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100082) | | Статья 4 (5) "a", абзацы 1 - 6 | [Статья 4 (5) "a" "i"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100085) - ["vi"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100090) | | Статья 4 (5) "b" | [Статья 4 (5) "b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100091) | | Статья 4 (6), первый подпараграф абзацы 1 - 8 | [Статья 4 (6), первый подпараграф "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100094) - ["h"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100101) | | Статья 4 (6), подпараграфы 2 и 3 | [Статья 4 (6), подпараграфы 2](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100102) и [3](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-4#p100103) | | Статья 5 (1) | [Статья 5 (1)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100105) | | Статья 5 (2) "a" | [Статья 5 (2), подпараграф 1, "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100107) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100108) | | Статья 5 (2) "b" | [Статья 5 (2), подпараграф 2, "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100110) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100111) | | Статья 5 (2) "c" | [Статья 5 (3)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100112) | | Статья 5 (2) "d" | [Статья 5 (4)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100115) | | Статья 5 (3) "a" и "b" | [Статья 5 (5) "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100118) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100119) | | Статья 5 (3) "c", абзацы 1 и 2 | [Статья 5 (5) "c", подпараграф 1, "i"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100121) и ["ii"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100122) | | Статья 5 (3) "c", второй абзац, последнее предложение | [Статья 5 (5) "c", подпараграф 2](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100123) | | Статья 5 (3) "e" и "d" | [Статья 5 (5) "d"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100124) и ["e"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-5#p100125) | | Статья 6 | [Статья 6](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-6#p100126) | | Статья 7 | [Статья 7](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-7#p100129) | | Статья 8 (1), подпараграф 1, абзацы 1 и 2 | [Статья 8 (1), "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-8#p100138) и ["b"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-8#p100139) | | Статья 8 (1) подпараграф 2 | [Статья 8 (2)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-8#p100140) | | Статья 8 (2) | [Статья 8 (3)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-8#p100141) | | Статья 9 | [Статья 9](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-9#p100142) | | Статья 10 | [Статья 10](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-10#p100144) | | Статья 11 (1) | [Статья 11](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-11#p100149) | | Статья 11 (2) | - | | Статья 12 | [Статья 12](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-12#p100151) | | Статья 13 | [Статья 13](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-13#p100172) | | Статья 14 | [Статья 14](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-14#p100181) | | Статья 15 | [Статья 15](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-15#p100184) | | Статья 16 (1) "a" - "f" | [Статья 16 (1) "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-16#p100194) - ["f"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-16#p100199) | | Статья 16 (1), последнее предложение | - | | Статья 16 (2) | [Статья 16 (2)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-16#p100201) | | Статья 17 | [Статья 18](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-18#p100205) | | Статья 18 | [Статья 17](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-17#p100202) | | Статья 19 "i" - "iv" | [Статья 19 "a"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-19#p100213) - ["d"](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-19#p100216) | | Статья 22 | - | | Статья 23 | [Статья 20](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-20#p100218) | | Статья 24 (1) и (2) | [Статья 21 (1)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-21#p100221) и [(2)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-21#p100224) | | Статья 24 (3) | - | | Статья 25 (1) и (2) | [Статья 21 (1)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-21#p100221) и [(3)](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-21#p100226) | | Статья 26 | - | | Статья 27 | - | | - | [Статья 22](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-22#p100228) | | - | [Статья 23](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-23#p100231) | | Статья 28 | [Статья 24](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100233) | | Приложение A | [Приложение I](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100238) | | Приложение B | [Приложение II](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100249) | | Приложение C | [Приложение III](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100279) | | Приложение D | [Приложение IV](https://bukva.ai/docs/direktiva-2009156es/statya-24#p100312) | | - | Приложение V | | - | Приложение VI | ---