---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-933"
---

## Без названия

# Документ 8799


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утвержден и введен в действие<br>
Постановлением Госстандарта России

</div>

от 29 декабря 2003 г. N 402-ст

<a id="p100003"></a>**НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100004"></a>**СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ**

<a id="p100005"></a>**МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ**
**ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ**

<a id="p100006"></a>Raw material and food-stuffs. Method for the identification
of genetically modified organisms (GMO) of plant origin

<a id="p100007"></a>**ГОСТ Р 52173-2003**

<div align="right">

<a id="p100002"></a>Дата введения<br>
1 января 2005 года

</div>



### <a id="p100008"></a>Предисловие


1. <a id="p100009"></a>Разработан: Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), Центром "Биоинженерия" РАН.
<a id="p100010"></a>Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".
2. <a id="p100011"></a>Утвержден и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N 402-ст.
3. <a id="p100012"></a>Введен впервые.


### 1. <a id="p100013"></a>Область применения


<a id="p100014"></a>Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.
<a id="p100015"></a>Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.


### 2. <a id="p100016"></a>Нормативные ссылки


<a id="p100017"></a>В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
<a id="p100018"></a>ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
<a id="p100019"></a>ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
<a id="p100020"></a>ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
<a id="p100021"></a>ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<a id="p100022"></a>ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
<a id="p100023"></a>ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
<a id="p100024"></a>ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
<a id="p100025"></a>ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
<a id="p100026"></a>ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия
<a id="p100027"></a>ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия
<a id="p100028"></a>ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
<a id="p100029"></a>ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
<a id="p100030"></a>ГОСТ 9656-75 Кислота борная. Технические условия
<a id="p100031"></a>ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
<a id="p100032"></a>ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия
<a id="p100033"></a>ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
<a id="p100034"></a>ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия.
<a id="p100035"></a>ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
<a id="p100036"></a>ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
<a id="p100037"></a>ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
<a id="p100038"></a>ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия


### 3. <a id="p100039"></a>Определения


<a id="p100040"></a>В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:
<a id="p100041"></a>3.1. Генетически модифицированные источники пищи: продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.
<a id="p100042"></a>3.2. Генетически модифицированный организм: организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.
<a id="p100043"></a>3.3. Генная инженерия: совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.


### 4. <a id="p100044"></a>Аппаратура, материалы и реактивы


<a id="p100045"></a>4.1. Амплификатор типа "Терцик МС-2" под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °C/с [1].
<a id="p100046"></a>4.2. Прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок [2].
<a id="p100047"></a>4.3. Источник напряжения типа "Power Pac 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50 - 300 В [3].
                                           TM

#### <a id="p100048"></a>4.4 Видеосистема  типа  "Gel Doc 2000  ", предназначенная для ввода в

компьютер,  анализа  и  документирования изображений люминесцирующих следов
ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300 - 400 нм,
чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) [4].

#### <a id="p100049"></a>4.5 Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.


#### <a id="p100050"></a>4.6 Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °C.


#### <a id="p100051"></a>4.7 Микроцентрифуга  настольная  типа  Эппендорф (частота вращения не

                -1
менее 12000 мин.  ) [5].

#### <a id="p100052"></a>4.8 Термостат типа "TERMO 24-15" под микроцентрифужные  пробирки  типа

Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 куб. см, диапазон  температур  от 15 °C до
120 °C,  количество  гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры  -  0,2 °C,  разность  температур  между  соседними  ячейками -
не более 0,5 °C [6].

#### <a id="p100053"></a>4.9 Аппарат  для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250 -

         -1
3000 мин.  .

#### <a id="p100054"></a>4.10 Печь микроволновая (мощностью не менее 400 Вт).

<a id="p100055"></a>4.11. Весы лабораторные общего назначения высокого класса точности (условное обозначение (II)) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

#### <a id="p100056"></a>4.12 Баня водяная [7].

<a id="p100057"></a>4.13. pH-метр с набором электродов, с погрешностью +/- 0,1 pH.

#### <a id="p100058"></a>4.14 Дозаторы с переменным объемом дозирования:

<a id="p100059"></a>0,2 - 2,0 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 1,2%;
<a id="p100060"></a>0,5 - 10,0 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 0,8%;
<a id="p100061"></a>2 - 20 куб. мм, шагом 0,01 куб. мм, точностью +/- 0,8%;
<a id="p100062"></a>20 - 200 куб. мм, шагом 0,1 куб. мм, точностью +/- 0,6%;
<a id="p100063"></a>100 - 1000 куб. мм, шагом 1 куб. мм, точностью +/- 3%;
<a id="p100064"></a>2 - 10 куб. см, шагом 0,1 куб. см, точностью +/- 0,5%.
<a id="p100065"></a>4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 куб. см.
<a id="p100066"></a>4.16. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 куб. мм; 10 куб. см.
<a id="p100067"></a>4.17. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 куб. см по ГОСТ 12738.
<a id="p100068"></a>4.18. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 куб. см по ГОСТ 1770.
<a id="p100069"></a>4.19. Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентрифужной пробирки вместимостью 1,5 куб. см.

#### <a id="p100070"></a>4.20 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.


#### <a id="p100071"></a>4.21 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.


#### <a id="p100072"></a>4.22 Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.


#### <a id="p100073"></a>4.23 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. [8].


#### <a id="p100074"></a>4.24 Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].


#### <a id="p100075"></a>4.25 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.


#### <a id="p100076"></a>4.26 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.


#### <a id="p100077"></a>4.27 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.


#### <a id="p100078"></a>4.28 Спирт изопропиловый, х.ч. [10].


#### <a id="p100079"></a>4.29 Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.


#### <a id="p100080"></a>4.30 Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.


#### <a id="p100081"></a>4.31 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.


#### <a id="p100082"></a>4.32 Вода деионизированная [11].


#### <a id="p100083"></a>4.33 Трис(оксиметил)аминометан, х.ч. [12].

<a id="p100084"></a>4.34. 2-меркаптоэтанол, х.ч. [13].

#### <a id="p100085"></a>4.35 Этидий бромистый, х.ч. [14].


#### <a id="p100086"></a>4.36 Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) [15].

<a id="p100087"></a>4.37. Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 °C - 72 °C [16].

#### <a id="p100088"></a>4.38 ПЦР буфер [17].


#### <a id="p100089"></a>4.39 Агароза для электрофореза (тип II) [18].


#### <a id="p100090"></a>4.40 Маркер молекулярной массы ДНК [19].

<a id="p100091"></a>4.41. Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) [20].
<a id="p100092"></a>4.42. Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) [21].

#### <a id="p100093"></a>4.43 Нуклеотиды:

<a id="p100094"></a>2'-дезоксиаденозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) [22];
<a id="p100095"></a>2'-дезоксицитидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23];
<a id="p100096"></a>2'-дезоксигуанозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) [24];
<a id="p100097"></a>2'-дезокситимидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) [25];

#### <a id="p100098"></a>4.44 Праймеры на промотор 35S [26]:

<a id="p100099"></a>**35S-1 5'GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3';**
<a id="p100100"></a>**35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'.**

#### <a id="p100101"></a>4.45 Праймеры на терминатор nos [27]:

<a id="p100102"></a>nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';
<a id="p100103"></a>nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3'.
<a id="p100104"></a>Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.


### 5. <a id="p100105"></a>Отбор проб


<a id="p100106"></a>Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.


### 6. <a id="p100107"></a>Подготовка к проведению анализа



#### <a id="p100108"></a>6.1 Приготовление растворов


##### <a id="p100109"></a>6.1.1 Приготовление раствора концентрацией c (Трис-HCl) = 1 моль/куб. дм

<a id="p100110"></a>В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 куб. см помещают 12,11 г Трис(оксиметил)аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100111"></a>6.1.2 Приготовление раствора концентрацией c (NaCl) = 5 моль/куб. дм

<a id="p100112"></a>В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100113"></a>6.1.3 Приготовление раствора концентрацией c (NaOH) = 30%

<a id="p100114"></a>В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 куб. см помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 куб. см деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100115"></a>6.1.4 Приготовление раствора концентрацией c (ЭДТА) = 0,5 моль/куб. дм

<a id="p100116"></a>В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 куб. см деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят pH раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.
<a id="p100117"></a>Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100118"></a>6.1.5 Приготовление лизирующего буфера

<a id="p100119"></a>В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 куб. см помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 куб. см деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 куб. см раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.1, 7 куб. см раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 куб. см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.
<a id="p100120"></a>Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, [6] при температуре 65 °C до полного растворения.
<a id="p100121"></a>Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, [13] из расчета 4 куб. мм на 1 куб. см лизирующего буфера и перемешивают.

##### <a id="p100122"></a>6.1.6 Приготовление хлороформа, насыщенного водой

<a id="p100123"></a>В колбу вместимостью 200 куб. см вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 куб. см хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 куб. см деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.
<a id="p100124"></a>Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100125"></a>6.1.7 Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта

<a id="p100126"></a>В колбу вместимостью 200 куб. см вносят цилиндром 70 куб. см 96%-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 куб. см деионизированной воды и перемешивают.
<a id="p100127"></a>Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 6 мес.

##### <a id="p100128"></a>6.1.8 Приготовление раствора концентрацией c (БСА) = 20 мкг/куб. см

<a id="p100129"></a>В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 куб. см деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 куб. мм приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см, добавляют 1 куб. см деионизированной воды и перемешивают.
<a id="p100130"></a>Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °C - не более 1 мес.

##### <a id="p100131"></a>6.1.9 Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией c = 4 ммоль/куб. дм

<a id="p100132"></a>В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 куб. см вносят 96 куб. мм деионизированной воды, 1 куб. мм АТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [22], 1 куб. мм ГТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [24], 1 куб. мм ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [23], 1 куб. мм ТТФ (концентрацией 100 ммоль/куб. дм) по 4.43, [25], смесь перемешивают.
<a id="p100133"></a>Срок хранения при температуре минус 20 °C - не более одного года.

##### <a id="p100134"></a>6.1.10 Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза

<a id="p100135"></a>В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см вносят 10,8 г Трис(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.
<a id="p100136"></a>Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.
<a id="p100137"></a>    6.1.11.  Приготовление  раствора  концентрацией  c  (C  H  N Br)  =  10
                                                          21 20 3
мг/куб. см
<a id="p100138"></a>В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.
<a id="p100139"></a>Срок хранения при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 12 мес.

##### <a id="p100140"></a>6.1.12 Приготовление 2%-ного агарозного геля

<a id="p100141"></a>6.1.12.1. В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 куб. см помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 куб. см буфера 1x ТВЕ, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °C и кипятят до полного расплавления агарозы.
<a id="p100142"></a>6.1.12.2. Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °C, автоматическим микродозатором добавляют 5 куб. мм раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.
<a id="p100143"></a>6.1.12.3. Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15 - 30 мин. после остывания геля гребенку удаляют.
<a id="p100144"></a>Допускается хранение геля в 1x ТВЕ буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °C до 5 °C - не более 7 сут.

#### <a id="p100145"></a>6.2 Подготовка пробы

<a id="p100146"></a>6.2.1. Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) по 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) по 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 куб. см. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 куб. мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 куб. мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".

##### <a id="p100147"></a>6.2.2 Приготовленные  по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют

при  температуре  65 °C 40 - 60 мин., после чего повторно перемешивают 30 с
на   аппарате  для  встряхивания  и  центрифугируют  7  мин. на  настольной
микроцентрифуге  типа  Эппендорф  по  4.7, [5] при частоте вращения 12000 -
          -1
13000 мин.  .

##### <a id="p100148"></a>6.2.3 Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в

четыре  чистые  микроцентрифужные  пробирки  вместимостью  1,5  куб. см, не
захватывая  частицы  суспензии  из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную
пробирку  добавляют  по  400  куб. мм хлороформа, приготовленного по 6.1.6,
перемешивают  на  аппарате  для встряхивания 30 с до образования суспензии.
Полученные  суспензии  центрифугируют  7 мин. на настольной микроцентрифуге
                                              -1
типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин.   при комнатной температуре.
<a id="p100149"></a>6.2.4. Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 куб. см, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.
<a id="p100150"></a>6.2.5. Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 куб. см, добавляют в каждую из них по 600 куб. мм изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °C, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.
<a id="p100151"></a>Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °C не менее чем на 30 мин. для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
<a id="p100152"></a>На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °C.

##### <a id="p100153"></a>6.2.6 Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте

                -1
вращения   12000   мин.    при  комнатной  температуре.  Аккуратно  удаляют
надосадочную  жидкость.  Каждый  осадок 2 - 3 раза  промывают  200  куб. мм
70%-ного  этилового  ректификованного  спирта,  приготовленного  по  6.1.7,
каждый  раз  перемешивая  осадки  на  аппарате для встряхивания 15 - 20 с и
центрифугируя   их   на   микроцентрифуге  6   мин.  при  частоте  вращения
          -1
12000 мин.   Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.
<a id="p100154"></a>6.2.7. Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50 - 100 куб. мм деионизированной воды и получают раствор ДНК.
<a id="p100155"></a>Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °C сроком до одного года в морозильной камере.

#### <a id="p100156"></a>6.3 Приготовление реакционных смесей N 1 и N 2


##### <a id="p100157"></a>6.3.1 Приготовление реакционной смеси N 1 на пять проб

<a id="p100158"></a>В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 куб. мм деионизированной воды, 52,5 куб. мм 10x буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, [17], 26 куб. мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 куб. мм праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.44, [26], 13 куб. мм праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.44, [26], 2,5 куб. мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед./куб. мм) по 4.37, [16], 52,5 куб. мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

##### <a id="p100159"></a>6.3.2 Приготовление реакционной смеси N 2 на пять проб

<a id="p100160"></a>В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 куб. мм деионизированной воды, 52,5 куб. мм 10x буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 куб. мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 куб. мм праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.45, [27], 13 куб. мм праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/куб. дм) по 4.45, [27], 2,5 куб. мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед./куб. мм), 52,5 куб. мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.
<a id="p100161"></a>    6.3.3.  Реакционные  смеси  N 1 и N 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2,
центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000
    -1
мин.  .   Реакционную   смесь   N  1   разливают  по  90  куб.  мм  в  пять
микроцентрифужных  пробирок  вместимостью  0,2 куб. см  (или  0,5 куб. см в
зависимости  от  типа  используемого  амплификатора)  для  проведения  ПЦР.
Реакционную   смесь   N  2   разливают   по  90  куб.  мм   в  пять  других
микроцентрифужных  пробирок  вместимостью  0,2 куб. см  (или  0,5 куб. см в
зависимости  от  типа  используемого  амплификатора)  для  проведения  ПЦР.
Реакционные смеси N 1 и N 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.


### 7. <a id="p100162"></a>Проведение анализа


<a id="p100163"></a>7.1. В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1 - 6.2.7, по 2 куб. мм в каждую.
<a id="p100164"></a>В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), по 2 куб. мм в каждую.
<a id="p100165"></a>В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), по 2 куб. мм в каждую.
<a id="p100166"></a>В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 куб. мм в каждую - холостой опыт.
<a id="p100167"></a>7.2. В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20 - 40 куб. мм) вазелинового масла по ГОСТ 3164.
<a id="p100168"></a>7.3. Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.

<div align="right">

<a id="p100169"></a>Таблица 1

</div>


<div align="center">

<a id="p100170"></a>**УСЛОВИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ 35S ПРОМОТОРА**

</div>



<table>
<colgroup><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Стадия</td><td colspan="5">Тип амплификатора</td></tr>
<tr><td>Crocodile II</td><td>Gene Amp 2400</td><td>Progene</td><td>Trio</td><td>Терцик МС-2</td></tr>
<tr><td>Денатурация</td><td>2 мин./98 °C</td><td>3 мин./94 °C</td><td>3 мин./95 °C</td><td>2 мин./96 °C</td><td>3 мин./94 °C</td></tr>
<tr><td>Амплификация</td><td>8 с/95 °C 30 с/54 °C 40 с/72 °C</td><td>20 с/94 °C 40 с/54 °C 60 с/72 °C</td><td>36 с/95 °C 72 с/54 °C 84 с/72 °C</td><td>30 с/95 °C 40 с/54 °C 40 с/72 °C</td><td>20 с/94 °C 40 с/54 °C 60 с/72 °C</td></tr>
<tr><td>Количество циклов</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td></tr>
<tr><td>Конечное удлинение</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td></tr>
<tr><td>Фаза остывания</td><td>1 мин./30 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td></tr>
<tr><td>Скорость нагрева</td><td>1 °C/с</td><td>0,77 °C/с</td><td>1,5 °C/с</td><td>1 °C/с</td><td>0,77 °C/с</td></tr>
<tr><td>Скорость остывания</td><td>1 °C/с</td><td>3,15 °C/с</td><td>1,5 °C/с</td><td>1 °C/с</td><td>3,15 °C/с</td></tr>
</table>


<div align="right">

<a id="p100179"></a>Таблица 2

</div>


<div align="center">

<a id="p100180"></a>**УСЛОВИЯ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ТЕРМИНАТОРА NOS**

</div>



<table>
<colgroup><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="17%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Стадия</td><td colspan="5">Тип амплификатора</td></tr>
<tr><td>Crocodile II</td><td>Gene Amp 2400</td><td>Progene</td><td>Trio</td><td>Терцик МС-2</td></tr>
<tr><td>Денатурация</td><td>3 мин./95 °C</td><td>3 мин./94 °C</td><td>3 мин./95 °C</td><td>2 мин./98 °C</td><td>3 мин./94 °C</td></tr>
<tr><td>Амплификация</td><td>20 с/95 °C 40 с/54 °C 40 с/72 °C</td><td>20 с/94 °C 40 с/54 °C 60 с/72 °C</td><td>36 с/95 °C 72 с/54 °C 84 с/72 °C</td><td>30 с/95 °C 40 с/54 °C 40 с/72 °C</td><td>20 с/94 °C 40 с/54 °C 60 с/72 °C</td></tr>
<tr><td>Количество циклов</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td><td>40</td></tr>
<tr><td>Конечное удлинение</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td><td>3 мин./72 °C</td></tr>
<tr><td>Фаза остывания</td><td>1 мин./30 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td><td>1 мин./4 °C</td></tr>
<tr><td>Скорость нагрева</td><td>1 °C/с</td><td>0,77 °C/с</td><td>1,5 °C/с</td><td>1 °C/с</td><td>0,77 °C/с</td></tr>
<tr><td>Скорость остывания</td><td>1 °C/с</td><td>3,15 °C/с</td><td>1,5 °C/с</td><td>1 °C/с</td><td>3,15 °C/с</td></tr>
</table>


<a id="p100189"></a>7.4. По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 куб. мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.
<a id="p100190"></a>7.5. В отдельный карман геля вносят 8 куб. мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].
<a id="p100191"></a>7.6. Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1x ТБЕ.
<a id="p100192"></a>Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.
<a id="p100193"></a>7.7. Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].
<a id="p100194"></a>7.8. Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б (не приводятся).


### 8. <a id="p100195"></a>Обработка результатов анализа


<a id="p100196"></a>8.1. В пробе со стандартом ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего промотор 35S) должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.). В пробе со стандартом без ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)) и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.).
<a id="p100197"></a>8.2. В пробе со стандартом ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего терминатор nos) должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н. В пробе со стандартом без ГМИ (ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)) и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н.

#### <a id="p100198"></a>8.3 Интерпретация результатов

<a id="p100199"></a>8.3.1. Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.
<a id="p100200"></a>8.3.2. Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н., или одного из них, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.
<a id="p100201"></a>8.3.3. В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.
<a id="p100202"></a>8.3.4. Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/куб. дм), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.
<a id="p100203"></a>8.3.5. Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.


### 9. <a id="p100204"></a>Контроль результатов идентификации


<a id="p100205"></a>Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 41 OR SB-0).


### 10. <a id="p100206"></a>Требования безопасности


<a id="p100207"></a>10.1. При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках
<a id="p100208"></a>10.2. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
<a id="p100209"></a>10.3. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.





<div align="right">

<a id="p100210"></a>Приложение В<br>
(справочное)

</div>


<div align="center">

<a id="p100211"></a>**БИБЛИОГРАФИЯ**

</div>



1. <a id="p100212"></a>ТУ 9642-001-4648062-98        Амплификатор "Терцик МС-2"
2. <a id="p100213"></a>"Био-Рад Лаборатория",        Камера для электрофореза "Mini-Sub Cell
   "Bio-Rad Laboratories"        GT System"
   (США), кат. N 170-4406
3. <a id="p100214"></a>"Био-Рад Лаборатория",        Источник напряжения "Power Pac 300"
   "Bio-Rad Laboratories"
   (США), кат. N 900-7980
   TM
4. <a id="p100215"></a>"Био-Рад Лаборатория",        Видеосистема "Gel Doc 2000   Gel
   "Bio-Rad Laboratories"        Documentation System"
   (США), кат. N 170-86-16
5. <a id="p100216"></a>ТУ 9452-007-18240041-00       Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф
   -1
   "ТЭТА", 12000 мин.
6. <a id="p100217"></a>ТУ 9452-001-18240041-99       Термостат "TERMO 24-15"
7. <a id="p100218"></a>ТУ 46-22-603-75               Баня водяная с электрическим или огневым
   подогревом
8. <a id="p100219"></a>ТУ 113-04-146-84              Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)
9. <a id="p100220"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"     Гексадецилтриметиламмониум бромид
   ("Sigma"), кат. N Н 5882      [C  H  NBr]
   19 42
10. <a id="p100221"></a>ТУ 6-09-402-85               Спирт изопропиловый [CH CHOH CH ]
   3       3
11. <a id="p100222"></a>ОСТ 11.029.003-80            Вода деионизированная
12. <a id="p100223"></a>ТУ 6-09-4292-76              Трис(оксиметил)аминометан [NH C(CH OH) ]
   2    2   3
13. <a id="p100224"></a>ТУ 6-09-08-1024-81           2-меркаптоэтанол [C H OS]
   2 6
14. <a id="p100225"></a>ТУ 6-09-13-452-75            Этидий бромистый [C  H  N Br]
   21 20 3
15. <a id="p100226"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Альбумин бычий сывороточный сухой
   ("Sigma"), кат. N В 4287
16. <a id="p100227"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Фермент Tag-полимераза
   ("Sigma"), кат. N Д 1806
17. <a id="p100228"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Буфер для ПЦР с MgCl
   ("Sigma"), кат. N Р 2192                         2
18. <a id="p100229"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Агароза для электрофореза
   ("Sigma"), кат. N А 6877
19. <a id="p100230"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    ПЦР маркер 100 п.н.
   ("Sigma"), кат. N Р 1473
20. <a id="p100231"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Стандартный образец состава генетически
   ("Fluka"), кат. N 53198      не модифицированного источника пищи
   растительного происхождения (Certified
   Reference Material IRMM N 410R SB-0)
21. <a id="p100232"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    Стандартный образец состава генетически
   ("Fluka"), кат. N 44386      модифицированного источника пищи
   растительного происхождения (Certified
   Reference Material IRMM N 410R SB-5)
22. <a id="p100233"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты
   ("Sigma"), кат. N Д 4788     тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ)
23. <a id="p100234"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты
   ("Sigma"), кат. N Д 4913     тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ)
24. <a id="p100235"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты
   ("Sigma"), кат. N Д 5038     тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ)
25. <a id="p100236"></a>Корпорация "Сигма Алдрич"    2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты
   ("Sigma"), кат. N Т 9656     тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ)
26. <a id="p100237"></a>ЗАО "Синтол" Россия          Праймеры на промотор 35S:
   (http://www. syntol.ru)      35S-1 5'GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3';
   35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'
27. <a id="p100238"></a>ЗАО "Синтол" Россия          Праймеры на терминатор NOS:
   (http://www.syntol.ru)       nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';
   nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3'
   <a id="p100239"></a>------------------------------------------------------------------