--- title: "Без названия" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-82" --- ## Без названия # Документ 718 Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 949-ст **НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ** **ПРОДУКТЫ МОЛОЧНЫЕ СОСТАВНЫЕ И ПРОДУКТЫ ДЕТСКОГО ПИТАНИЯ** **НА МОЛОЧНОЙ ОСНОВЕ** **ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ МОНО- И ДИСАХАРИДОВ** **МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** Component milk products and infant milk products. Determination of mono- and disugars mass concentration by high-performance liquid chromatographic method **ГОСТ Р 54760-2011** Группа Н19 **ОКС 67.100.10** **ОКСТУ 9209** Дата введения 1 января 2013 года ### Предисловие Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения". ### Сведения о стандарте 1. Разработан Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИМИ Россельхозакадемии). 2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 470 "Молоко и продукты переработки молока". 3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 949-ст. 4. Введен впервые. Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет. ### 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Настоящий стандарт распространяется на составные молочные продукты и продукты детского питания на молочной основе (далее - продукт) и устанавливает определение массовой концентрации моно- и дисахаридов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Диапазон измерений массовой концентрации моно- и дисахаридов в продукте от 50,0 до 10000,0 мг/дм3. ### 2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты: ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) Вода для лабораторного анализа. Технические условия ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 13928-84 Молоко и сливки заготовляемые. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка их к анализу ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные шкафы бытовые. Общие технические условия. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования *Примечание.* При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку. ### 3. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ В настоящем стандарте применены термины, установленные нормативным правовым актом Российской Федерации [1], а также следующий термин с соответствующим определением: 3.1. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии: метод разделения компонентов продукта, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна, с использованием высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (до 1,8 мкм). ### 4. СУЩНОСТЬ МЕТОДА Метод основан на определении углеводов в фильтрате, полученном после удаления из пробы продукта жира и белка, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении на аминофазной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой концентрации моно- и дисахаридов в стандартных образцах, используя градуировочный график. *Пример* хроматограммы молочного продукта представлен в Приложении А. ### 5. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ, ПОСУДА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы: - колонку аминофазную длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 78 мм; - предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную катионом в гидрогенной форме; - предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную анионом в карбонатной форме; - детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более единиц рефракции; - мешалку магнитную; - насос, способный пропускать раствор со скоростью 0,3 - 0,6 см3/мин, с пульсацией не более 1% при давлении на колонку от 1,5 до 4,0 МПа; - термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры элюента (85 +/- 2) °C; - устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 см3; - программу компьютерную для статистической обработки результатов типа "Мультихром", версия 1.5 и выше со встроенным интегратором. Весы по ГОСТ Р 53228 с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,001 г, +/- 0,2 мг. Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040 - 1,000 см3 с относительной погрешностью дозирования +/- 1%. Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 см3. Часы электронно-механические по ГОСТ 27752. Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919. Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм3. Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770. Цилиндры вместимостью 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770. Пипетки градуированные 1-1-2-10 по ГОСТ 29227. Пипетки с одним делением 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20 по ГОСТ 29169. Колбы П-1-50-19/26 ТС (-1-25-19/26 ТС) по ГОСТ 25336. Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336. Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336. Прибор для фильтрования стеклянный с фильтром с размером диаметра 0,45 мкм. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см. Фильтры мембранные с размером диаметра пор не более 0,5 мкм. Ацетат цинка двуводный, массовой долей основного вещества не менее 99,999%. Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61. Кислота фосфорновольфрамовая 24-водная. Образцы стандартные углеводов массовой долей основного вещества не менее 99,0%. Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по ГОСТ Р 52501. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных. ### 6. ОТБОР ПРОБ Отбор проб - по ГОСТ 13928 и ГОСТ 26809. ### 7. ПОДГОТОВКА К ПРОВЕДЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ #### 7.1 Подготовка стандартного раствора углевода В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 75 мг соответствующего стандартного образца углевода с записью результата до четвертого знака после запятой и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора при температуре от 4 °C до 6 °C - не более 7 сут. #### 7.2 Реактив для предварительной обработки пробы (91,00 +/- 0,01) г ацетата цинка двуводного, (54,60 +/- 0,01) г фосфорновольфрамовой кислоты 24-водной и 58,1 см3 ледяной уксусной кислоты аккуратно вносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3 и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки. Срок хранения реактива при температуре от 4 °C до 6 °C - не более 10 сут. #### 7.3 Подготовка градуировочных растворов Градуировочные растворы, содержащие 250, 500, 750 и 1000 мг углевода на 1000 см3 обезжиренного пастеризованного молока, готовят, добавляя 5, 10, 15 и 20 см3 соответственно стандартного раствора углевода, подготовленного по 7.1, к обезжиренному пастеризованному молоку, не содержащему данного углевода. В четыре мерные колбы вместимостью 50 см3 помещают по 15 см3 обезжиренного пастеризованного молока. ##### 7.3.1 Градуировочный раствор А, содержащий 250 мг углевода на 1000 см3 продукта 7.3.1.1. В первую мерную колбу, содержащую 15 см3 молока, помещают 5 см3 стандартного раствора углевода (по 7.1) и перемешивают. Мерным цилиндром добавляют 15 см3 бидистиллированной воды и вновь перемешивают. 7.3.1.2. Затем с помощью пипетки добавляют 5,5 см3 реактива для предварительной обработки образца по 7.2 и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Оставляют на 1 ч при температуре (23 +/- 2) °C и фильтруют через бумажный фильтр с размером диаметра 12,5 см, отбрасывая первые 5 см3 фильтрата. ##### 7.3.2 Градуировочный раствор Б, содержащий 500 мг углевода на 1000 см3 продукта Во вторую мерную колбу, содержащую 15 см3 молока, помещают 10 см3 стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 10 см3 бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2. ##### 7.3.3 Градуировочный раствор В, содержащий 750 мг углевода на 1000 см3 продукта В третью мерную колбу, содержащую 15 см3 молока, помещают 15 см3 стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 5 см3 бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2. ##### 7.3.4 Градуировочный раствор Г, содержащий 1000 мг углевода на 1000 см3 продукта В четвертую мерную колбу, содержащую 15 см3 молока, помещают 20 см3 стандартного раствора углевода по 7.1 и перемешивают. Добавляют 5 см3 бидистиллированной воды, используя мерный цилиндр, и перемешивают. Далее - по 7.3.1.2. ##### 7.3.5 Все растворы готовят перед определением. #### 7.4 Подготовка элюента Дегазацию растворенного в элюенте воздуха проводят с помощью водоструйного или вакуумного насоса, обрабатывая бидистиллированную воду ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности избегают вспенивания элюента. Элюент готовят в день определения. #### 7.5 Подготовка анализируемой пробы продукта 7.5.1. Пробу продукта нагревают до температуры (20 +/- 2) °C и аккуратно перемешивают. Если жир не растворился, пробу постепенно нагревают до температуры (40 +/- 2) °C, аккуратно перемешивают переворачиванием (не допуская вбивания воздуха) и быстро охлаждают до температуры (20 +/- 2) °C. 7.5.2. (15,000 +/- 0,001) г подготовленной по 7.5.1 пробы помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3. Мерным цилиндром приливают 20 см3 бидистиллированной воды. Добавляют 5,5 см3 реактива для предварительной обработки пробы по 7.2 и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор оставляют на 1 ч при температуре (23 +/- 2) °C, затем фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывая первые 5 см3 фильтрата. #### 7.6 Подготовка хроматографа Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора. ##### 7.6.1 Условия хроматографирования - скорость потока - 0,3 - 0,6 см3/мин; - температура - 85,0 °C; - подвижная фаза: бидистиллированная вода; - детектор: рефрактометрический. ##### 7.6.2 Построение градуировочного графика Для построения градуировочного графика измеряют площади пиков, соответствующие массовым концентрациям углеводов в градуировочных растворах. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее трех раз. Измерения выполняют последовательно, начиная с растворов с наименьшей массовой концентрацией определяемого вещества. Полученные при хроматографировании значения не должны отклоняться от стандартных более чем на 5,00%. По полученным данным, используя программные обеспечения к приборам, рассчитывают коэффициенты регрессии a и b прямой . Градуировочный график строят с учетом вычисленных значений уравнения: где Y - площадь пика углеводов; a и b - коэффициенты регрессии; - массовая концентрация углеводов в градуировочном растворе, мг/см3. 7.6.3. Градуировку проводят не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок или ремонте хроматографа. ### 8. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия: - температура окружающего воздуха ........... (20 +/- 5) °C; - относительная влажность воздуха ........... (55 +/- 25)%; - атмосферное давление ...................... (96 +/- 10) кПа; - частота переменного тока .................. (50 +/- 5) Гц; - напряжение в сети ......................... (220 +/- 10) В. Для проведения измерений применяют бидистиллированную воду, которую готовят следующим образом: дистиллированную воду фильтруют через мембранный фильтр (размер диаметра пор не более 0,5 мкм), затем кипятят для удаления растворенного воздуха и охлаждают до комнатной температуры. ### 9. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ #### 9.1 Дегазация анализируемой пробы В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 3 см3 фильтрата по 7.5. Дегазацию растворенного в фильтрате воздуха проводят с помощью вакуумного насоса, обрабатывая ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности избегают вспенивания. 9.2. В инжектор хроматографа вводят от 0,01 до 0,03 см3 тщательно отмеренного дегазированного фильтрата со скоростью потока 0,3 - 0,6 см3/мин. Плоттер выбирают так, чтобы минимальная высота пика углевода составляла около 5 мм для градуировочного раствора А. ### 10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ Массовую концентрацию углеводов в анализируемой пробе продукта C, мг/дм3, вычисляют по формуле где - объем анализируемой пробы после разбавления по 7.5, см3; - концентрация углевода, рассчитанная по градуировочному графику (7.6.2), мг/дм3; - объем анализируемой пробы, взятой для анализа по 9.2, см3. Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу 11. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака. ### 11. КОНТРОЛЬ ТОЧНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ #### 11.1 Метрологические характеристики метода определения массовой концентрации моно- и дисахаридов Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения массовой концентрации моно- и дисахаридов при P = 0,95 приведены в таблице 1. Таблица 1 | Диапазон измерений массовой концентрации углеводов, мг/дм3 | Предел повторяемости rотн, % | Предел воспроизводимости Rотн, % | Границы относительной погрешности , % | | --- | --- | --- | --- | | От 50,0 до 1000,0 вкл. | 12 | 23 | 16 | | Св. 1000,0 до 10000,0 | 9 | 17 | 12 | #### 11.2 Проверка приемлемости результатов определений, полученных в условиях повторяемости Проверку приемлемости результатов определений массовой концентрации моно- и дисахаридов, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2). Результаты измерений считаются приемлемыми при условии: где - значения двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, мг/дм3; - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/дм3; - пределы повторяемости (сходимости), значения которых приведены в таблице 1, %. Если данное условие не выполняется, то проводят повторное определение и проверку приемлемости результатов определений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2). #### 11.3 Проверка приемлемости результатов определения, полученных в условиях воспроизводимости Проверку приемлемости результатов определений массовой концентрации моно- и дисахаридов, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.2.1). Результаты определений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии: где - результаты определений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, мг/дм3; - пределы воспроизводимости, значения которых приведены в таблице 1, %; - среднеарифметическое значение результатов определений, выполненных в условиях воспроизводимости, мг/дм3. Если данное условие не выполняется, то процедуры повторяют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3). ### 12. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Результат измерений массовой концентрации моно- и дисахаридов в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде: , при P = 0,95, где - границы относительной погрешности измерений, % (таблица 1); - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, мг/дм3. ### 13. ТРЕБОВАНИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ БЕЗОПАСНОСТЬ При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования: - помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005; - требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007; - требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с требованиями ГОСТ Р 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.009. Приложение А (справочное) *ПРИМЕР* ХРОМАТОГРАММЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ **МОНО- И ДИСАХАРИДОВ В МОЛОЧНОМ ПРОДУКТЕ** А.1. Пример хроматограммы определения массовой концентрации моно- и дисахаридов в молочном продукте приведен на рисунке А.1. Рисунок А.1. ## БИБЛИОГРАФИЯ [1] Федеральный закон от 12 июня 2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" (с изменением) --- ## Иллюстрации $5x10^{- 9}$ $\text{К}_{\text{н}}$ $Y = aC_{\text{угр}} + b$ $Y = aC_{\text{угр}} + b,(1)$ $C_{\text{угр}}$ $C = \frac{V_{1}C_{3}}{V_{2}} ,(2)$ $V_{1}$ $C_{3}$ $V_{2}$ $\pm \delta$ $|X_{1} - X_{2}| \leq r_{\text{отн}}·0,01X_{\text{ср}},$ $X_{1},X_{2}$ $X_{\text{ср}}$ $r_{\text{отн}}$ $|X_{1}\prime - X_{2}\prime| \leq R_{\text{отн}}·0,01X_{\text{ср}},$ $X_{1}\prime,X_{2}\prime$ $R_{\text{отн}}$ $X_{\text{ср}}$ $X_{\text{ср}} \pm \delta·0,01X_{\text{ср}}$ $\delta$ $X_{\text{ср}}$ ![](https://i.bukva.ai/vLeYaJCK/img_0.png)