---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-5041"
---

## Без названия

# Документ 47997


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
30 ноября 2023 года


#### <a id="p100002"></a>4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

**И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ**

<a id="p100003"></a>**МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ**
**ГМ-КУКУРУЗЫ MON87429 И MON95379**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ**
МР 4.2.0332-23

<a id="p100005"></a>Методические рекомендации разработаны ФБУН "Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека" (Г.Ф. Мухаммадиева, А.Б. Бакиров, Д.О. Каримов, Э.Ф. Репина, Э.Р. Кудояров, Н.Ю. Хуснутдинова, С.С. Байгильдин, Я.В. Валова, Т.Г. Якупова, Д.Д. Каримов, Д.А. Смолянкин, А.А. Гизатуллина, А.Р. Ахмадеев).


### <a id="p100006"></a>I. Область применения и общие положения


<a id="p100007"></a>1.1. Возрастание объемов производства и импорта трансгенной продукции, рост вероятности поступления пищевой продукции, полученной с применением генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО), на внутренний продовольственный рынок, определяет необходимость совершенствования методов их идентификации. Контроль и мониторинг продукции, содержащей ГМО, обеспечивает биобезопасность Российской Федерации, предупреждая проникновение и расселение ГМО на территории Российской Федерации.
<a id="p100008"></a>1.2. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) содержат описание методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной кукурузы (далее - ГМ-кукурузы) MON87429 и MON95379.
<a id="p100009"></a>Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее - ПЦР-РВ) по технологии TaqMan <1>, могут быть использованы для контроля за ГМО в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения).

<a id="p100010"></a>

---

<a id="p100011"></a><1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.

<a id="p100012"></a>1.3. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО основаны на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
<a id="p100013"></a>1.4. МР могут применяться при контроле растительного сырья и пищевых продуктов на наличие ГМО на этапах гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза и реализации в Российской Федерации.
<a id="p100014"></a>1.5. МР предназначены для лабораторий организаций Роспотребнадзора, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке.


### <a id="p100015"></a>II. Сущность метода


<a id="p100016"></a>2.1. Метод выявления компонентов ГМО основан на использовании ПЦР-РВ. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО базируется на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
<a id="p100017"></a>2.2. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:
- <a id="p100018"></a>одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);
- <a id="p100019"></a>другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).
<a id="p100020"></a>2.3. Для построения калибровочных кривых рекомендуется использовать соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее - ССО <2>) с известным содержанием ДНК. Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) - по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.

<a id="p100021"></a>

---

<a id="p100022"></a><2> Например, ССО Института контрольных материалов и измерений (англ. Institute for Reference Materials and Measurements, JRC-IRMM) - https://crm.jrc.ec.europa.eu; ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (англ. American Oil Chemists Society, AOCS) - www.aocs.org (в свободном доступе); или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.


### <a id="p100023"></a>III. Испытательное и вспомогательное оборудование, расходные материалы и реактивы


<a id="p100024"></a>3.1. При выполнении измерений применяются испытательное и вспомогательное оборудование, расходные материалы и реактивы, приведенные в таблицах 1 - 3.

<a id="p100025"></a>Таблица 1

<a id="p100026"></a>Испытательное и вспомогательное оборудование


<table>
<colgroup><col width="65%"><col width="35%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100027"></a>Наименование испытательного и вспомогательного оборудования</td><td><a id="p100028"></a>Обозначение и наименование документов, технические характеристики</td></tr>
<tr><td><a id="p100029"></a>1</td><td><a id="p100030"></a>2</td></tr>
<tr><td><a id="p100031"></a>Амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени с программным обеспечением</td><td><a id="p100032"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100033"></a>Дозаторы механические с переменным объемом дозирования</td><td><a id="p100034"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100035"></a>Центрифуга настольная со скоростью вращения не менее 11000 g со сменными роторами для пробирок на 1,5 мл и на 0,5 мл</td><td><a id="p100036"></a>ГОСТ IEC 61010-2-020 [4]</td></tr>
<tr><td><a id="p100037"></a>Аппарат для встряхивания типа вортекс или микроцентрифуга-вортекс (максимальное ускорение 450 g)</td><td><a id="p100038"></a>ТУ 64-1-1081</td></tr>
<tr><td><a id="p100039"></a>Ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения</td><td><a id="p100040"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100041"></a>Холодильник с отделениями на плюс 2 - плюс 8 °C и на минус 24 - минус 16 °C</td><td><a id="p100042"></a>ГОСТ 26678 [2]</td></tr>
<tr><td><a id="p100043"></a>Термостат твердотельный для пробирок полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5 мл, диапазон температур - от комнатной до плюс 99 °C</td><td><a id="p100044"></a>-</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100045"></a><a id="p100046"></a>Термостат твердотельный для пробирок полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5 мл, диапазон температур - от комнатной до плюс 99 °C<br>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100047"></a>Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г</td><td><a id="p100048"></a>ГОСТ Р 53228 [3]</td></tr>
<tr><td><a id="p100049"></a>Примечание: допускается использование испытательного и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.</td><td></td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100050"></a>Таблица 2</td></tr>
</table>


<a id="p100051"></a>Расходные материалы


<table>
<colgroup><col width="65%"><col width="35%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100052"></a>Наименование расходных материалов</td><td><a id="p100053"></a>Обозначение и наименование документов, технические характеристики</td></tr>
<tr><td><a id="p100054"></a>Пробирки полипропиленовые с крышкой вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл</td><td><a id="p100055"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100056"></a>Наконечники одноразовые с фильтром, для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 100; 200 и 1000 мкл</td><td><a id="p100057"></a>-</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100058"></a>Примечание: допускается использование расходных материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.</td></tr>
</table>


<a id="p100059"></a>Таблица 3

<a id="p100060"></a>Реактивы


<table>
<colgroup><col width="65%"><col width="35%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100061"></a>Наименование средств измерения</td><td><a id="p100062"></a>Обозначение и наименование документов, технические характеристики</td></tr>
<tr><td><a id="p100063"></a>Реакционная смесь для ПЦР, согласно протоколу Объединенного научного центра Европейского Союза (англ. Joint Research Centre, далее - JRC) для количественного определения соответствующего трансформационного события</td><td><a id="p100064"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100065"></a>Вода деионизованная</td><td><a id="p100066"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100067"></a>Специфичные праймеры и ДНК-зонды, перечисленные в табл. 2, 6, 10</td><td><a id="p100068"></a>-</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100069"></a>Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками, методика может быть реализована с помощью готовых наборов реактивов.</td></tr>
</table>



### <a id="p100070"></a>IV. Метод идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы линии MON87429


<a id="p100071"></a>4.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON87429 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- <a id="p100072"></a>область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87429, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;
- <a id="p100073"></a>таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (англ. high mobility group, далее - hmg).
<a id="p100074"></a>4.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 5 геномных копий кукурузы линии MON87429 в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 160 нг ДНК кукурузы.
<a id="p100075"></a>4.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в таблицах 4 - 7. Раствор 1 (табл. 4) получают путем смешивания определенного количества ДНК 100% ГМ-кукурузы линии MON87429 (кат. N AOCS 0321-А) с ДНК его традиционного аналога (исходя из расчета, что масса 73260 копий молекул ДНК гаплоидного генома кукурузы равна 2,73 пкг [7]). Для количественного определения трансформационного события MON87429 используется реакционная смесь (табл. 6) согласно протоколу JRC [5].
<a id="p100076"></a>Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

<a id="p100077"></a>Таблица 4

<a id="p100078"></a>Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК,
используемых для построения калибровочной кривой


<table>
<colgroup><col width="25%"><col width="13%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="15%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100079"></a>Показатель</td><td colspan="5"><a id="p100080"></a>Концентрация ДНК в растворе</td></tr>
<tr><td><a id="p100081"></a>Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО)</td><td><a id="p100082"></a>Раствор 2 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 1)</td><td><a id="p100083"></a>Раствор 3 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 2)</td><td><a id="p100084"></a>Раствор 4 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 3)</td><td><a id="p100085"></a>Раствор 5 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 4)</td></tr>
<tr><td><a id="p100086"></a>Общее содержание ДНК в реакции, нг</td><td><a id="p100087"></a>200</td><td><a id="p100088"></a>50</td><td><a id="p100089"></a>13</td><td><a id="p100090"></a>3,1</td><td><a id="p100091"></a>0,78</td></tr>
<tr><td><a id="p100092"></a>Количество копий гаплоидного генома кукурузы, копии</td><td><a id="p100093"></a>73260</td><td><a id="p100094"></a>18315</td><td><a id="p100095"></a>4579</td><td><a id="p100096"></a>1145</td><td><a id="p100097"></a>286</td></tr>
<tr><td><a id="p100098"></a>Трансформационное событие MON87429, копии</td><td><a id="p100099"></a>7326</td><td><a id="p100100"></a>1832</td><td><a id="p100101"></a>458</td><td><a id="p100102"></a>114</td><td><a id="p100103"></a>29</td></tr>
</table>


<a id="p100104"></a>Таблица 5

<a id="p100105"></a>Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов


<table>
<colgroup><col width="24%"><col width="15%"><col width="51%"><col width="11%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100106"></a>Олигонуклеотиды</td><td><a id="p100107"></a>Название</td><td><a id="p100108"></a>Последовательность (5'-3')</td><td><a id="p100109"></a>Длина, н.п.</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100110"></a>Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MON87429</td></tr>
<tr><td><a id="p100111"></a>Прямой праймер</td><td><a id="p100112"></a>MON87429 primer 1</td><td><a id="p100113"></a>CGA GAC AGA CTC AAT GTA TCC GAG ATA CTC</td><td><a id="p100114"></a>30</td></tr>
<tr><td><a id="p100115"></a>Обратный праймер</td><td><a id="p100116"></a>MON87429 primer 2</td><td><a id="p100117"></a>CCA TCA TAC TCA TTG CTG ATC CAT GTA</td><td><a id="p100118"></a>27</td></tr>
<tr><td><a id="p100119"></a>TaqMan-зонд</td><td><a id="p100120"></a>MON87429 probe</td><td><a id="p100121"></a>6-FAM-TCC CGG ACA TGA AAC CAA ACA AGA GTG GTC-TAMRA</td><td><a id="p100122"></a>30</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100123"></a>Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы hmg</td></tr>
<tr><td><a id="p100124"></a>Прямой праймер</td><td><a id="p100125"></a>MaiJ-F</td><td><a id="p100126"></a>TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA</td><td><a id="p100127"></a>23</td></tr>
<tr><td><a id="p100128"></a>Обратный праймер</td><td><a id="p100129"></a>mhmg-R</td><td><a id="p100130"></a>GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T</td><td><a id="p100131"></a>22</td></tr>
<tr><td><a id="p100132"></a>TaqMan-зонд</td><td><a id="p100133"></a>mhmg-P</td><td><a id="p100134"></a>6-FAM-CAA TCC ACA CAA ACg CAC gCg TA-TAMRA</td><td><a id="p100135"></a>23</td></tr>
</table>


<a id="p100136"></a>4.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
<a id="p100137"></a>4.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события MON87429 и референсного гена кукурузы hmg (табл. 6).

<a id="p100138"></a>Таблица 6

<a id="p100139"></a>Объем реакционной смеси для амплификации
(на одну реакционную пробирку)


<table>
<colgroup><col width="60%"><col width="20%"><col width="20%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100140"></a>Компонент</td><td><a id="p100141"></a>Конечная концентрация</td><td><a id="p100142"></a>Объем, мкл/реакция</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100143"></a>ГМ-специфичная ДНК, MON87429</td></tr>
<tr><td><a id="p100144"></a>Реакционная смесь &lt;*&gt;</td><td><a id="p100145"></a>1x</td><td><a id="p100146"></a>12,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100147"></a>Праймер MON87429 primer 1 (10 мкМ)</td><td><a id="p100148"></a>400 нМ</td><td><a id="p100149"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100150"></a>Праймер MON87429 primer 2 (10 мкМ)</td><td><a id="p100151"></a>400 нМ</td><td><a id="p100152"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100153"></a>Зонд MON87429 probe (10 мкМ)</td><td><a id="p100154"></a>200 нМ</td><td><a id="p100155"></a>0,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100156"></a>Вода деионизированная</td><td><a id="p100157"></a>-</td><td><a id="p100158"></a>6,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100159"></a>Образец ДНК</td><td><a id="p100160"></a>-</td><td><a id="p100161"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100162"></a>Итого:</td><td></td><td><a id="p100163"></a>25 мкл</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100164"></a>Таксон-специфичная ДНК, hmg</td></tr>
<tr><td><a id="p100165"></a>Реакционная смесь &lt;*&gt;</td><td><a id="p100166"></a>1x</td><td><a id="p100167"></a>12,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100168"></a>Праймер MaiJ-F (10 мкМ)</td><td><a id="p100169"></a>300 нМ</td><td><a id="p100170"></a>0,75</td></tr>
<tr><td><a id="p100171"></a>Праймер mhmg-R (10 мкМ)</td><td><a id="p100172"></a>300 нМ</td><td><a id="p100173"></a>0,75</td></tr>
<tr><td><a id="p100174"></a>Зонд mhmg-P (10 мкМ)</td><td><a id="p100175"></a>160 нМ</td><td><a id="p100176"></a>0,4</td></tr>
<tr><td><a id="p100177"></a>Вода деионизированная</td><td><a id="p100178"></a>-</td><td><a id="p100179"></a>6,6</td></tr>
<tr><td><a id="p100180"></a>Образец ДНК</td><td><a id="p100181"></a>-</td><td><a id="p100182"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100183"></a>Итого:</td><td></td><td><a id="p100184"></a>25 мкл</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100185"></a>Примечание: &lt;*&gt; Реакционная смесь, содержащая урацил-ДНК-гликозилазу, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87429 [5]. Допускается применение реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.</td></tr>
</table>


<a id="p100186"></a>4.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
<a id="p100187"></a>4.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события MON87429 и одну для референсного гена кукурузы hmg).
<a id="p100188"></a>4.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 73,5 мкл реакционной смеси для трансформационного события MON87429 и для референсного гена кукурузы hmg в подготовленные пробирки. Добавляют по 14,0 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Каждую пробирку перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
<a id="p100189"></a>4.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 25 мкл в пробирки.

##### <a id="p100190"></a>4.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.

<a id="p100191"></a>4.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал для детекции свечения флуорофора 6-карбоксифлуоресцеина (англ. 6-carboxyfluorescein, далее - FAM, или аналогичный в зависимости от используемого прибора) для амплификации трансформационного события MON87429 и референсного гена hmg и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 7).

<a id="p100192"></a>Таблица 7

<a id="p100193"></a>Температурно-временной режим амплификации <*>


<table>
<colgroup><col width="40%"><col width="17%"><col width="14%"><col width="14%"><col width="14%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100194"></a>Стадия</td><td><a id="p100195"></a>Температура</td><td><a id="p100196"></a>Время (с)</td><td><a id="p100197"></a>Детекция</td><td><a id="p100198"></a>Циклы</td></tr>
<tr><td><a id="p100199"></a>Активация урацил-ДНК-гликозилазы</td><td><a id="p100200"></a>50</td><td><a id="p100201"></a>120</td><td><a id="p100202"></a>нет</td><td><a id="p100203"></a>1</td></tr>
<tr><td><a id="p100204"></a>Предварительная денатурация</td><td><a id="p100205"></a>95</td><td><a id="p100206"></a>600</td><td><a id="p100207"></a>нет</td><td><a id="p100208"></a>1</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100209"></a>Амплификация</td><td><a id="p100210"></a>95</td><td><a id="p100211"></a>15</td><td><a id="p100212"></a>нет</td><td rowspan="2"><a id="p100213"></a>45</td></tr>
<tr><td><a id="p100214"></a>60</td><td><a id="p100215"></a>60</td><td><a id="p100216"></a>да</td></tr>
<tr><td colspan="5"><a id="p100217"></a>Примечание: &lt;*&gt; Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87429. Температурно-временной корректируется с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.</td></tr>
</table>


<a id="p100218"></a>4.1.11. Пробирки с аликвотами помещают в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.


### <a id="p100219"></a>V. Метод идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы линии MON95379


<a id="p100220"></a>5.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON95379 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- <a id="p100221"></a>область ДНК, специфичная для трансформационного события MON95379, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;
- <a id="p100222"></a>таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность - ген hmg.
<a id="p100223"></a>5.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 5 геномных копий кукурузы линии MON95379 в 250 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 160 нг ДНК кукурузы.
<a id="p100224"></a>5.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в таблицах 8 - 11. Раствор 1 (табл. 8) получают путем смешивания определенного количества ДНК 100% ГМ-кукурузы линии MON95379 (кат. N AOCS 0521-А) с ДНК его традиционного аналога (исходя из расчета, что масса 91575 копий молекул ДНК гаплоидного генома кукурузы равна 2,73 пкг [7]). Для количественного определения трансформационного события MON95379 используется реакционная смесь (табл. 10) согласно протоколу JRC [6].
<a id="p100225"></a>Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

<a id="p100226"></a>Таблица 8

<a id="p100227"></a>Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК,
используемых для построения калибровочной кривой


<table>
<colgroup><col width="25%"><col width="13%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="15%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100228"></a>Показатель</td><td colspan="5"><a id="p100229"></a>Концентрация ДНК в растворе</td></tr>
<tr><td><a id="p100230"></a>Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО)</td><td><a id="p100231"></a>Раствор 2 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 1)</td><td><a id="p100232"></a>Раствор 3 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 2)</td><td><a id="p100233"></a>Раствор 4 (получен путем 4-кратного разбавления раствора 3)</td><td><a id="p100234"></a>Раствор 5 (получен путем 5-кратного разбавления раствора 4)</td></tr>
<tr><td><a id="p100235"></a>Общее содержание ДНК в реакции, нг</td><td><a id="p100236"></a>250</td><td><a id="p100237"></a>62</td><td><a id="p100238"></a>16</td><td><a id="p100239"></a>3,9</td><td><a id="p100240"></a>0,78</td></tr>
<tr><td><a id="p100241"></a>Количество копий гаплоидного генома кукурузы, копии</td><td><a id="p100242"></a>91575</td><td><a id="p100243"></a>22894</td><td><a id="p100244"></a>5723</td><td><a id="p100245"></a>1431</td><td><a id="p100246"></a>286</td></tr>
<tr><td><a id="p100247"></a>Трансформационное событие MON95379, копии</td><td><a id="p100248"></a>9158</td><td><a id="p100249"></a>2289</td><td><a id="p100250"></a>572</td><td><a id="p100251"></a>143</td><td><a id="p100252"></a>29</td></tr>
</table>


<a id="p100253"></a>Таблица 9

<a id="p100254"></a>Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов


<table>
<colgroup><col width="24%"><col width="16%"><col width="49%"><col width="11%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100255"></a>Олигонуклеотиды</td><td><a id="p100256"></a>Название</td><td><a id="p100257"></a>Последовательность (5'-3')</td><td><a id="p100258"></a>Длина, н.п.</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100259"></a>Мишень: ГМ-специфичная ДНК, трансформационное событие MON95379</td></tr>
<tr><td><a id="p100260"></a>Прямой праймер</td><td><a id="p100261"></a>MON95379 primer 1</td><td><a id="p100262"></a>CCA AGA AGA ACG ATT GGC AAA C</td><td><a id="p100263"></a>22</td></tr>
<tr><td><a id="p100264"></a>Обратный праймер</td><td><a id="p100265"></a>MON95379 primer 2</td><td><a id="p100266"></a>GGC ACA GGC ACG CCT CTG</td><td><a id="p100267"></a>18</td></tr>
<tr><td><a id="p100268"></a>TaqMan-зонд</td><td><a id="p100269"></a>MON95379 probe</td><td><a id="p100270"></a>6-FAM-ATG GGT ATT ATG GGT AGG CAC ATG GGA ATA TAG-TAMRA</td><td><a id="p100271"></a>33</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100272"></a>Мишень: таксон-специфичная ДНК, референсный ген кукурузы hmg</td></tr>
<tr><td><a id="p100273"></a>Прямой праймер</td><td><a id="p100274"></a>hmg primer 1</td><td><a id="p100275"></a>TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCT GA</td><td><a id="p100276"></a>23</td></tr>
<tr><td><a id="p100277"></a>Обратный праймер</td><td><a id="p100278"></a>hmg primer 2</td><td><a id="p100279"></a>GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T</td><td><a id="p100280"></a>22</td></tr>
<tr><td><a id="p100281"></a>TaqMan-зонд</td><td><a id="p100282"></a>hmg probe</td><td><a id="p100283"></a>6-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA</td><td><a id="p100284"></a>23</td></tr>
</table>


<a id="p100285"></a>5.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
<a id="p100286"></a>5.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события MON95379 и референсного гена кукурузы hmg (табл. 10).

<a id="p100287"></a>Таблица 10

<a id="p100288"></a>Объем реакционной смеси для амплификации
(на одну реакционную пробирку)


<table>
<colgroup><col width="60%"><col width="20%"><col width="20%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100289"></a>Компонент</td><td><a id="p100290"></a>Конечная концентрация</td><td><a id="p100291"></a>Объем, мкл/реакция</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100292"></a>ГМ-специфичная ДНК, MON95379</td></tr>
<tr><td><a id="p100293"></a>Реакционная смесь &lt;*&gt;</td><td><a id="p100294"></a>1x</td><td><a id="p100295"></a>12,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100296"></a>Праймер MON95379 primer 1 (10 мкМ)</td><td><a id="p100297"></a>400 нМ</td><td><a id="p100298"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100299"></a>Праймер MON95379 primer 2 (10 мкМ)</td><td><a id="p100300"></a>400 нМ</td><td><a id="p100301"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100302"></a>Зонд MON95379 probe (10 мкМ)</td><td><a id="p100303"></a>200 нМ</td><td><a id="p100304"></a>0,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100305"></a>Вода деионизированная</td><td><a id="p100306"></a>-</td><td><a id="p100307"></a>6,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100308"></a>Образец ДНК</td><td><a id="p100309"></a>-</td><td><a id="p100310"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100311"></a>Итого:</td><td></td><td><a id="p100312"></a>25 мкл</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100313"></a>Таксон-специфичная ДНК, hmg</td></tr>
<tr><td><a id="p100314"></a>Реакционная смесь &lt;*&gt;</td><td><a id="p100315"></a>1x</td><td><a id="p100316"></a>12,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100317"></a>Праймер hmg primer 1 (10 мкМ)</td><td><a id="p100318"></a>300 нМ</td><td><a id="p100319"></a>0,75</td></tr>
<tr><td><a id="p100320"></a>Праймер hmg primer 2 (10 мкМ)</td><td><a id="p100321"></a>300 нМ</td><td><a id="p100322"></a>0,75</td></tr>
<tr><td><a id="p100323"></a>Зонд hmg probe (10 мкМ)</td><td><a id="p100324"></a>160 нМ</td><td><a id="p100325"></a>0,4</td></tr>
<tr><td><a id="p100326"></a>Вода деионизированная</td><td><a id="p100327"></a>-</td><td><a id="p100328"></a>6,6</td></tr>
<tr><td><a id="p100329"></a>Образец ДНК</td><td><a id="p100330"></a>-</td><td><a id="p100331"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100332"></a>Итого:</td><td></td><td><a id="p100333"></a>25 мкл</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100334"></a>Примечание: &lt;*&gt; Реакционная смесь, содержащая урацил-ДНК-гликозилазу, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON95379 [5]. Допускается применение реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.</td></tr>
</table>


<a id="p100335"></a>5.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями хорошо перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
<a id="p100336"></a>5.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события MON95379 и одну для референсного гена кукурузы hmg).
<a id="p100337"></a>5.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 73,5 мкл реакционные смеси для трансформационного события MON95379 и для референсного гена кукурузы hmg в подготовленные пробирки. Добавляют по 14,0 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Перемешивают каждую пробирку на аппарате для встряхивания типа вортекс около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
<a id="p100338"></a>5.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 25 мкл в пробирки.

##### <a id="p100339"></a>5.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.

<a id="p100340"></a>5.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал FAM (или аналогичный канал для указанного флуорофора в зависимости от используемого прибора) для детекции амплификации трансформационного события MON95379 и референсного гена hmg и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 11).

<a id="p100341"></a>Таблица 11

<a id="p100342"></a>Температурно-временной режим амплификации <*>


<table>
<colgroup><col width="34%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="16%"><col width="17%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100343"></a>Стадия</td><td><a id="p100344"></a>Температура</td><td><a id="p100345"></a>Время (с)</td><td><a id="p100346"></a>Детекция</td><td><a id="p100347"></a>Циклы</td></tr>
<tr><td><a id="p100348"></a>Активация урацил-ДНК-гликозилазы</td><td><a id="p100349"></a>50</td><td><a id="p100350"></a>120</td><td><a id="p100351"></a>нет</td><td><a id="p100352"></a>1</td></tr>
<tr><td><a id="p100353"></a>Предварительная денатурация</td><td><a id="p100354"></a>95</td><td><a id="p100355"></a>600</td><td><a id="p100356"></a>нет</td><td><a id="p100357"></a>1</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100358"></a>Амплификация</td><td><a id="p100359"></a>95</td><td><a id="p100360"></a>15</td><td><a id="p100361"></a>нет</td><td><a id="p100362"></a>45</td></tr>
<tr><td><a id="p100363"></a>60</td><td><a id="p100364"></a>60</td><td><a id="p100365"></a>да</td><td></td></tr>
<tr><td colspan="5"><a id="p100366"></a>Примечание: &lt;*&gt; Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON95379. Температурно-временной режим корректируется с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.</td></tr>
</table>


<a id="p100367"></a>5.1.11. Пробирки с аликвотами помещают в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.


### <a id="p100368"></a>VI. Интерпретация результатов


<a id="p100369"></a>6.1. Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по одному каналу детекции с использованием программного обеспечения прибора.
<a id="p100370"></a>6.2. Результаты интерпретируют на основании наличия (отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct для каждой реакции.
<a id="p100371"></a>6.3. Калибровочная кривая представляет собой линию линейной регрессии зависимости пороговых циклов Ct калибровочных точек от значений логарифма количества копий генома кукурузы в растворах 1 - 5 (табл. 4, 8), которая строится с помощью электронных таблиц или непосредственно в программном обеспечении прибора. По полученным калибровочным кривым путем линейной интерполяции рассчитывается количество копий ГМ-специфичной ДНК и таксон-специфичной ДНК в анализируемых пробах.
<a id="p100372"></a>6.4. Содержание ГМО в пробе рассчитывается как отношение количества копий ГМ-специфичной ДНК к количеству копий таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах, по формуле (1):

<a id="p100373"></a> (1)

<a id="p100374"></a>6.5. В случае идентификации и количественного определения трансформационного события MON87429 или MON95379 делается вывод о наличии незарегистрированной линии ГМ-кукурузы в образце.






## <a id="p100375"></a>БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ


1. <a id="p100376"></a>Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. <a id="p100377"></a>ГОСТ 26678 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия".
3. <a id="p100378"></a>ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".
4. <a id="p100379"></a>ГОСТ IEC 61010-2-020 "Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам".
5. <a id="p100380"></a>Event-specific Method for the Quantification of maize MON 87429 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-07-19-VP.pdf.
6. <a id="p100381"></a>Event-specific Method for the Quantification of Maize MON 95379 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-06-20-VM.pdf.
7. <a id="p100382"></a>Plant DNA C-values Database. Royal Botanic Gardens, Kew. URL: https://cvalues.science.kew.org/.



<a id="p100383"></a>

---



## Иллюстрации

$\text{ГМО},\% = \frac{\text{Количество ГМ} - \text{специфичной ДНК}}{\text{Количество таксон} - \text{специфичной ДНК}} \times 100.$