Без названия
Актуально на 04.11.2026.
Как цитировать: Без названия. https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-5041
Документ 47997
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 ноября 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМ-КУКУРУЗЫ MON87429 И MON95379
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 4.2.0332-23
Методические рекомендации разработаны ФБУН «Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека» (Г.Ф. Мухаммадиева, А.Б. Бакиров, Д.О. Каримов, Э.Ф. Репина, Э.Р. Кудояров, Н.Ю. Хуснутдинова, С.С. Байгильдин, Я.В. Валова, Т.Г. Якупова, Д.Д. Каримов, Д.А. Смолянкин, А.А. Гизатуллина, А.Р. Ахмадеев).
I. Область применения и общие положения
1.1. Возрастание объемов производства и импорта трансгенной продукции, рост вероятности поступления пищевой продукции, полученной с применением генно-инженерно-модифицированных организмов (далее — ГМО), на внутренний продовольственный рынок, определяет необходимость совершенствования методов их идентификации. Контроль и мониторинг продукции, содержащей ГМО, обеспечивает биобезопасность Российской Федерации, предупреждая проникновение и расселение ГМО на территории Российской Федерации.
1.2. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) содержат описание методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной кукурузы (далее — ГМ-кукурузы) MON87429 и MON95379.
Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее — ПЦР-РВ) по технологии TaqMan <1>, могут быть использованы для контроля за ГМО в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения).
<1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.
1.3. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО основаны на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
1.4. МР могут применяться при контроле растительного сырья и пищевых продуктов на наличие ГМО на этапах гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза и реализации в Российской Федерации.
1.5. МР предназначены для лабораторий организаций Роспотребнадзора, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке.
II. Сущность метода
2.1. Метод выявления компонентов ГМО основан на использовании ПЦР-РВ. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО базируется на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
2.2. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:
- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);
- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).
2.3. Для построения калибровочных кривых рекомендуется использовать соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее — ССО <2>) с известным содержанием ДНК. Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) — по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.
<2> Например, ССО Института контрольных материалов и измерений (англ. Institute for Reference Materials and Measurements, JRC-IRMM) - https://crm.jrc.ec.europa.eu; ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (англ. American Oil Chemists Society, AOCS) - www.aocs.org (в свободном доступе); или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.
III. Испытательное и вспомогательное оборудование, расходные материалы и реактивы
3.1. При выполнении измерений применяются испытательное и вспомогательное оборудование, расходные материалы и реактивы, приведенные в таблицах 1 — 3.
Испытательное и вспомогательное оборудование
IV. Метод идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы линии MON87429
4.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON87429 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87429, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;
- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (англ. high mobility group, далее — hmg).
4.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 5 геномных копий кукурузы линии MON87429 в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 160 нг ДНК кукурузы.
4.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в таблицах 4 — 7. Раствор 1 (табл. 4) получают путем смешивания определенного количества ДНК 100% ГМ-кукурузы линии MON87429 (кат. № AOCS 0321-А) с ДНК его традиционного аналога (исходя из расчета, что масса 73260 копий молекул ДНК гаплоидного генома кукурузы равна 2,73 пкг [7]). Для количественного определения трансформационного события MON87429 используется реакционная смесь (табл. 6) согласно протоколу JRC [5].
Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК, используемых для построения калибровочной кривой
Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов
4.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
4.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события MON87429 и референсного гена кукурузы hmg (табл. 6).
Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)
4.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события MON87429 и одну для референсного гена кукурузы hmg).
4.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 73,5 мкл реакционной смеси для трансформационного события MON87429 и для референсного гена кукурузы hmg в подготовленные пробирки. Добавляют по 14,0 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Каждую пробирку перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
4.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 25 мкл в пробирки.
4.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.
4.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал для детекции свечения флуорофора 6-карбоксифлуоресцеина (англ. 6-carboxyfluorescein, далее — FAM, или аналогичный в зависимости от используемого прибора) для амплификации трансформационного события MON87429 и референсного гена hmg и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 7).
Температурно-временной режим амплификации <*>
4.1.11. Пробирки с аликвотами помещают в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.
V. Метод идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы линии MON95379
5.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON95379 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON95379, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;
- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген hmg.
5.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 5 геномных копий кукурузы линии MON95379 в 250 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 160 нг ДНК кукурузы.
5.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в таблицах 8 — 11. Раствор 1 (табл. 8) получают путем смешивания определенного количества ДНК 100% ГМ-кукурузы линии MON95379 (кат. № AOCS 0521-А) с ДНК его традиционного аналога (исходя из расчета, что масса 91575 копий молекул ДНК гаплоидного генома кукурузы равна 2,73 пкг [7]). Для количественного определения трансформационного события MON95379 используется реакционная смесь (табл. 10) согласно протоколу JRC [6].
Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
Количество геномных копий ГМ-кукурузы в растворах ДНК, используемых для построения калибровочной кривой
Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов
5.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
5.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события MON95379 и референсного гена кукурузы hmg (табл. 10).
Объем реакционной смеси для амплификации (на одну реакционную пробирку)
5.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями хорошо перемешивают на аппарате для встряхивания типа вортекс и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
5.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события MON95379 и одну для референсного гена кукурузы hmg).
5.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 73,5 мкл реакционные смеси для трансформационного события MON95379 и для референсного гена кукурузы hmg в подготовленные пробирки. Добавляют по 14,0 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Перемешивают каждую пробирку на аппарате для встряхивания типа вортекс около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
5.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 25 мкл в пробирки.
5.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.
5.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал FAM (или аналогичный канал для указанного флуорофора в зависимости от используемого прибора) для детекции амплификации трансформационного события MON95379 и референсного гена hmg и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 11).
Температурно-временной режим амплификации <*>
5.1.11. Пробирки с аликвотами помещают в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.
VI. Интерпретация результатов
6.1. Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по одному каналу детекции с использованием программного обеспечения прибора.
6.2. Результаты интерпретируют на основании наличия (отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct для каждой реакции.
6.3. Калибровочная кривая представляет собой линию линейной регрессии зависимости пороговых циклов Ct калибровочных точек от значений логарифма количества копий генома кукурузы в растворах 1 — 5 (табл. 4, 8), которая строится с помощью электронных таблиц или непосредственно в программном обеспечении прибора. По полученным калибровочным кривым путем линейной интерполяции рассчитывается количество копий ГМ-специфичной ДНК и таксон-специфичной ДНК в анализируемых пробах.
6.4. Содержание ГМО в пробе рассчитывается как отношение количества копий ГМ-специфичной ДНК к количеству копий таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах, по формуле (1):
6.5. В случае идентификации и количественного определения трансформационного события MON87429 или MON95379 делается вывод о наличии незарегистрированной линии ГМ-кукурузы в образце.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ 26678 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
3. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
4. ГОСТ IEC 61010-2-020 «Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам».
5. Event-specific Method for the Quantification of maize MON 87429 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-07-19-VP.pdf.
6. Event-specific Method for the Quantification of Maize MON 95379 by Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-06-20-VM.pdf.
7. Plant DNA C-values Database. Royal Botanic Gardens, Kew. URL: https://cvalues.science.kew.org/.
Иллюстрации
\text{ГМО},\% = \frac{\text{Количество ГМ} - \text{специфичной ДНК}}{\text{Количество таксон} - \text{специфичной ДНК}} \times 100.