---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-3888"
---

## Без названия

# Документ 37559


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
6 июня 2023 года


#### <a id="p100002"></a>4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

**БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ**

<a id="p100003"></a>**МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ЭНТЕРОВИРУСОВ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ**
МР 4.2.0327-23

1. <a id="p100005"></a>Разработаны ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора (Л.Н. Голицына, С.Г. Селиванова, В.В. Зверев, Н.В. Пономарева, Н.А. Новикова).
2. <a id="p100006"></a>Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 6 июня 2023 г.
3. <a id="p100007"></a>Введены впервые.


### <a id="p100008"></a>I. Общие положения и область применения


<a id="p100009"></a>1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют алгоритм проведения молекулярного типирования энтеровирусов способом частичного секвенирования области VP1 генома.
<a id="p100010"></a>1.2. Молекулярное типирование с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей региона VP1 является прямым методом идентификации серотипа энтеровируса, обладает высокими показателями специфичности.
<a id="p100011"></a>На основании молекулярно-биологических свойств энтеровирусы разделены на 4 вида, включающие вирусы более 100 серотипов (приложение 1 к настоящим МР): Enterovirus A, Enterovirus B, Enterovirus C, Enterovirus D (приложение 1 к настоящим МР). К виду Enterovirus C относятся полиовирусы 3 типов <1>. Наибольшее количество случаев заболеваний энтеровирусной инфекцией связано с вирусами видов Enterovirus A и Enterovirus B.

<a id="p100012"></a>

---

<a id="p100013"></a><1> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний: www.picornaviridae.com (в свободном доступе).

<a id="p100014"></a>Тип энтеровируса определяется с использованием молекулярного типирования, которое основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей капсидный белок VP1. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип вируса.
<a id="p100015"></a>1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских и медицинских организаций.


### <a id="p100016"></a>II. Показания к исследованию


<a id="p100017"></a>2.1. Метод молекулярного типирования энтеровирусов применяется при осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусной инфекцией, в том числе для проведения:
- <a id="p100018"></a>мониторинга циркуляции энтеровирусов разных типов;
- <a id="p100019"></a>расследования вспышек энтеровирусной инфекции;
- <a id="p100020"></a>расследования атипичных, тяжелых и летальных случаев энтеровирусной инфекции.
<a id="p100021"></a>2.2. Для проведения метода молекулярного типирования энтеровирусов необходимы условия для работы с возбудителями III группы патогенности и материалом, инфицированным или потенциально инфицированным диким полиовирусом <2>.

<a id="p100022"></a>

---

<a id="p100023"></a><2> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).


### <a id="p100024"></a>III. Техника безопасности


<a id="p100025"></a>3.1. Организация рабочих помещений и техника безопасности при работе с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом, осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <3>, а также методическими документами <4>.

<a id="p100026"></a>

---

<a id="p100027"></a><3> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21.
<a id="p100028"></a><4> МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее - МУ 1.3.2569-09).


### <a id="p100029"></a>IV. Оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы


<a id="p100030"></a>4.1. Настоящими МР рекомендуется применять оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы, приведенные в приложении 2.


### <a id="p100031"></a>V. Материал к исследованию



#### <a id="p100032"></a>5.1 Для определения типа энтеровируса исследуются:

- <a id="p100033"></a>нативные и пассированные в культуре ткани пробы клинического материала и объектов окружающей среды, в которых обнаружены энтеровирусы;
- <a id="p100034"></a>нетипирующиеся ЦПА, выделенные от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и из объектов окружающей среды;
- <a id="p100035"></a>энтеровирусы, выделенные и типированные в реакции нейтрализации в культуре ткани.
<a id="p100036"></a>5.2. Для проведения молекулярного типирования энтеровирусов используются следующие образцы материала: положительные на присутствие энтеровирусов суспензии фекалий, спинномозговая жидкость, мазки из ротоглотки, носо/ротоглоточные смывы, мокрота, содержимое везикул, секционный материал, концентраты проб воды; культуральная жидкость пассированных образцов (содержащая неполиомиелитные энтеровирусы или нетипируемые ЦПА). В качестве исходного материала могут быть использованы препараты РНК, экстрагированные из перечисленных образцов (в случае, если с момента экстракции прошло не более 24 часов, препарат хранят при температуре плюс 4 °C, замораживание не допускается), или кДНК (допускается хранение препарата кДНК при температуре плюс 4 °C, замораживание не рекомендуется).
<a id="p100037"></a>5.3. Сбор, обработку, упаковку, хранение и транспортировку материала осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <5>, а также методическими документами <6>.

<a id="p100038"></a>

---

<a id="p100039"></a><5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
<a id="p100040"></a><6> МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005.

<a id="p100041"></a>При проведении молекулярно-генетических исследований используются стерильные наконечники для микропипеток и микропробирки, все операции проводятся в одноразовых перчатках, защитных очках. При работе с исходными образцами и материалом, содержащим нуклеиновые кислоты, применяются наконечники с аэрозольным барьером.


### <a id="p100042"></a>VI. Молекулярное типирование энтеровирусов с использованием секвенирования области VP1 генома



#### <a id="p100043"></a>6.1 Порядок проведения исследований.

<a id="p100044"></a>Определение типа энтеровирусов проводится путем анализа области VP1 генома, включающего:
- <a id="p100045"></a>выделение РНК;
- <a id="p100046"></a>постановку реакции обратной транскрипции;
- <a id="p100047"></a>дифференциальную амплификацию фрагмента кДНК с праймерами, специфичными в отношении видов Enterovirus A и Enterovirus B (приложение 3 к настоящим МР);
- <a id="p100048"></a>в случае отрицательного результата видоспецифичной амплификации проводят реакцию с праймерами, универсальными для видов Enterovirus A - D;
- <a id="p100049"></a>очистку фрагмента кДНК;
- <a id="p100050"></a>мечение фрагмента кДНК;
- <a id="p100051"></a>очистку меченого фрагмента кДНК;
- <a id="p100052"></a>определение нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК в автоматическом режиме;
- <a id="p100053"></a>определение типа энтеровируса методом сравнения полученной последовательности с последовательностями энтеровирусов, представленными в международной базе нуклеотидных последовательностей <7>.

<a id="p100054"></a>

---

<a id="p100055"></a><7> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей - blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).

<a id="p100056"></a>На стадиях выделения РНК, постановки обратной транскрипции и амплификации кДНК рекомендуется введение отрицательного контроля.

#### <a id="p100057"></a>6.2 Выделение РНК.

<a id="p100058"></a>Проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.

#### <a id="p100059"></a>6.3 Реакция обратной транскрипции.

<a id="p100060"></a>Реакцию проводят в 20 мкл непосредственно после получения РНК пробы. Реагенты:
- <a id="p100061"></a>ревертаза (M-MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, раствор дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ОТ, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;
- <a id="p100062"></a>праймеры AN32, AN33, AN34, AN35.
<a id="p100063"></a>Порядок проведения работы:
- <a id="p100064"></a>приготовить смесь праймеров - указанные праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл смешать в отдельной пробирке в равных объемах;
- <a id="p100065"></a>в промаркированные амплификационные пробирки внести по 1 мкл смеси праймеров AN32 - 35 (конечная концентрация 2 пкмоль/мкл каждого);
- <a id="p100066"></a>индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 10,2 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;
- <a id="p100067"></a>инкубировать при 65 °C в течение 1 мин;
- <a id="p100068"></a>используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 1), смесь перемешать;
- <a id="p100069"></a>в пробирки с пробами внести по 8,8 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;
- <a id="p100070"></a>инкубировать по программе: 42 °C - 30 мин; 95 °C - 5 мин;
- <a id="p100071"></a>в каждую пробирку внести по 20 мкл ТЕ-буфера, кратко центрифугировать.

<a id="p100072"></a>Таблица 1

<a id="p100073"></a>Приготовление реакционной смеси для обратной транскрипции


<table>
<colgroup><col width="20%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100074"></a>Реагенты</td><td colspan="10"><a id="p100075"></a>Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)</td></tr>
<tr><td><a id="p100076"></a>1</td><td><a id="p100077"></a>2</td><td><a id="p100078"></a>3</td><td><a id="p100079"></a>4</td><td><a id="p100080"></a>5</td><td><a id="p100081"></a>6</td><td><a id="p100082"></a>7</td><td><a id="p100083"></a>8</td><td><a id="p100084"></a>9</td><td><a id="p100085"></a>10</td></tr>
<tr><td><a id="p100086"></a>ОТ-буфер</td><td><a id="p100087"></a>4,0</td><td><a id="p100088"></a>8,0</td><td><a id="p100089"></a>12,0</td><td><a id="p100090"></a>16,0</td><td><a id="p100091"></a>20,0</td><td><a id="p100092"></a>24,0</td><td><a id="p100093"></a>28,0</td><td><a id="p100094"></a>32,0</td><td><a id="p100095"></a>36,0</td><td><a id="p100096"></a>40</td></tr>
<tr><td><a id="p100097"></a>дНТФ</td><td><a id="p100098"></a>4,0</td><td><a id="p100099"></a>8,0</td><td><a id="p100100"></a>12,0</td><td><a id="p100101"></a>16,0</td><td><a id="p100102"></a>20,0</td><td><a id="p100103"></a>24,0</td><td><a id="p100104"></a>28,0</td><td><a id="p100105"></a>32,0</td><td><a id="p100106"></a>36,0</td><td><a id="p100107"></a>40</td></tr>
<tr><td><a id="p100108"></a>Ревертаза</td><td><a id="p100109"></a>0,4</td><td><a id="p100110"></a>0,8</td><td><a id="p100111"></a>1,2</td><td><a id="p100112"></a>1,6</td><td><a id="p100113"></a>2,0</td><td><a id="p100114"></a>2,4</td><td><a id="p100115"></a>2,8</td><td><a id="p100116"></a>3,2</td><td><a id="p100117"></a>3,6</td><td><a id="p100118"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100119"></a>Ингибитор РНКаз</td><td><a id="p100120"></a>0,4</td><td><a id="p100121"></a>0,8</td><td><a id="p100122"></a>1,2</td><td><a id="p100123"></a>1,6</td><td><a id="p100124"></a>2,0</td><td><a id="p100125"></a>2,4</td><td><a id="p100126"></a>2,8</td><td><a id="p100127"></a>3,2</td><td><a id="p100128"></a>3,6</td><td><a id="p100129"></a>4,0</td></tr>
</table>


<a id="p100130"></a>По 5 мкл полученной кДНК перенести в промаркированные пробирки отдельно для каждого способа амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов. Оставшуюся часть кДНК - хранить при температуре плюс 4 °C.

#### <a id="p100131"></a>6.4 Амплификация фрагментов кДНК области VP1 генома энтеровирусов.

<a id="p100132"></a>Реагенты:
- <a id="p100133"></a>Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с "отложенным стартом" 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; ДМСО; деионизованная вода, свободная от РНКаз; или наборы реагентов для постановки ПЦР;
- <a id="p100134"></a>праймеры: для дифференциальной и универсальной амплификации области VP1 генома энтеровирусов методом двухраундовой ПЦР используют комбинации праймеров (табл. 2).

<a id="p100135"></a>Таблица 2

<a id="p100136"></a>Комбинации олигонуклеотидных праймеров, используемых
на разных этапах амплификации и секвенирования кДНК области
VP1 генома энтеровирусов


<table>
<colgroup><col width="25%"><col width="23%"><col width="25%"><col width="27%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100137"></a>Этап амплификации</td><td colspan="3"><a id="p100138"></a>Способ амплификации</td></tr>
<tr><td><a id="p100139"></a>Специфичный для Enterovirus A</td><td><a id="p100140"></a>Специфичный для Enterovirus B</td><td><a id="p100141"></a>Специфичный для Enterovirus A - D</td></tr>
<tr><td><a id="p100142"></a>1 раунд ПЦР</td><td><a id="p100143"></a>486 и 488</td><td><a id="p100144"></a>490 и 492</td><td><a id="p100145"></a>AN222 и AN224</td></tr>
<tr><td><a id="p100146"></a>2 раунд ПЦР</td><td><a id="p100147"></a>AN89 и EvAR</td><td><a id="p100148"></a>AN89 и EvBR</td><td><a id="p100149"></a>AN89 и AN88</td></tr>
<tr><td><a id="p100150"></a>Секвенирование</td><td><a id="p100151"></a>232 и 233m</td><td><a id="p100152"></a>232 и 233m</td><td><a id="p100153"></a>232 и 233</td></tr>
</table>


<a id="p100154"></a>Амплификацию кДНК с праймерами, специфичными в отношении вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B или универсальными для Enterovirus A - D, проводят отдельно в разных пробирках в 2 раунда.

##### <a id="p100155"></a>6.4.1 Первый раунд ПЦР.

<a id="p100156"></a>Реакцию проводят в 15 мкл смеси. Порядок проведения работы:
- <a id="p100157"></a>приготовить смесь праймеров для 1-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));
- <a id="p100158"></a>отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 3);
- <a id="p100159"></a>в амплификационные пробирки, содержащие по 5 мкл кДНК, внести по 10 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;
- <a id="p100160"></a>инкубировать в амплификаторе по программе для 1-го раунда ПЦР области VP1 генома:
<a id="p100161"></a>[95 °C - 1 мин (95 °C - 20 сек; 42 °C - 20 сек; 60 °C - 20 сек) x 40 циклов, 60 °C - 5 мин] <8>.

<a id="p100162"></a>

---

<a id="p100163"></a><8> Примечание: не допускается электрофоретическая детекция продукта первого раунда ПЦР перед постановкой второго раунда.

<a id="p100164"></a>Таблица 3

<a id="p100165"></a>Приготовление реакционной смеси для 1 раунда ПЦР


<table>
<colgroup><col width="24%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100166"></a>Реагенты</td><td colspan="10"><a id="p100167"></a>Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)</td></tr>
<tr><td><a id="p100168"></a>1</td><td><a id="p100169"></a>2</td><td><a id="p100170"></a>3</td><td><a id="p100171"></a>4</td><td><a id="p100172"></a>5</td><td><a id="p100173"></a>6</td><td><a id="p100174"></a>7</td><td><a id="p100175"></a>8</td><td><a id="p100176"></a>9</td><td><a id="p100177"></a>10</td></tr>
<tr><td><a id="p100178"></a>ПЦР-буфер</td><td><a id="p100179"></a>3,0</td><td><a id="p100180"></a>6,0</td><td><a id="p100181"></a>9,0</td><td><a id="p100182"></a>12,0</td><td><a id="p100183"></a>15,0</td><td><a id="p100184"></a>18,0</td><td><a id="p100185"></a>21,0</td><td><a id="p100186"></a>24,0</td><td><a id="p100187"></a>27,0</td><td><a id="p100188"></a>30,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100189"></a>дНТФ</td><td><a id="p100190"></a>0,9</td><td><a id="p100191"></a>1,8</td><td><a id="p100192"></a>2,7</td><td><a id="p100193"></a>3,6</td><td><a id="p100194"></a>4,5</td><td><a id="p100195"></a>5,4</td><td><a id="p100196"></a>6,3</td><td><a id="p100197"></a>7,2</td><td><a id="p100198"></a>8,1</td><td><a id="p100199"></a>9,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100200"></a>Смесь праймеров</td><td><a id="p100201"></a>0,2</td><td><a id="p100202"></a>0,4</td><td><a id="p100203"></a>0,6</td><td><a id="p100204"></a>0,8</td><td><a id="p100205"></a>1,0</td><td><a id="p100206"></a>1,2</td><td><a id="p100207"></a>1,4</td><td><a id="p100208"></a>1,6</td><td><a id="p100209"></a>1,8</td><td><a id="p100210"></a>2,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100211"></a>Taq полимераза</td><td><a id="p100212"></a>0,1</td><td><a id="p100213"></a>0,2</td><td><a id="p100214"></a>0,3</td><td><a id="p100215"></a>0,4</td><td><a id="p100216"></a>0,5</td><td><a id="p100217"></a>0,6</td><td><a id="p100218"></a>0,7</td><td><a id="p100219"></a>0,8</td><td><a id="p100220"></a>0,9</td><td><a id="p100221"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100222"></a>Вода</td><td><a id="p100223"></a>5,8</td><td><a id="p100224"></a>11,6</td><td><a id="p100225"></a>17,4</td><td><a id="p100226"></a>23,2</td><td><a id="p100227"></a>29,0</td><td><a id="p100228"></a>34,8</td><td><a id="p100229"></a>40,6</td><td><a id="p100230"></a>46,4</td><td><a id="p100231"></a>51,2</td><td><a id="p100232"></a>58,0</td></tr>
</table>



##### <a id="p100233"></a>6.4.2 Второй раунд ПЦР.

<a id="p100234"></a>Реакцию проводят в 30 мкл смеси. Порядок проведения работы:
- <a id="p100235"></a>приготовить смесь праймеров для 2-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));
- <a id="p100236"></a>отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 4);
- <a id="p100237"></a>в промаркированные амплификационные пробирки, содержащие по 25 мкл реакционной смеси, внести по 5 мкл амплификата 1 раунда ПЦР, кратко центрифугировать;
- <a id="p100238"></a>инкубировать в амплификаторе по программе для 2-го раунда ПЦР области VP1 генома:
<a id="p100239"></a>[95 °C - 15 мин (95 °C - 10 сек; 60 °C - 10 сек; 72 °C - 10 сек) x 42 цикла, 72 °C - 5 мин].

<a id="p100240"></a>Таблица 4

<a id="p100241"></a>Приготовление реакционной смеси для 2-го раунда ПЦР


<table>
<colgroup><col width="23%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="9%"><col width="7%"><col width="9%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100242"></a>Реагенты</td><td colspan="10"><a id="p100243"></a>Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл)</td></tr>
<tr><td><a id="p100244"></a>1</td><td><a id="p100245"></a>2</td><td><a id="p100246"></a>3</td><td><a id="p100247"></a>4</td><td><a id="p100248"></a>5</td><td><a id="p100249"></a>6</td><td><a id="p100250"></a>7</td><td><a id="p100251"></a>8</td><td><a id="p100252"></a>9</td><td><a id="p100253"></a>10</td></tr>
<tr><td><a id="p100254"></a>ПЦР-буфер</td><td><a id="p100255"></a>6,0</td><td><a id="p100256"></a>12,0</td><td><a id="p100257"></a>18,0</td><td><a id="p100258"></a>24,0</td><td><a id="p100259"></a>30,0</td><td><a id="p100260"></a>36,0</td><td><a id="p100261"></a>42,0</td><td><a id="p100262"></a>48,0</td><td><a id="p100263"></a>54,0</td><td><a id="p100264"></a>60,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100265"></a>дНТФ</td><td><a id="p100266"></a>1,8</td><td><a id="p100267"></a>3,6</td><td><a id="p100268"></a>5,4</td><td><a id="p100269"></a>7,2</td><td><a id="p100270"></a>9,0</td><td><a id="p100271"></a>10,8</td><td><a id="p100272"></a>12,6</td><td><a id="p100273"></a>14,4</td><td><a id="p100274"></a>16,2</td><td><a id="p100275"></a>18,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100276"></a>Смесь праймеров</td><td><a id="p100277"></a>0,4</td><td><a id="p100278"></a>0,8</td><td><a id="p100279"></a>1,2</td><td><a id="p100280"></a>1,6</td><td><a id="p100281"></a>2,0</td><td><a id="p100282"></a>2,4</td><td><a id="p100283"></a>2,8</td><td><a id="p100284"></a>3,2</td><td><a id="p100285"></a>3,6</td><td><a id="p100286"></a>4,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100287"></a>Taq полимераза &lt;*&gt;</td><td><a id="p100288"></a>0,2</td><td><a id="p100289"></a>0,4</td><td><a id="p100290"></a>0,6</td><td><a id="p100291"></a>0,8</td><td><a id="p100292"></a>1,0</td><td><a id="p100293"></a>1,2</td><td><a id="p100294"></a>1,4</td><td><a id="p100295"></a>1,6</td><td><a id="p100296"></a>1,8</td><td><a id="p100297"></a>1,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100298"></a>ДМСО</td><td><a id="p100299"></a>0,6</td><td><a id="p100300"></a>1,2</td><td><a id="p100301"></a>1,8</td><td><a id="p100302"></a>2,4</td><td><a id="p100303"></a>3,0</td><td><a id="p100304"></a>3,6</td><td><a id="p100305"></a>4,2</td><td><a id="p100306"></a>4,8</td><td><a id="p100307"></a>5,4</td><td><a id="p100308"></a>6,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100309"></a>Вода</td><td><a id="p100310"></a>16,0</td><td><a id="p100311"></a>32,0</td><td><a id="p100312"></a>48,0</td><td><a id="p100313"></a>64,0</td><td><a id="p100314"></a>80,0</td><td><a id="p100315"></a>96,0</td><td><a id="p100316"></a>112,0</td><td><a id="p100317"></a>88,0</td><td><a id="p100318"></a>144,0</td><td><a id="p100319"></a>160,0</td></tr>
<tr><td colspan="11"><a id="p100320"></a>Примечание: &lt;*&gt; для 2-го раунда используют химически модифицированную Taq ДНК-полимеразу для ПЦР с "отложенным стартом".</td></tr>
</table>


<a id="p100321"></a>В результате ПЦР области VP1 генома синтезируют продукт размером 375 п.н., который визуализируют методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле. При постановке проверочного электрофореза в лунку наносят 5 мкл амплификата. Электрофорез проводится при напряжении 150 В в течение 15 - 20 мин.

#### <a id="p100322"></a>6.5 Очистка полученных фрагментов ДНК для секвенирования.

<a id="p100323"></a>Для очистки используют весь оставшийся объем амплификата (25 мкл). Очистку проводят из амплификата (если отсутствуют фрагменты ДНК неспецифичного размера) или агарозного геля (если в результате электрофореза наряду со специфичным продуктом визуализируются фрагменты ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК определяют методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.

#### <a id="p100324"></a>6.6 Секвенирование кДНК энтеровирусов в автоматическом режиме.

<a id="p100325"></a>Набор реагентов для мечения ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению. В случае использования капиллярных секвенаторов мечение фрагментов кДНК энтеровирусов проводят с использованием праймеров AN232 и AN233 или AN233m в соответствии со способом амплификации (табл. 2).
<a id="p100326"></a>Очистку меченой ДНК и секвенирование в автоматическом режиме осуществляют в соответствии с протоколом производителя.
<a id="p100327"></a>Меченые и очищенные фрагменты ДНК секвенируют в автоматическом режиме.
<a id="p100328"></a>В случае использования капиллярных секвенаторов устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК. При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов и читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК (пики примерно одинаковой высоты). Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид прочитывают по одному разу в каждом из направлений.
<a id="p100329"></a>Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют методом сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидными последовательностями энтеровирусов с использованием программного обеспечения <9>. Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP1 генома энтеровируса того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75,0%.

<a id="p100330"></a>

---

<a id="p100331"></a><9> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей blast.ncbi.nlm.nih.gov (в свободном доступе). Примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для сравнения установленной нуклеотидной последовательности.

<a id="p100332"></a>6.7. Результаты молекулярного типирования энтеровирусов загружаются в федеральную государственную информационную систему сведений санитарно-эпидемиологического характера (ФГИС СЭХ) <10>.

<a id="p100333"></a>

---

<a id="p100334"></a><10> Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".


#### <a id="p100335"></a>6.8 Интерпретация результатов.

<a id="p100336"></a>Типирование энтеровирусов с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона является прямым методом и характеризуется высокой специфичностью. Установленный с использованием данного метода тип вируса соответствует типу, определяемому в реакции нейтрализации с использованием набора гипериммунных сывороток. Если гомология установленной последовательности ни с одной из представленных последовательностей энтеровирусов известных типов не превышает 75,0%, то предполагают выявление энтеровируса нового типа. Образцы, содержащие изоляты, соответствующие данным критериям, направляются для дальнейшего изучения в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора <11>, а также могут быть направлены в подведомственные организации Роспотребнадзора <12>.

<a id="p100337"></a>

---

<a id="p100338"></a><11> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".
<a id="p100339"></a><12> Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ХНИИЭМ Роспотребнадзора; Урало-Сибирский региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ФНИИВИ "Виром" Роспотребнадзора.


#### <a id="p100340"></a>6.9 Эффективность метода.

<a id="p100341"></a>Данный алгоритм молекулярного типирования энтеровирусов был испытан на панели, содержащей 100 энтеровирус-положительных образцов. Тип энтеровируса установлен в 96% случаев. Включение в алгоритм исследований способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B, в дополнение к способу универсальной амплификации генома энтеровирус видов Enterovirus A - D, повышает эффективность молекулярного типирования на 46,97%.





<a id="p100342"></a>Приложение 1
к МР 4.2.0327-23

<a id="p100343"></a>**ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ**
**ВИРУСОВ ВИДОВ ENTEROVIRUS A - D <13>**


<a id="p100344"></a>

---

<a id="p100345"></a><13> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний www.picornaviridae.com (в свободном доступе).


<table>
<colgroup><col width="36%"><col width="64%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100346"></a>Виды</td><td><a id="p100347"></a>Представители</td></tr>
<tr><td><a id="p100348"></a>Enterovirus A</td><td><a id="p100349"></a>вирусы Коксаки A 2 - 8, 10, 12, 14, 16; энтеровирусы A71, A76, A89 - A92, A114, A119, A120, A121, A122, A123, A124, A125</td></tr>
<tr><td><a id="p100350"></a>Enterovirus B</td><td><a id="p100351"></a>вирус Коксаки A9; вирусы Коксаки B 1 - 6; вирусы ECHO 1 - 7, 9, 11 - 21, 24 - 27, 29 - 33; энтеровирусы B69, B73 - B75, B77 - B88, B93, B97, B98, B100, B101, B106, B107, B110 - B114</td></tr>
<tr><td><a id="p100352"></a>Enterovirus C</td><td><a id="p100353"></a>полиовирусы 1 - 3; вирусы Коксаки A 1, 11, 13, 17, 19 - 22, 24; энтеровирусы C95, C96, C102, C104, C105, C109, C113, C116, C117, C118</td></tr>
<tr><td><a id="p100354"></a>Enterovirus D</td><td><a id="p100355"></a>энтеровирусы D68, D70, D94, D111, D120</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100356"></a><a id="p100357"></a><a id="p100358"></a><a id="p100359"></a>Примечание:<br>- вирус ECHO8 реклассифицирован как штамм ECHO1;<br>- вирус Коксаки A15 реклассифицирован как штамм Коксаки A11;<br>- вирус Коксаки A18 реклассифицирован как штамм Коксаки A13.</td></tr>
</table>






<a id="p100360"></a>Приложение 2
к МР 4.2.0327-23

<a id="p100361"></a>**ОБОРУДОВАНИЕ, РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ,**
**ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, РЕАГЕНТЫ И РЕАКТИВЫ <14>**


<a id="p100362"></a>

---

<a id="p100363"></a><14> Примечание: допускается применение оборудования, расходных материалов, питательных сред, реагентов и реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

1. <a id="p100364"></a>Материально-техническое обеспечение:
- <a id="p100365"></a>стандартное оборудование для ПЦР-лаборатории <15> (дополнительно для постановки 2-го раунда ПЦР отдельный ПЦР-бокс и набор автоматических дозаторов);
- <a id="p100366"></a>стандартное оборудование для секвенирования ДНК <10> (перечень оборудования, необходимого для проведения секвенирования продуктов амплификации, определяется в соответствии с инструкциями по эксплуатации производителей автоматических секвенаторов (например, капиллярные секвенаторы, приборы для нанопорового секвенирования));
- <a id="p100367"></a>компьютер с выходом в информационно-коммуникационную сеть Интернет.

<a id="p100368"></a>

---

<a id="p100369"></a><15> МУ 1.3.2569-09.

2. <a id="p100370"></a>Реагенты и тест-системы, зарегистрированные на территории Российской Федерации <16>:
- <a id="p100371"></a>для выделения РНК: наборы реагентов для выделения РНК;
- <a id="p100372"></a>для постановки обратной транскрипции: ревертаза (M-MLV обратная транскриптаза 200 ед./мкл), 5-кратный ОТ-буфер, готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;
- <a id="p100373"></a>для постановки ПЦР: Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; химически модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с "отложенным стартом" 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; деионизованная вода, свободная от РНКаз; диметилсульфоксид (далее - ДМСО); или комплект реагентов для постановки ПЦР;
- <a id="p100374"></a>маркер длины фрагментов ДНК в диапазоне 100 - 1000 п.н.;
- <a id="p100375"></a>олигонуклеотидные праймеры (рабочая концентрация праймеров амплификации в агарозном геле);
- <a id="p100376"></a>наборы реагентов для очистки ДНК, предназначенные для выделения ДНК из агарозного геля или из реакционных смесей;
- <a id="p100377"></a>реагенты для мечения очищенной кДНК (приобретаются в зависимости от модели используемого секвенатора).

<a id="p100378"></a>

---

<a id="p100379"></a><16> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий"; приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий" (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2012, регистрационный N 24852).





<a id="p100380"></a>Приложение 3
к МР 4.2.0237-23

<a id="p100381"></a>**ПРАЙМЕРЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЭНТЕРОВИРУСОВ**


<table>
<colgroup><col width="17%"><col width="52%"><col width="30%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100382"></a>Обозначение праймера</td><td><a id="p100383"></a>Последовательность 5' - 3'</td><td><a id="p100384"></a>Назначение</td></tr>
<tr><td><a id="p100385"></a>AN32</td><td><a id="p100386"></a>GTYTGCCA</td><td rowspan="4"><a id="p100387"></a>Синтез кДНК области VP1 генома [2]</td></tr>
<tr><td><a id="p100388"></a>AN33</td><td><a id="p100389"></a>GAYTGCCA</td></tr>
<tr><td><a id="p100390"></a>AN34</td><td><a id="p100391"></a>CCRTCRTA</td></tr>
<tr><td><a id="p100392"></a>AN35</td><td><a id="p100393"></a>RCTYTGCCA</td></tr>
<tr><td><a id="p100394"></a>486</td><td><a id="p100395"></a>TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNC</td><td rowspan="6"><a id="p100396"></a>1 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [2, 3]</td></tr>
<tr><td><a id="p100397"></a>488</td><td><a id="p100398"></a>GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTG</td></tr>
<tr><td><a id="p100399"></a>490</td><td><a id="p100400"></a>TGIGTIYTITGYRTICCITGGAT</td></tr>
<tr><td><a id="p100401"></a>492</td><td><a id="p100402"></a>GGRTTIGTIGWYTGCCA</td></tr>
<tr><td><a id="p100403"></a>224</td><td><a id="p100404"></a>GCIATGYTIGGIACICAYRT</td></tr>
<tr><td><a id="p100405"></a>222</td><td><a id="p100406"></a>CICCIGGIGGIAYRWACAT</td></tr>
<tr><td><a id="p100407"></a>EvAR</td><td><a id="p100408"></a>TACTGGACCNCCNGGNGGNRCRWACATRTA</td><td rowspan="2"><a id="p100409"></a>2 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [1]</td></tr>
<tr><td><a id="p100410"></a>EvBR</td><td><a id="p100411"></a>TACTGGACCNCCNGGNGGNAYRTACATNA</td></tr>
<tr><td><a id="p100412"></a>AN89</td><td><a id="p100413"></a>CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG</td><td rowspan="2"><a id="p100414"></a>2 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [2]</td></tr>
<tr><td><a id="p100415"></a>AN88</td><td><a id="p100416"></a>TACTTGACCACCTGGNGGNAYRWACAT</td></tr>
<tr><td><a id="p100417"></a>232</td><td><a id="p100418"></a>CCAGCACTGACAGCA</td><td rowspan="3"><a id="p100419"></a>Секвенирование фрагмента кДНК области VP1 генома [2]</td></tr>
<tr><td><a id="p100420"></a>233</td><td><a id="p100421"></a>TACTGGACCACCTGG</td></tr>
<tr><td><a id="p100422"></a>233m</td><td><a id="p100423"></a>TACTGGACCGCCGGG</td></tr>
</table>







## <a id="p100424"></a>Нормативные и методические документы


1. <a id="p100425"></a>Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. <a id="p100426"></a>Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".
3. <a id="p100427"></a>Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 N 2178 "Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера".
4. <a id="p100428"></a>СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".
5. <a id="p100429"></a>Приказ Минздрава России от 06.06.2012 N 4н "Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий".
6. <a id="p100430"></a>Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации".
7. <a id="p100431"></a>МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".
8. <a id="p100432"></a>МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию".
9. <a id="p100433"></a>МУ 3.1.1.2363-08 "Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции".






## <a id="p100434"></a>БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ


1. <a id="p100435"></a>Патент N 2743352 Российская Федерация. Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B: N 2020117726: заявл. 19.05.2020: опубл. 17.02.2021 / Голицына Л.Н.; правообладатель ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора // Бюллетень ФИПС "Изобретения. Полезные модели". 2021. N 5. 17.02.2021.
2. <a id="p100436"></a>Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44. P. 2698 - 2704.
3. <a id="p100437"></a>Oberste M.S., Maher K., Williams A.J., Dybdahl-Sissoko N., Brown B.A., Gookin M.S.,  S., Mishrik N., Uddin M., Pallansch M.A. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses // J. Gen. Virol. 2006. Vol. 87 (Pt 1). P. 119 - 128.



<a id="p100438"></a>

---



## Иллюстрации

$Pe\tilde{n}aranda$