Документ 23749

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Пирогенал, суппозитории ректальные	ФС.3.3.1.0048.15 Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на лекарственное средство пирогенал, суппозитории ректальные, которое представляет собой липополисахарид (ЛПС), выделенный из клеток Salmonella typhi.

ПРОИЗВОДСТВО

Технология получения ЛПС предусматривает культивирование производственного штамма (штамма-продуцента) в полусинтетической питательной среде, инактивацию микробных клеток формалином, поэтапное выделение и очистку ЛПС ферментативными методами.

Производственный штамм Salmonella typhi Ty2 4446 должен обладать типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами:

• на плотной питательной среде (мясопептонный агар) должен образовывать круглые, гладкие, выпуклые, блестящие колонии (S-форма);
• на висмут-сульфитном агаре должен образовывать блестящие колонии черного цвета;
• в мазках, окрашенных по Граму, должны присутствовать грамотрицательные палочки с закругленными концами;
• должен ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу с образованием кислоты без газа;
• должен продуцировать сероводород;
• не должен ферментировать лактозу и сахарозу;
• не должен образовывать индол;
• LD50 штамма при внутрибрюшинном заражении белых беспородных мышей должна быть не более 5 · 107 микробных клеток.

Основные этапы производства препарата

1. Получение биомассы и ее инактивация;

2. Концентрирование методом сепарирования;

3. Поэтапное выделение и очистка ЛПС ферментативными методами;

4. Получение готовой лекарственной формы препарата.

На этапе культивирования используют полусинтетическую питательную среду. Полученную биомассу проверяют на микробиологическую чистоту и типичность морфологии; проводят контроль биохимических свойств микроорганизмов; антигенные свойства проверяют в реакции агглютинации. Инактивацию микробных клеток проводят формалином, по окончании процесса инактивированную биомассу высевают на дифференциально-диагностическую питательную среду висмут-сульфитный агар для подтверждения отсутствия роста сальмонелл.

Инактивированную культуральную жидкость подвергают ферментативному гидролизу и сепарированию; из гидролизата ферментативными методами поэтапно выделяют ЛПС, а затем лиофилизируют, получая субстанцию-лиофилизат очищенного ЛПС. На стадии производства субстанцию испытывают по следующим показателям:

Описание. Порошок светло-кремового цвета. Определение проводят визуально.

Белок. Не более 3%. Испытания проводят колориметрическим методом по методу Лоури в соответствии с ОФС «Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах». Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Нуклеиновые кислоты. Не более 5%. Испытания проводят методом Спирина в соответствии с ОФС «Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина в иммунобиологических лекарственных препаратах». Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Углеводы. От 40 до 60%. Испытания проводят с антроновым реактивом в соответствии с ОФС «Определение сахаров спектрофотометрическим методом». Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Безвредность. Препарат должен быть безвредным. Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой () г, которым внутрибрюшинно вводят 1 мл раствора ЛПС с концентрацией 100 мкг/мл; срок наблюдения за животными составляет 5 дней. Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Оптическая плотность. Показания оптической плотности раствора липополисахарида при 256 нм не должны превышать 0,300; при 280 нм — не более 0,200. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимых областях». Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Потеря массы при высушивании. Не более 10%. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».

Определение минимальной пирогенной дозы (МПД) рабочей серии ЛПС. Одна МПД должна составлять () мкг ЛПС. Предварительно готовят раствор ЛПС в концентрации 100 мкг/мл, затем путем последовательных десятикратных разведений получают раствор с концентрацией 0,01 мкг/мл и из него — раствор с концентрацией 0,0075 мкг/мл (к 9 мл испытуемого образца с концентрацией 0,01 мкг/мл прибавляют 3 мл 0,9% раствора натрия хлорида). Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». За 1 ч до опыта у каждого кролика дважды с интервалом не менее 30 мин измеряют ректальную температуру. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2 °С. Животным вводят раствор препарата с концентрацией 0,0075 мкг/мл внутривенно из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Средний показатель повышения температуры должен составлять от 0,6 до 0,8 °С.

В случае, если средний показатель повышения температуры будет ниже 0,6 °С, вводят раствор препарата с концентрацией 0,01 мкг/мл по 1 мл на 1 кг массы животного; если средний показатель повышения температуры будет выше 0,8 °С, вводят раствор препарата с концентрацией 0,005 мкг/мл по 1 мл на 1 кг массы животного. Повторный контроль проводят на том же количестве кроликов. Если при повторном испытании после введения растворов с концентрацией 0,01 или 0,005 мкг/мл средний показатель повышения температуры у животных составит ниже 0,6 °С или выше 0,8 °С соответственно, препарат бракуют. Минимальное количество вещества, вводимого внутривенно, на 1 кг массы кролика, вызывающее среднее повышение температуры тела на 0,6-0,8 °С составляет МПД. Одна МПД должна составлять () мкг ЛПС.

Субстанцию — лиофилизат очищенного ЛПС используют для получения лекарственного препарата пирогенал, суппозитории ректальные.

ИСПЫТАНИЯ

Описание. Суппозитории желтовато-белого цвета однородной консистенции, цилиндрической формы с заостренным концом, диаметром не более 10 мм.

Подлинность. Должен быть пирогенным. Одна МПД должна составлять () мкг ЛПС (раздел «Специфическая активность»).

Средняя масса и отклонение от средней массы. . Определение проводят в соответствии с ОФС «Однородность массы дозированных лекарственных форм».

Температура и время плавления. Не более 20 мин. Один суппозиторий, залитый 50 мл воды очищенной, подогретой до температуры () °С, помещенный в конической колбе вместимостью 100 мл в термостат при температуре () °С, должен расплавиться в течение не более 20 мин.

Микробиологическая чистота. В 1 суппозитории допускается не более 300 колониеобразующих единиц (КОЕ) микробов-сапрофитов при отсутствии патогенных, условно-патогенных микроорганизмов и грибов. Испытания проводят в соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».

Безвредность. Должен быть безвредным. Для испытания отбирают 4 суппозитория. Испытуемые образцы помещают в пробирку вместимостью 20 мл и расплавляют на водяной бане при температуре 40-45 °С в течение 15-20 мин. Расплавленную массу вводят 5 беспородным белым мышам массой () г по 1 мл внутрибрюшинно со скоростью 0,1 мл/с шприцем вместимостью 1 см3. В течение 5 сут. животные должны оставаться живыми. В случае гибели хотя бы 1 животного опыт повторяют на удвоенном количестве мышей. Если при повторном испытании мыши остались живы, препарат считают прошедшим испытание. В противном случае препарат бракуют.

Специфическая активность. Должен быть пирогенным. При введении 1 МПД на 1 кг массы кролика средний показатель повышения температуры должен составлять 0,6-0,8 °С. Для определения специфической активности берут 3 суппозитория. В коническую колбу вместимостью 500 мл наливают 295 мл 0,9% раствора натрия хлорида и доводят его до закипания. В раствор опускают 3 суппозитория и ставят колбу на разогретую магнитную мешалку. Экстракцию пирогенала из суппозиториев проводят в течение 60 мин при интенсивном перемешивании, чтобы жировой слой разбивался на мельчайшие капельки, затем содержимое отстаивают в течение 10-15 мин. В результате полученный раствор пирогенала считают разведенным в 100 раз, т.е. до 0,5; 1; 1,5; 2 мкг/мл в зависимости от исходного содержания пирогенала в 1 суппозитории. Далее из нижнего слоя раствора делают разведение до 0,0075 мкг/мл. Трем кроликам вводят препарат в концентрации 0,0075 мкг/мл внутривенно из расчета 1 мл на 1 кг массы. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Средний показатель повышения температуры должен составлять 0,6-0,8 °С. Если повышение температуры будет ниже 0,6 °С или выше 0,8 °С, то испытуемый образец вводят повторно в концентрации 0,01 или 0,005 мкг/мл. Если при этом средний показатель повышения температуры будет ниже 0,6 °С или выше 0,8 °С, серию бракуют.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С.

---

Иллюстрации

17 \pm 1

0,0075 \pm 0,0025

0,0075 \pm 0,0025

0,0075 \pm 0,0025

1,6\text{г } \pm 5\%

37 \pm 1

37 \pm 1

15 \pm 1