---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-2273"
---

## Без названия

# Документ 23735


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
1 февраля 2016 г.


#### <a id="p100002"></a>4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

**БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ**

<a id="p100003"></a>**ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ**
**ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ**
МР 4.2.0108-16

1. <a id="p100005"></a>Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.В. Шеенков); ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора (В.А. Терновой, О.В. Пьянков, И.В. Плясунова, А.П. Агафонов, В.Н. Михеев); ФКУЗ "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (Т.Ю. Красовская, С.А. Щербакова, И.Н. Шарова, В.В. Кутырев); ФГБУ "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, подразделение "Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев); ГБУЗ "Инфекционная клиническая больница N 1" ДЗМ г. Москвы (Н.А. Малышев, М.А. Сайфуллин).
2. <a id="p100006"></a>Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2016 г.
3. <a id="p100007"></a>Введены впервые.


### <a id="p100008"></a>Список сокращений



| <a id="p100009"></a>ДНК | <a id="p100010"></a>дезоксирибонуклеиновая кислота |
| --- | --- |
| <a id="p100011"></a>ИФА | <a id="p100012"></a>иммуноферментный анализ |
| <a id="p100013"></a>НБМ | <a id="p100014"></a>новорожденные белые мыши |
| <a id="p100015"></a>ОТ-ПЦР | <a id="p100016"></a>обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция |
| <a id="p100017"></a>РН | <a id="p100018"></a>реакция нейтрализации |
| <a id="p100019"></a>РНК | <a id="p100020"></a>рибонуклеиновая кислота |
| <a id="p100021"></a>РСК | <a id="p100022"></a>реакция связывания комплемента |
| <a id="p100023"></a>РТГА | <a id="p100024"></a>реакция торможения гемагглютинации |



### 1. <a id="p100025"></a>Область применения


<a id="p100026"></a>1.1. Методические рекомендации (далее - МР) определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки денге (далее - ЛД) и носят рекомендательный характер.
<a id="p100027"></a>1.2. Настоящие МР предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.


### 2. <a id="p100028"></a>Нормативные ссылки


1. <a id="p100029"></a>Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. <a id="p100030"></a>Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
3. <a id="p100031"></a>Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.11.2013 N 64 "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)" (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2014, регистрационный номер 32325).
4. <a id="p100032"></a>Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 N 85 "О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2003, регистрационный номер 4558).
5. <a id="p100033"></a>Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.05.2007 N 27 "О реализации Международных медико-санитарных правил (2005)" (зарегистрировано в Минюсте России 31.05.2007, регистрационный номер 9575).
6. <a id="p100034"></a>Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.02.2016 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях санитарно-эпидемиологического характера" (зарегистрировано в Минюсте России 24.03.2016, регистрационный номер 41525).


### 3. <a id="p100035"></a>Общие положения


<a id="p100036"></a>Лихорадка денге относится к острым природно-очаговым арбовирусным инфекционным заболеваниям с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя, характеризующимся лихорадкой, общей интоксикацией, миалгией, артралгией, лимфоаденопатией, экзантемой, иногда геморрагическим синдромом.
<a id="p100037"></a>Возбудитель ЛД - вирус денге (Dengue virus), входящий в семейство Flaviviridae, род Flavivirus, серогруппу вируса денге (Dengue virus group), относится ко II группе патогенности (опасности) по классификации патогенности, действующей на территории Российской Федерации. Существует 4 субтипа вируса денге, различающихся серологически и генетически. Все четыре разновидности вируса денге способны вызвать ЛД, в том числе ее геморрагическую форму. Как правило, эта тяжелая форма возникает при повторном инфицировании другим субтипом вируса.
<a id="p100038"></a>Ареал ЛД охватывает территории более чем 100 тропических и субтропических стран Африки, Америки, Южной и Юго-Восточной Азии, Океании и Австралии. Имеется информация об эпидемиях и вспышках этого заболевания в южных регионах Европы. В Российской Федерации существует вероятность формирования аутохтонных очагов ЛД на территории Черноморского побережья (Сочи и Сочинский район, Крым).
<a id="p100039"></a>В последнее время в связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и деловых связей возникла проблема завозных случаев этих заболеваний из тропических и субтропических стран в неэндемичные районы. Известны данные об импортированных случаях ЛД в Швеции, Финляндии, других европейских странах, в США, лихорадки Чикунгунья в Японии, Германии, Италии и других государствах Европы, Китае, Израиле, москитной лихорадки Тоскана (эндемичной в Средиземноморском регионе) в США, Германии и Швеции. Имеется информация о завозных случаях других арбовирусных инфекций. В течение шести лет (2009 - 2014 гг.) сотрудниками Инфекционной больницы N 1 г. Москвы и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России было диагностировано в общей сложности 178 лабораторно верифицированных случаев: лихорадки денге (152), лихорадки Чикунгунья (16), лихорадки Западного Нила (6), москитных лихорадок (3) и японского энцефалита (1) среди лиц, госпитализированных после возвращения из поездок в тропические страны.
<a id="p100040"></a>По данным Роспотребнадзора в Российской Федерации наблюдалась следующая динамика регистрации завозных случаев ЛД: в 2012 г. - 63, в 2013 г. - 170, за 8 месяцев 2014 г. - 77, за 10 месяцев 2015 года - 100.
<a id="p100041"></a>В эндемичных странах мира ежегодно регистрируются до 100 млн случаев ЛД в классической форме и примерно 500000 в виде геморрагической лихорадки, летальность при которой достигает 15 - 20%. Источником инфекции являются больные люди, обезьяны, возможно летучие мыши. Известны 2 эпидемиологические формы ЛД: джунглевая и городская. Переносчиками вируса при джунглевой форме являются комары Aedes niveus (нападающие как на обезьян, так и на людей), при городской эпидемиологической форме лихорадки - синантропные комары преимущественно Aedes aegypti и Aedes albopictus. Вирус способен размножаться в комарах при температуре воздуха не ниже 22 °С.
<a id="p100042"></a>Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов. РНК кодирует три структурных (С, prM/М, Е) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) белков.
<a id="p100043"></a>Основным иммуногенным белком вириона является белок Е, который играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин N S1, который может секретироваться, инициирует активацию системы комплемента и играет важную роль в развитии шока при геморрагической ЛД.
<a id="p100044"></a>Инкубационный период ЛД составляет от 2 до 15 дней после укуса инфицированного комара (чаще 5 - 7 дней), после чего развивается лихорадка, продолжающаяся 6 - 7 дней и иногда носящая двухфазный характер. Заболевание начинается внезапно с повышения температуры до 39 - 40 °С, появления озноба, болей в костях и мышцах поясничного отдела позвоночника, прямых мышцах живота, крестце, коленных суставах. Отмечается резкая слабость, головная боль, боли в глазных яблоках, светобоязнь, головокружение, потеря аппетита, возможна тошнота и рвота, бессонница, ощущение сухости во рту и сухости губ. У большинства больных увеличиваются периферические лимфатические узлы. Часто появляется экзантема, для которой характерен полиморфизм. Могут быть геморрагические проявления различной степени выраженности (от петехий до органных кровотечений). Лихорадка продолжается 2 - 7 дней, иногда она носит двухфазный характер и, как правило, закачивается выздоровлением. Заболевание сопровождается ретроорбитальными болями, миалгией и артралгией. Отмечается покраснение кожи лица и груди с выраженной дерматографией. Примерно в 50% случаев регистрируется макулопапулезная сыпь. В крови регистрируется лейкопения и тромбоцитопения, повышение уровня трансаминаз. По клиническому течению различают 2 формы ЛД: лихорадочную форму (классическую) и геморрагическую (протекает более тяжело, возможно развитие шокового состояния). В Международной классификации болезней 10-го пересмотра классическая ЛД имеет код A90, геморрагическая ЛД - A91.
<a id="p100045"></a>Особенностью иммунопатогенеза геморрагической ЛД является то, что специфические антитела могут опосредовать феномен антителозависимого усиления инфекции. Антителозависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками, экспрессирующими рецепторы к Fc фрагментам иммуноглобулинов, после опсонизации антителами. Этот механизм может способствовать утяжелению течения заболевания, часто наблюдаемому при повторном инфицировании гетерологичным вирусом денге.
<a id="p100046"></a>При геморрагической ЛД летальность достигает 5%, а среди детей - до 15 - 20%. ЛД является ведущей причиной госпитализации и смерти детей в Юго-Восточной Азии.
<a id="p100047"></a>У реконвалесцентов, перенесших ЛД, типоспецифический иммунитет сохраняется в течение примерно 2 лет. Перекрестная устойчивость к инфицированию другим типом вируса непродолжительна и редко превышает 12 недель, поэтому уже через 2 - 3 месяца возможно повторное заболевание за счет заражения гетерологичным типом вируса. В течение жизни человек может последовательно переболеть ЛД, вызванной всеми типами вируса.


### 4. <a id="p100048"></a>Методы лабораторной диагностики лихорадки денге


<a id="p100049"></a>4.1. Для специфической диагностики ЛД используют иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследований.
<a id="p100050"></a>4.2. С начала клинических проявлений и до 7 дня болезни вирус денге может быть обнаружен методом ОТ-ПЦР в сгустке крови, цельной крови, сыворотке крови, плазме, а также в аутопсийном материале (печень, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг). Список коммерческих наборов для проведения ОТ-ПЦР приведен в прилож. 4. При получении положительного результата ОТ-ПЦР проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования.
<a id="p100051"></a>4.3. Для выделения вируса денге используют новорожденных белых мышей и культуры клеток (Vero, BHK-21), а также комариные культуры, например, С6/36. Процесс выделения и идентификации вируса денге довольно длительный и проводится в специализированных лабораториях с высоким уровнем защиты (BSL-3). Для выделения вируса используют пробы крови, сыворотки крови, плазмы, обогащенной лейкоцитами, полученные в острый период заболевания (первые 7 - 10 дней болезни), суспензии органов, взятых при аутопсии.
<a id="p100052"></a>4.4. Основным методом серодиагностики ЛД является иммуноферментный анализ (ИФА-IgM). Специфические антитела класса IgM выявляются у 50% пациентов, начиная с 3 - 5 суток после начала заболевания, а к 10 дню уже у 99%. Максимальные титры IgM наблюдаются через 2 недели после появления симптомов, постепенное снижение происходит в последующие 2 - 3 месяца. Возможна циркуляция IgM-антител в крови до полугода. Помимо ИФА-IgM антитела к вирусам денге можно выявлять в сыворотке или плазме больных непрямым методом МФА и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме или цельной крови). Иммуноглобулины класса G (IgG) в низких титрах обычно обнаруживаются к концу первой недели заболевания, значительно нарастают в последующий период и, вероятно, персистируют в течение всей жизни. Для выявления сероконверсии IgG вторая проба сыворотки обследуется с интервалом в 10 - 14 дней. Пик IgG антител приходится на 3 - 4 неделю заболевания, затем их концентрация снижается и остается, как правило, на определяемом уровне в течение длительного времени.
<a id="p100053"></a>При вторичном инфицировании гетерологичным вирусом денге титры антител нарастают быстрее в основном за счет иммуноглобулинов класса G. Титр IgM во время инфекции, вызванной гетерологичным типом вируса, значительно ниже, чем при первой встрече с возбудителем. Обнаружение IgG-антител имеет значение при ретроспективной диагностике заболевания и дифференциации первичной и вторичной инфекции, вызванной вирусами денге разных типов. Количественное определение IgM и IgG к вирусу денге позволяет определить первичное или вторичное инфицирование, что особенно важно для прогноза исхода заболевания.
<a id="p100054"></a>4.5. Белок NS1 (NS1-антиген) вируса денге детектируют методом ИФА (в сыворотке крови пациентов и в аутопсийном материале) и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме, цельной крови) в течение примерно 10 дней с момента появления клинических признаков заболевания, что объясняется высокой концентрацией и продолжительной персистенцией вируса в крови, достигающей 106 - 108 инфекционных вирусных частиц на мл. Обнаружение NSl-антигена указывает на присутствие вируса денге в организме больного.
<a id="p100055"></a>4.6. Другие серологические методы диагностики ЛД, такие как реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время используются редко. РН хотя и обладает высокой специфичностью (при ее использовании возможна идентификация серотипа вируса денге и дифференциация от других флавивирусных инфекций), однако является трудоемким неэкспрессным методом и может использоваться лишь в специализированной вирусологической лаборатории. РТГА также достаточно специфична, но, как и РСК, обладает низкой чувствительностью. РСК эффективна на поздних этапах заболевания, однако при ее использовании, как и в случае применения ИФА и МФА, возникают сложности по дифференциации ЛД от других родственных флавивирус ных инфекций.
<a id="p100056"></a>4.7. В настоящее время в Российской Федерации для серологической диагностики ЛД используются ИФА- и ПЦР-тест-системы. Перечень наборов реагентов и тест-систем для использования при лабораторной диагностике ЛД приведен в прилож. 4. Импортные наборы для выявления NS1-антигена вируса денге и антител классов IgM и IgG на основе метода иммунохроматографии могут быть скомбинированы в один тест, что удобно в использовании. Однако зарубежные тест-системы для постановки ИФА, МФА и иммунохроматографии пока не нашли применения в диагностических лабораториях России.
<a id="p100057"></a>4.8. Для постановки точного дифференциального диагноза ЛД серологическое обследование крови больных с подозрением на эту инфекцию необходимо проводить наиболее специфичным методом ИФА-IgM в четырех тест-системах: ИФA-IgM-дeнгe, ИФА-IgМ-лихорадка Западного Нила (ЗН), ИФА-IgМ-желтая лихорадка (ЖЛ), ИФА-IgМ-японский энцефалит (ЯЭ). Эти заболевания имеют часто сходные ареалы распространения, этиологически связаны с родственными флавивирусами, перекрестно реагирующими в серологических реакциях. Кроме того, ЛД целесообразно дифференцировать от близкой по клинической картине лихорадки Чикунгунья, распространенной как и ЛД в Африке, Южной Азии, а в последнее время - в Южной Америке и Европе.
<a id="p100058"></a>4.9. Лабораторное подтверждение диагноза ЛД основывается на наличии как минимум одного положительного результата на следующие тесты:
- <a id="p100059"></a>обнаружение РНК вирусов денге методом ОТ-ПЦР;
- <a id="p100060"></a>наличие NS1-антигена в одном образце сыворотки;
- <a id="p100061"></a>наличие IgM в одном образце сыворотки;
- <a id="p100062"></a>нарастание титра IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 2 - 3 недели, в четыре раза и более.
<a id="p100063"></a>4.10. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии на базе вирусологических лабораторий, лабораторий особо опасных инфекций в субъектах Российской Федерации, а также, при необходимости, в региональных центрах по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности, в референс-лабораториях.
<a id="p100064"></a>4.11. В соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.2008 N 88 при выявлении положительных результатов первичного обследования пациентов с геморрагическим синдромом, в том числе случаев с летальным исходом, полученный материал отправляется на подтверждающее тестирование в один из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности с прикрепленными субъектами Российской Федерации и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений или Национальный центр верификации диагностической деятельности, выполняющий функции Государственной коллекции - ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" <*>.

<a id="p100065"></a>

---

<a id="p100066"></a><*> ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" (630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл., тел.: (383) 336-60-10, факс (383) 336-74-09, e-mail: vector@vector.nsc.ru.


### 5. <a id="p100067"></a>Правила забора, упаковки и транспортирования клинического (или секционного) материала, порядок проведения исследований и координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику заболеваний, вызванных вирусом денге


<a id="p100068"></a>5.1. Забор, упаковку и транспортирование материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом денге, осуществляют в строгом соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", санитарных правил СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности" и методических указаний МУ 3.4.2552-09 "Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения".
<a id="p100069"></a>Забор, упаковку проводят в медицинских организациях. Забор материала от больных производится медицинскими работниками стационара, в который госпитализирован больной, под руководством специалиста Роспотребнадзора, подготовленного по вопросам диагностики особо опасных инфекционных болезней и биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности. В случае невозможности быстрого прибытия указанных специалистов забор материала от больного осуществляют два медицинских работника, один из которых должен быть подготовлен по биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности.
<a id="p100070"></a>Секционный материал отбирают медицинские работники патологоанатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям. Забор материала производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ЛД приведены в прилож. 1.
<a id="p100071"></a>5.2. При подозрении на ЛД от больных для исследования берут кровь. Для серологических исследований, основанных на выявлении нарастания титра антител в парных сыворотках, образцы крови забирают в острую стадию заболевания, а затем через 2 - 3 недели. В случае летального исхода исследуют секционный материал (кровь из сердца, кусочки печени, селезенки, легких, лимфатических узлов, тимуса, красного костного мозга).
<a id="p100072"></a>5.3. Оптимальные сроки детекции вируса денге и его маркеров в клиническом материале представлены в прилож. 2.
<a id="p100073"></a>5.4. Отправку секционного материала в лабораторию рекомендуется осуществлять в транспортной таре со стабилизирующей средой (прилож. 3).
<a id="p100074"></a>5.5. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, НРИФ, иммунохроматографическим методом, а также выделяя вирус на чувствительной биологической модели (при наличии разрешения на проведение работ с вирусом денге). В случае получения положительного результата ОТ-ПЦР, при наличии соответствующего оснащения лаборатории, проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования. Для секвенирования фрагментов генома и генотипирования вируса денге возможно использование протокола, приведенного в прилож. 5.
<a id="p100075"></a>5.6. Используемые на этапах первичного исследования материала от больного тест-системы и наборы реагентов должны быть разрешены к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
<a id="p100076"></a>5.7. Результаты исследований направляют в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и в учреждение, направившее материал.





<a id="p100077"></a>Приложение 1

<a id="p100078"></a>**СПОСОБЫ ВЗЯТИЯ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ**
**КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ**
**ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ**


<table>
<colgroup><col width="26%"><col width="74%"></colgroup>
<tr><td colspan="2"><a id="p100079"></a>1. Цельная кровь</td></tr>
<tr><td><a id="p100080"></a>1.1. Сбор материала</td><td><a id="p100081"></a>Забор крови производят натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в объеме 5 мл в специальную вакуумную систему (с 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%-й раствор цитрата натрия в соотношении 1: 9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя</td></tr>
<tr><td><a id="p100082"></a>1.2. Предобработка проб</td><td><a id="p100083"></a>Не требуется</td></tr>
<tr><td><a id="p100084"></a>1.3. Метод исследования</td><td><a id="p100085"></a>ОТ-ПЦР</td></tr>
<tr><td><a id="p100086"></a>1.4. Условия хранения материала</td><td><a id="p100087"></a>При температуре 2 - 8 °С - в течение 3 суток.<br>При температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца.<br>При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.<br>Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала</td></tr>
<tr><td><a id="p100088"></a>1.5. Условия транспортирования материала</td><td><a id="p100089"></a>В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:<br>- при температуре 0 - 4 °С - не более трех суток;<br>- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.<br>Температура транспортирования минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортирования без размораживания не более 4 дней</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100090"></a>2. Плазма крови</td></tr>
<tr><td><a id="p100091"></a>2.1. Сбор материала</td><td><a id="p100092"></a>Забор крови производят натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в объеме 5 мл в специальную вакуумную систему (с 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%-й раствор цитрата натрия в соотношении 1 : 9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя</td></tr>
<tr><td><a id="p100093"></a>2.2. Предобработка проб</td><td><a id="p100094"></a>Пробирку с кровью центрифугируют при 1 600 g в течение 10 мин, после чего стерильно отбирают в пробирку типа Эппендорф плазму крови</td></tr>
<tr><td><a id="p100095"></a>2.3. Метод исследования</td><td><a id="p100096"></a>ОТ-ПЦР</td></tr>
<tr><td><a id="p100097"></a>2.4. Условия хранения материала</td><td><a id="p100098"></a>При температуре 2 - 8 °С - в течение 3 суток.<br>При температуре минус 20 °С - в течение 1 месяца.<br>При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала</td></tr>
<tr><td><a id="p100099"></a>2.5. Условия транспортирования материала</td><td><a id="p100100"></a>В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:<br>- при температуре 0 - 4 °С - не более трех суток;<br>- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.<br>Температура транспортирования минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортирования без размораживания не более 4 дней</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100101"></a>3. Сыворотка крови</td></tr>
<tr><td><a id="p100102"></a>3.1. Сбор материала</td><td><a id="p100103"></a>Забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовые пробирки без антикоагулянта</td></tr>
<tr><td><a id="p100104"></a>3.2. Предобработка проб</td><td><a id="p100105"></a>Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. Затем центрифугируют при 800 - 1600 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Сыворотку переносят отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Сыворотка не должна быть гемолизированной</td></tr>
<tr><td><a id="p100106"></a>3.3. Метод исследования</td><td><a id="p100107"></a>ИФА<br>Иммунохимический анализ<br>Иммунохроматография<br>ОТ-ПЦР</td></tr>
<tr><td><a id="p100108"></a>3.4. Условия хранения материала</td><td><a id="p100109"></a>При температуре 2 - 8 °С - в течение 5 суток.<br>При температуре минус 20 °С - в течение года.<br>При температуре минус 70 °С - длительно.<br>Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала</td></tr>
<tr><td><a id="p100110"></a>3.5. Условия транспортирования материала</td><td><a id="p100111"></a>В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:<br>- при температуре 0 - 4 °С - не более трех суток;<br>- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.<br>Температура транспортирования минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортирования без размораживания не более 4 дней</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100112"></a>4. Аутопсийный материал</td></tr>
<tr><td><a id="p100113"></a>4.1. Сбор материала</td><td><a id="p100114"></a>В качестве секционного материала используются печень, селезенка, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг. Кусочки ткани объемом не более 1 х 1 х 1 см помещают в одноразовые стерильные пробирки с закручивающимися крышками или с защелкой, содержащие физиологический раствор или транспортную среду</td></tr>
<tr><td><a id="p100115"></a>4.2. Предобработка проб</td><td><a id="p100116"></a>Кусочки органов гомогенизируют в стерильных фарфоровых ступках и готовят 10%-ю суспензию на стерильном 0,9%-м растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10000 g в течение 30 секунд. Супернатант используют для выделения РНК и заражения культуры клеток</td></tr>
<tr><td><a id="p100117"></a>4.3. Метод исследования</td><td><a id="p100118"></a>ОТ-ПЦР, выделение вируса</td></tr>
<tr><td><a id="p100119"></a>4.4. Условия хранения материала</td><td><a id="p100120"></a>При комнатной температуре - в течение 6 часов.<br>При температуре 2 - 8 °С - в течение 3 суток.<br>При температуре минус 20 °С - в течение 1 недели.<br>При температуре минус 70 °С - длительно.<br>Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала</td></tr>
<tr><td><a id="p100121"></a>4.5. Условия транспортирования материала</td><td><a id="p100122"></a>В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:<br>- при температуре 0 - 4 °С - не более трех суток;<br>- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.<br>Температура транспортирования минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортирования без размораживания не более 4 дней</td></tr>
</table>






<a id="p100123"></a>Приложение 2

<a id="p100124"></a>**ОПТИМАЛЬНЫЕ СРОКИ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСА ДЕНГЕ И ЕГО МАРКЕРОВ**
**В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ**


<table>
<colgroup><col width="33%"><col width="33%"><col width="33%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100125"></a>Диагностический метод</td><td><a id="p100126"></a>Период детекции</td><td><a id="p100127"></a>Исследуемый материал</td></tr>
<tr><td><a id="p100128"></a>Выявление РНК вируса денге методом ОТ-ПЦР</td><td><a id="p100129"></a>с 1 по 7 день от начала клинических проявлений болезни</td><td><a id="p100130"></a>цельная кровь, сгусток крови, сыворотка крови, плазма, аутопсийный материал</td></tr>
<tr><td><a id="p100131"></a>Выявление NS1-антигена вируса денге методом:<br>ИФА</td><td rowspan="2"><a id="p100132"></a>с 1 по 10 день от начала клинических проявлений болезни</td><td><a id="p100133"></a>сыворотка крови, аутопсийный материал</td></tr>
<tr><td><a id="p100134"></a>иммунохроматографии</td><td><a id="p100135"></a>сыворотка крови, плазма крови, цельная кровь</td></tr>
<tr><td><a id="p100136"></a>IgM к вирусу денге методом ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии</td><td><a id="p100137"></a>после 3 - 5-го дня от начала клинических проявлений заболевания</td><td><a id="p100138"></a>сыворотка, плазма, цельная кровь</td></tr>
<tr><td><a id="p100139"></a>IgG к вирусу денге методом ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии</td><td><a id="p100140"></a>после 7-го дня от начала клинических проявлений заболевания и парная проба через 10 - 14 дней</td><td><a id="p100141"></a>сыворотка, плазма, цельная кровь</td></tr>
<tr><td><a id="p100142"></a>NS1-антиген вируса денге методом ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии</td><td><a id="p100143"></a>с 1-го по 10-й день от начала клинических проявлений заболевания</td><td><a id="p100144"></a>сыворотка, плазма, цельная кровь</td></tr>
<tr><td><a id="p100145"></a>Выделение вируса</td><td><a id="p100146"></a>с 1-го по 7 - 10-й день от начала клинических проявлений болезни</td><td><a id="p100147"></a>цельная кровь, сыворотка крови, плазма крови, обогащенная лейкоцитами, аутопсийный материал</td></tr>
</table>






<a id="p100148"></a>Приложение 3

<a id="p100149"></a>**СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ**

1. <a id="p100150"></a>Стабилизирующая среда для хранения и транспортирования материала для исследований методом ОТ-ПЦР.
<a id="p100151"></a>С целью предотвращения разрушения нуклеиновых кислот рекомендуется использование следующих транспортных сред в зависимости от вида исследуемого материала:
- <a id="p100152"></a>транспортная среда N 1, содержащая: NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРO4 2 мМ, сыворотка крупного рогатого скота 20%;
- <a id="p100153"></a>транспортная среда N 2, содержащая: сахароза 0,218 М, КН2РО4 0,0038 М, К2НРО4 0,0072 М, БСА 1%;
- <a id="p100154"></a>транспортная среда ESP (или эквивалент), содержащая: саркозил 1%; ЭДТА 0,05 М; свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/мл;
- <a id="p100155"></a>специальные транспортные среды, разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов.
<a id="p100156"></a>При необходимости длительного хранения и перевозки в отсутствии низкотемпературных холодильников рекомендуется использовать транспортную среду ESP (или эквивалент). Исследуемый материал может храниться в среде ESP (или эквиваленте) при температуре (25  5) °С в темном месте в течение 10 дней.
2. <a id="p100157"></a>Стабилизирующая среда для хранения и транспортирования материала для вирусологических исследований.
<a id="p100158"></a>Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортирования материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.
<a id="p100159"></a>Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную посуду.
<a id="p100160"></a>Состав:
- <a id="p100161"></a>среда для культур клеток N 199, содержащая 0,5% BSA;
- <a id="p100162"></a>пенициллин 2 х 106 ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 106 ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 106 ед./л.





<a id="p100163"></a>Приложение 4

<a id="p100164"></a>**ТЕСТ-СИСТЕМЫ И НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ**
**ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ**

<a id="p100165"></a>**ИФА:**
- <a id="p100166"></a>набор для определения антител IgM к возбудителю ЛД;
- <a id="p100167"></a>набор для определения антител IgG к возбудителю ЛД;
- <a id="p100168"></a>наборы реагентов для выявления антигенов вируса денге и антител классов IgM, IgG к нему методом иммуноферментного анализа.
<a id="p100169"></a>Иммунохроматография:
- <a id="p100170"></a>тест-система иммуноферментная для дифференцированного выявления IgM- и IgG-антител к антигенам вируса;
- <a id="p100171"></a>тест-система иммуноферментная;
- <a id="p100172"></a>тест-система иммуноферментная для определения антигена NS1;
- <a id="p100173"></a>тест-система иммуноферментная для определения IgG/IgM.
<a id="p100174"></a>Непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ):
- <a id="p100175"></a>система для выявления иммуноглобулинов М вируса денге типов 1 - 4 IIFT (IgM);
- <a id="p100176"></a>система для выявления иммуноглобулинов G вируса денге типов 1 - 4 IIFT (IgG);
- <a id="p100177"></a>система для выявления иммуноглобулинов G к вирусу клещевого энцефалита / вирусу Западного Нила / вирусу японского энцефалита / вирусу желтой лихорадки / вирусу денге (типы 1 - 4), IgG;
- <a id="p100178"></a>система для выявления иммуноглобулинов М к вирусу клещевого энцефалита / вирусу Западного Нила / вирусу японского энцефалита / вирусу желтой лихорадки / вирусу денге (типы 1 - 4), IgM.
<a id="p100179"></a>**ОТ-ПЦР:**
- <a id="p100180"></a>набор реагентов для амплификации кДНК вируса денге (субтипов 1 - 4) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
<a id="p100181"></a>Выделение РНК из исследуемого материала:
- <a id="p100182"></a>комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала.
<a id="p100183"></a>Обратная транскрипция:
- <a id="p100184"></a>комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК.





<a id="p100185"></a>Приложение 5

<a id="p100186"></a>**ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСА ДЕНГЕ**

<a id="p100187"></a>Обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и амплификации, секвенирование продуктов амплификации осуществляют в соответствии с нормативными правовыми актами и методическими документами, регламентирующими требования к безопасности работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) при использовании молекулярно-генетических методов исследования.
<a id="p100188"></a>Выделение РНК вируса денге осуществляется из 100 мкл исследуемого образца. Обратная транскрипция проводится со статистической смесью гексануклеотидов (статзатравкой) в течение 1 часа при температуре 37 °С. В случае использования коммерческих наборов реагентов для проведения реакции обратной транскрипции руководствуются инструкцией производителя.
<a id="p100189"></a>Амплификацию фрагментов для секвенирования проводят с праймерами (таблица), специфичными для консервативного участка нетранслируемого региона 5'-UTR и гена capsid protein С.

<a id="p100190"></a>Последовательности праймеров


| <a id="p100191"></a>Вирус денге | <a id="p100192"></a>Праймеры | <a id="p100193"></a>Структура олигонуклеотидной последовательности | <a id="p100194"></a>Температура отжига, °С | <a id="p100195"></a>Размер ампликона |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100196"></a>Субтип 1 - 4 | <a id="p100197"></a>F1 | <a id="p100198"></a>AGTTGTTAGTCTRYGTGGACCG | <a id="p100199"></a>51 |  |
| <a id="p100200"></a>Субтип 1 | <a id="p100201"></a>R398 | <a id="p100202"></a>AGCATRAGRAGCATGGTCAC | <a id="p100203"></a>51 | <a id="p100204"></a>417 |
| <a id="p100205"></a>Субтип 2 | <a id="p100206"></a>R458 | <a id="p100207"></a>GATCATGTGTGGTTCTCCRTT | <a id="p100208"></a>51 | <a id="p100209"></a>478 |
| <a id="p100210"></a>Субтип 3 | <a id="p100211"></a>R459 | <a id="p100212"></a>AATCATGCGCGGCTCTC | <a id="p100213"></a>51 | <a id="p100214"></a>475 |
| <a id="p100215"></a>Субтип 4 | <a id="p100216"></a>R345 | <a id="p100217"></a>ССТАТСТССТТCCTGААТССА | <a id="p100218"></a>51 | <a id="p100219"></a>365 |


<a id="p100220"></a>После обеззараживания исследуемого материала, выделения РНК и реакции обратной транскрипции проводят ПЦР в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):


<table>
<colgroup><col width="54%"><col width="46%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100221"></a>кДНК</td><td><a id="p100222"></a>5 мкл</td></tr>
<tr><td><a id="p100223"></a>10 x Taq буфер без Mg2+</td><td><a id="p100224"></a>3 мкл</td></tr>
<tr><td><a id="p100225"></a>100 mМ раствор MgCl2</td><td><a id="p100226"></a>1 мкл</td></tr>
<tr><td><a id="p100227"></a>5 mМ раствор dNTP</td><td><a id="p100228"></a>1 мкл</td></tr>
<tr><td><a id="p100229"></a>Смесь праймеров</td><td><a id="p100230"></a>5 мкл</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100231"></a>(концентрация каждого 10 , конечная концентрация 0,3 )</td></tr>
<tr><td><a id="p100232"></a>SmartTaq ДНК-полимераза</td><td><a id="p100233"></a>0,3 мкл</td></tr>
<tr><td><a id="p100234"></a>Вода для ПЦР</td><td><a id="p100235"></a>до конечного объема 30 мкл</td></tr>
</table>


<a id="p100236"></a>ПЦР проводят, используя программу амплификации, представленную в таблице:

<a id="p100237"></a>Температурные и временные режимы при проведении ПЦР


<table>
<colgroup><col width="34%"><col width="34%"><col width="32%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100238"></a>Температура, °С</td><td><a id="p100239"></a>Время (минуты : секунды)</td><td><a id="p100240"></a>Количество циклов</td></tr>
<tr><td><a id="p100241"></a>95</td><td><a id="p100242"></a>05:00</td><td><a id="p100243"></a>1</td></tr>
<tr><td><a id="p100244"></a>95</td><td><a id="p100245"></a>00:15</td><td rowspan="3"><a id="p100246"></a>40</td></tr>
<tr><td><a id="p100247"></a>50</td><td><a id="p100248"></a>00:20</td></tr>
<tr><td><a id="p100249"></a>72</td><td><a id="p100250"></a>00:40</td></tr>
<tr><td><a id="p100251"></a>72</td><td><a id="p100252"></a>02:00</td><td><a id="p100253"></a>1</td></tr>
<tr><td><a id="p100254"></a>4</td><td><a id="p100255"></a>хранение</td><td></td></tr>
</table>


<a id="p100256"></a>ПЦР-продукты разделяют в 2%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Фрагменты необходимой длины вырезают и выделяют из агарозного геля, используя наборы для выделения двухцепочечных молекул ДНК из продуктов ПЦР и агарозных гелей методом фильтрации на мембране.
<a id="p100257"></a>Секвенирование ПЦР-продуктов проводят с помощью наборов реагентов в соответствии с протоколами производителей, используя прямые и обратные праймеры. Последующий анализ продуктов реакции проводят в автоматическом секвенаторе, использующем капиллярный электрофорез.
<a id="p100258"></a>Анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей проводят сравнением с известными нуклеотидными последовательностями генотипов вируса денге, депонированными в международной базе данных NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).



<a id="p100259"></a>

---



## Иллюстрации

$\pm$

$\mu M/L$

$\mu M/L$