--- title: "Без названия" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-2257" --- ## Без названия # Документ 23718 **МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ** **ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ** | Вакцина туляремийная живая | ФС.3.3.1.0019.15
Взамен ГФ X, ст. 716
ФС 42-3178-95 | | --- | --- | Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину туляремийную живую, лиофилизат для приготовления суспензии для внутрикожного введения и накожного скарификационного нанесения, представляющую собой живую культуру вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ, лиофилизированную в стабилизирующей среде. Вакцина предназначена для профилактики туляремии и обеспечивает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 5 лет. **ПРОИЗВОДСТВО** Вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ должен иметь типичные культуральные, морфологические, биохимические и антигенные свойства; остаточная вирулентность (LD50) вакцинного штамма для белых мышей массой () г должна находиться в пределах от 102 до 2 · 106 живых микробных клеток (м.к.); штамм не должен вызывать гибель морской свинки при введении дозы, равной 5 · 109 м.к.; при накожной иммунизации морских свинок дозами 5 · 106 и 5 · 107 м.к. должен вызывать появление инфильтрата и гиперемии диаметром от 5 до 15 мм; при определении иммуногенности показатель ED50 для морских свинок должен быть не более 1000 микробных клеток. Перед приготовлением производственной культуры вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных иммуногенных (белых) колоний, образующихся на плотной питательной среде при посеве селезенки и регионарных лимфатических узлов. Технология производства вакцины предусматривает получение посевных культур I, II и III генераций штамма F. tularensis 15 НИИЭГ; процесс накопления биомассы, необходимой для приготовления микробной взвеси определенной концентрации; последующий розлив, замораживание, сублимационное высушивание; герметизацию и упаковку препарата. На стадиях приготовления посевных культур определяют pH, концентрацию микробных клеток, отсутствие посторонней микрофлоры. В качестве стабилизаторов используются вещества, разрешенные для производства иммунобиологических лекарственных препаратов: сахароза, натрия глутамат, тиомочевина, желатин. **ИСПЫТАНИЯ** Описание. Пористая масса белого с желтоватым оттенком цвета. Восстановленный препарат - гомогенная мутная суспензия белого с желтоватым оттенком цвета без посторонних примесей, осадка или хлопьев. Определение проводят визуально. Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с использованием иммуноглобулинов туляремийных диагностических флуоресцирующих в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата должно наблюдаться специфическое ярко-зеленое свечение по периферии микробных клеток. Время растворения. Должна полностью растворяться в течение 3 мин при добавлении 1 мл воды для инъекций при встряхивании. Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения". Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения". pH. От 6,8 до 7,2. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют 20 ампул, содержимое каждой ампулы растворяют в 1 мл воды для инъекций. Потеря в массе при высушивании. Не более 4,0%. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании". Для испытания используют 6 образцов. Средняя масса и отклонение от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах должен быть не более 5%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм". Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Препарат должен представлять чистую живую культуру вакцинного штамма туляремийного микроба. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" с использованием тиогликолевой среды. За один образец принимают содержимое двух ампул препарата. В ампулы вносят по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают и по 1 мл каждого образца высевают в 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35 °С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, другую - при температуре от 20 до 25 °С для выявления грибов. Через 5-7 сут. из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл в 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды, и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут. выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют при увеличении 90x10. В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения грамположительных кокков или палочек препарат считается загрязненным посторонней микрофлорой. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от туляремийных бактерий, из этого образца готовят 3 мазка, которые обрабатывают иммуноглобулинами туляремийными диагностическими флуоресцирующими, и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей с помощью люминесцентного микроскопа. Если не все бактерии, обнаруживаемые в препарате, специфически окрашиваются ярко-зеленым свечением по периферии микробных клеток - препарат считают не выдержавшим испытание. Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной и не вызывать гибель более одной морской свинки из 3. Вакцина, введенная 3 морским свинкам массой () г в объеме 1 мл подкожно в дозе 5 · 109 м.к., полученной в соответствии со стандартным образцом (CO) мутности (10 ME), эквивалентным 5 · 109 м.к./мл туляремийных бактерий, не должна вызывать гибель животных в течение 15 сут. наблюдения. В месте введения возможен некроз тканей кожи и подкожной клетчатки. В случае, если животные остаются живыми или наступает гибель одной морской свинки, препарат считают безопасным. В случае гибели 2 и более животных испытание повторяют на их удвоенном количестве. Если при повторном контроле наблюдается гибель аналогичного количества животных, препарат считают не выдержавшим испытание. Специфическая активность. 1. Концентрация микробных клеток. В препарате должно содержаться () · 1010 м.к. в 1 мл. Колебания результатов определений в отдельных ампулах серии не должны превышать 5% от средней арифметической величины. Определение проводят в трех образцах (один образец - содержимое двух ампул). В две ампулы с вакциной вносят по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, pH (7-7,2), и после получения гомогенной суспензии объединяют содержимое ампул. Из каждого образца 0,5 мл суспензии используют для определения концентрации микробных клеток в 1 мл вакцины. Для этого по 0,5 мл каждого образца вакцины вносят в отдельные стандартные пробирки и добавляют 0,9% раствор натрия хлорида до соответствия CO мутности (10 МЕ). Концентрацию микробных клеток (OK) определяют по формуле: , где: V - объем 0,9% раствора натрия хлорида, взятого на разведение пробы, мл; 0,5 - объем испытуемого образца, мл; 5 · 109 - эквивалент туляремийного микроба, соответствующий CO мутности (10 ME), м.к./мл. 2. Количество живых микробных клеток. Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 40% от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определений в образцах серии не должны превышать 20% от средней арифметической величины. При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида, охлажденные до температуры от 2 до 8 °С. Для определения количества живых микробных клеток из приготовленных ранее образцов взвесей вакцины делают последовательные десятикратные разведения от 10-1 (к 0,5 мл вакцины добавляют 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида) до 10-7, используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из последнего разведения по 0,1 мл взвеси отдельно для каждого образца высевают на 3 чашки Петри с отконтролированными рыбно-дрожжевым питательным агаром с добавлением цистеина и глюкозы или е питательной средой для выделения и культивирования туляремийного микроба (FT-агар). Учет результатов определения количества живых клеток в вакцине проводят через 5 сут. выдерживания посевов при температуре () °С. За количество живых микробных клеток принимают среднюю арифметическую определений количества выросших колоний в 3 образцах. Полученную величину умножают на степень разведения культуры (10-7) и увеличивают в 10 раз (для контроля используют 0,1 мл вакцины), получая количество живых туляремийных микробов, содержащихся в 1 мл вакцины. Содержание живых микробных клеток в процентах (% живых м.к.) рассчитывают по формуле: , где: БК - количество живых м.к. в 1 мл; ОК - общая концентрация, м.к. 3. Степень диссоциации. Число SR иммуногенных "белых" колоний должно составлять не менее 80% от общего количества выросших колоний. Количество колоний определяют на тех же чашках Петри с посевами, на которых определяют содержание живых микробных клеток. После инкубации чашек Петри в термостате при температуре () °С в течение 5 сут. их помещают на 24 ч в холодильник при температуре от 2 до 8 °С. После этого подсчитывают число иммуногенных "белых" и неиммуногенных "серых" колоний и вычисляют их процентное соотношение. 4. Количество накожных доз. В ампуле должно содержаться от 15 до 50 накожных доз. Количество прививочных доз в ампуле устанавливается путем деления количества живых м.к. на 2 · 108 м.к., составляющих одну прививочную дозу. 5. Прививаемость. При накожной иммунизации морских свинок дозой 2 · 107 живых м.к. в объеме 0,1 мл у всех животных через 2-5 сут. вокруг насечек должны образоваться инфильтрат и гиперемия диаметром от 5 до 15 мм. В ампулу вносят воду для инъекций из расчета 0,1 мл на 1 накожную дозу. Полученную микробную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида в 10 раз до концентрации 2 · 108 живых м.к. в 1 мл и прививают 3 морских свинок массой () г накожно методом скарификации в объеме 0,1 мл. На участок депилированной кожи, предварительно обработанной спиртом и эфиром (1:1), после испарения эфира наносят пипеткой 2 капли микробной взвеси на расстоянии 20-30 мм друг от друга. Через каждую каплю оспопрививательным пером делают по 2 параллельные некровоточащие насечки длиной 8-12 мм. Нанесенную на кожу взвесь тщательно втирают в течение 1 мин плоской стороной пера. Если препарат не выдерживает испытание, контроль повторяют по той же методике на удвоенном количестве животных. 6. Иммуногенность. Не менее 8 из 10 морских свинок, привитых накожно дозой 2 · 107 живых м.к. в объеме 0,1 мл, должны быть предохранены от гибели при подкожном заражении 1000 Dcl (Dosis certa letalis) вирулентного штамма туляремийных бактерий голарктической расы, 1 Dcl которого не должна превышать 5 м.к. Иммунизируют 10 морских свинок массой () г дозой 2 · 107 м.к. в объеме 0,1 мл накожно скарификационным методом, как при определении прививаемости. Через 25-30 сут. после иммунизации проводят заражение иммунизированных животных дозой 1000 Dcl, a 3 неиммунизированных (контрольных) животных заражают 1 Dcl вирулентного штамма F. tularensis. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 30 сут. Все контрольные животные должны погибнуть от туляремии в срок до 15 сут. У них должны наблюдаться типичные патологоанатомические изменения (плотный инфильтрат на месте введения, гиперемия сосудов подкожной клетчатки и паховых лимфатических узлов, увеличение и уплотнение селезенки и печени). Всех павших животных вскрывают, органы и ткани высевают методом отпечатков на чашки Петри с рыбно-дрожжевым агаром с добавлением цистеина и глюкозы или FT-агаром с добавлением 5% крови. В случае гибели более 2 свинок из 10 иммунизированных и всех зараженных животных испытание повторяют по той же методике в сравнении со стандартным образцом вакцины туляремийной живой. Если при повторном контроле погибли более 2 свинок из 10 иммунизированных и зараженных, а для стандартного образца эти показатели остались в пределах нормы - данную серию считают не выдержавшей испытание. Термостабильность. Не менее 7 сут. Показатель термостабильности (срок, в течение которого в препарате сохраняется 50% живых микробных клеток по отношению к первоначальному количеству) определяют в 3 образцах после хранения вакцины при температуре () °С в течение 14 сут. Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе "Специфическая активность". Показатель термостабильности (t) в сут. рассчитывают по формуле: , где: lgA0 - логарифм первоначального количества живых м.к./мл; lgAn - логарифм количества живых м.к./мл через 14 сут. хранения вакцины при температуре () °С; 0,3 - постоянная величина; 14 - срок хранения вакцины при температуре () °С, сут. Растворители, выпускаемые в комплекте с вакциной. Вода для инъекций в ампулах по 5 мл. Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты". Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С. --- ## Иллюстрации $19 \pm 1$ $475 \pm 25$ $2 \pm 1$ $OK = \frac{(0,5 + V) \cdot 5 \cdot 10^{9}}{0,5}$ $37 \pm 1$ $\%\text{живых м}.\text{к}. = \frac{\text{БК}}{\text{ОК}} \cdot 100\%$ $37 \pm 1$ $400 \pm 25$ $350 \pm 50$ $37 \pm 1$ $t = \frac{0,3 \cdot 14}{lgA_{0} - lgA_{n}}$ $37 \pm 1$ $37 \pm 1$