--- title: "Без названия" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-1157" --- ## Без названия # Документ 11834
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
30 сентября 2010 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ **И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **ПОРЯДОК** **ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ** **ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ ОЧАГОВ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ** **С ГРУППОВОЙ ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.2.2746-10**
Дата введения:
с момента подписания 1. Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол _____ от _______ 2010 года). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 сентября 2010 года. 4. Введены в действие с 30 сентября 2010 года. 5. Введены впервые. ### 1. Область применения 1.1. В настоящих методических указаниях определены порядок применения молекулярно-генетических методов исследования, а также сбора, упаковки, хранения и транспортирования биологического материала и образцов объектов окружающей среды (ООС) при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью различной этиологии, вызванных ПБА III - IV группы, не относящимися к условно-патогенной флоре (УПФ). 1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы лечебно-профилактическими и другими учреждениями, независимо от ведомственной принадлежности и организационно-правовой формы. ### 2. Список сокращений ВОЗ Всемирная организация здравоохранения ЖКТ желудочно-кишечный тракт ОКИ острые кишечные инфекции ООС объекты окружающей среды ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПБА патологические биологические агенты ПЦР полимеразная цепная реакция УПФ условно-патогенная флора AFLP оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации EIEC энтероинвазивные E. coli LCR лигазная цепная реакция MLST мультилокусное секвенирование-типирование NASBA метод изотермической амплификации РНК (Nucleic Acids Seaquencence Amplification) PFGE электрофорез в пульсирующем поле RAPD амплификации со случайными праймерами VNTR амплификация тандемных повторов с переменной копийностью. ### 3. Общие положения К молекулярно-генетическим методам исследования относятся методы выявления и характеристики инфекционных агентов на основе исследования их нуклеиновых кислот с применением или без применения амплификационных технологий путем определения наличия, размера и нуклеотидного состава различных элементов генома возбудителя либо сочетания этих подходов. Наибольшее распространение получили амплификационные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления ее продуктов применяются методы гель-электрофореза, гибридизации с флуоресцентно-мечеными зондами, гибридизационно-ферментное выявление продуктов ПЦР и способы детальной характеристики продукта с применением нуклеотидных биочипов и метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей продуктов реакции. Достаточно широкое распространение имеют также методы анализа генома возбудителя без применения амплификационных технологий. Наиболее распространенным из них является метод электрофореза в пульсирующем поле. Применение молекулярно-генетических методов исследования должно рассматриваться не как альтернатива, а как обязательное дополнение к регламентированным схемам диагностики острых кишечных инфекций, позволяющее эффективно выявлять комплекс вирусных возбудителей ОКИ и проводить оценку идентичности бактериальных и вирусных изолятов. ### 4. Организация исследований 4.1. Лабораторные исследования проводятся в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. 4.2. Молекулярно-генетические методы исследования в очагах ОКИ с групповой заболеваемостью применяются для решения следующих задач: - наиболее раннего установления этиологии заболеваний с целью своевременного начала адекватной терапии и проведения соответствующих санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий; - выявления ДНК/РНК возбудителей в предполагаемых факторах передачи и источниках инфицирования; - оценки идентичности изолятов возбудителей, выделенных из различных материалов с целью определения источников инфицирования и факторов передачи инфекции. 4.3. Применение молекулярно-генетических методов исследования является обязательным в случае исследования материала из очагов ОКИ с групповой заболеваемостью при: - регистрации в очаге групповой заболеваемости ОКИ летальных исходов от данных заболеваний, в том числе установленной этиологии; - отсутствии выделения от пациентов (> 30% обследованных) безусловных патогенов в сроки, регламентированные действующими нормативно-методическими документами; - выделении от больных только условно-патогенной флоры в единичных случаях, без достоверно выявленного фактора передачи возбудителя; - проведении детекции вирусных агентов в материалах из окружающей среды, продуктов питания или лиц - предполагаемых источников инфицирования; - проведении оценки идентичности изолятов микроорганизмов, выявленных из различных источников и нерезультативном применении при этом комплекса классических микробиологических и серологических методик. 4.4. При работе в эпидемических очагах ОКИ количество обследуемых больных, лиц, подвергшихся риску заражения, декретированного контингента, образцов ООС и выделенных изолятов возбудителей определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. 4.5. Для обеспечения контроля качества проводимых исследований целесообразно дополнительно направлять на исследование клинический материал от лиц без клинических проявлений заболевания, не имеющих эпидемиологической связи с обследуемым очагом в количестве ~ 20% от пострадавших со вспышки в виде единой зашифрованной панели. Клинический материал от лиц - предполагаемых источников инфицирования не подлежит зашифровке в целях правильной организации лабораторных исследований. 4.6. Первичное молекулярно-генетическое исследование (ПЦР-диагностика) клинического материала от больных проводится в лабораториях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем составе ПЦР-лаборатории. 4.7. Первичное молекулярно-генетическое исследование предполагаемых источников инфицирования, лиц, подвергшихся заражению, и ООС осуществляют на базе ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем составе ПЦР-лаборатории. 4.8. Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней (региональные центры) Роспотребнадзора проводят исследования по оценке идентичности возбудителей, выявленных у пострадавших, лиц - предполагаемых источников инфицирования и ООС (при наличии необходимого оборудования и квалификации персонала), а также оказывают помощь ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации при исследовании больших объемов материала. Оценка идентичности культур микроорганизмов проводится только в отношении тех штаммов, которые были расценены как идентичные при проведении микробиологической диагностики. При невозможности проведения работ по оценке идентичности изолятов в условиях региональных центров Роспотребнадзора, материал для данных исследований направляется в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3). 4.9. При получении отрицательных результатов первичного исследования клинического материала от больных и при получении дискордантных результатов исследований в региональных центрах, первичный клинический материал, образцы проб ООС и выделенные культуры возбудителей направляются для исследования в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций. 4.10. Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций оказывает информационно-методическую поддержку деятельности органов и учреждений Роспотребнадзора. 4.11. ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации ежемесячно представляют информацию об этиологической расшифровке очагов ОКИ с групповой заболеваемостью (от 5-ти случаев) в региональные центры по мониторингу за инфекционными и паразитарными болезнями (Приложение 2 без графы 12). 4.12. Региональные центры Роспотребнадзора ежеквартально (до 15-го числа следующего месяца) направляют информацию о результатах этиологической верификации очагов ОКИ с групповой заболеваемостью в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций в разрезе курируемых территорий. 4.13. Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций ежегодно (до 15-го марта следующего за отчетным года) направляет в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека отчет о регистрации и этиологической верификации очагов ОКИ с групповой заболеваемостью на территории Российской Федерации, а также рекомендации по совершенствованию применяемых при их расследовании методов лабораторной диагностики. ### 5. Правила сбора, хранения и транспортировки клинического материала и образцов объектов окружающей среды 5.1. Сбор, хранение и транспортировка клинического материала и образцов ООС осуществляется в соответствии с действующими нормативно-методическими документами и инструкциями к используемым тест-системам. #### 5.2 Лабораторным исследованиям подлежат следующие материалы: - клинический материал от пострадавших лиц, полученный в первые 72 часа от начала заболевания и не позднее 1 дня госпитализации (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, рвотные массы, по согласованию - мазки из ротоглотки и другие типы клинического материала); - аутопсийный материал (фекалии, фрагменты стенки различных отделов ЖКТ); - клинический материал от лиц - предполагаемых источников инфицирования (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, или ректальные мазки (Приложение 1), рвотные массы, по согласованию - образцы крови и другие типы клинического материала). Сбор ректальных мазков следует проводить только при невозможности получения фекалий в виде объемной пробы; - образцы объектов окружающей среды (ООС), как предполагаемых факторов передачи заболевания. Объем выборки ООС (продукты питания, концентраты образцов воды) определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор. При исследовании продуктов питания обязательным является исследование смывов с их упаковок, поэтому продукты питания для исследования необходимо предоставлять в целой упаковке; - культуры штаммов микроорганизмов, выделенных при проведении исследований клинического материала или ООС на транспортных средах. 5.3. Не допускается транспортировка клинического материала от больных и выделенных культур микроорганизмов в одном контейнере с образцами ООС и материалом от лиц - предполагаемых источников инфицирования. 5.4. В учреждении, осуществляющем первичное исследование материала, каждый образец клинического материала и ООС делится на две части, одна из которых подвергается исследованию, а другая хранится для обеспечения возможности ее исследования в региональном центре или референс-центре по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций. ### 6. Порядок проведения лабораторных исследований 6.1. Лабораторные исследования для установления этиологии заболеваний и выявления аналогичных возбудителей в ООС и лиц - предполагаемых источников инфицирования, организуемые на базе лабораторий ЛПУ, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации и Региональных центрах Роспотребнадзора, проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке. Для выявления патогенов методом ПЦР (ОТ-ПЦР) предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований (тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, с возможностью использования деконтаминационных процедур на основе принципа пост-ПЦР стерилизации). Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций использует в своей работе весь доступный комплекс молекулярно-генетических методик. #### 6.2 Минимальный спектр исследований клинического материала от пострадавших при вспышках ОКИ должен включать детекцию: - норовирусов 2 генотипа; - ротавирусов группы A; - микроорганизмов рода Shigella и энтероинвазивных E. coli (EIEC); - микроорганизмов рода Salmonella; - термофильной группы микроорганизмов рода Campylobacter. Для детекции ротавирусов группы A в клиническом материале могут альтернативно применяться диагностические тест-системы на основе ИФА или латекс-агглютинации при наличии данных о их валидации относительно тест-систем, рекомендованных для использования ВОЗ. Для детекции перечисленных групп бактериальных возбудителей обязательно параллельное применение бактериологической диагностики, проводимой в соответствии с действующими нормативно-методическими документами, с получением чистых культур возбудителей для возможного проведения впоследствии оценки их идентичности. 6.3. При неинформативности исследования на первичный спектр микроорганизмов или наличии дополнительных клинико-эпидемиологических данных в данный спектр исследований целесообразно включать возбудителей астровирусной инфекции, аденовирусной инфекции, тифо-паратифозных заболеваний, иерсиниозов, эшерихиозов. При наличии клинико-эпидемиологических данных, не позволяющих исключить у пациента холеру, лабораторное исследование материала проводится в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. 6.4. Лабораторное исследование материала от пострадавших на наличие возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии, вызванных ПБА III - IV группы, проводится в течение 24-х часов с момента его поступления в лабораторию. При поступлении в лабораторию большого количества образцов и невозможности их исследования в полном объеме, формируется репрезентативная выборка, исследование которой производится в вышеуказанные сроки, с последующим проведением полного объема исследований. 6.5. Лабораторные исследования по установлению идентичности изолятов микроорганизмов проводятся с применением молекулярно-генетических методик, обеспечивающих: - необходимую для исследований разрешающую способность (способность дифференцировки штаммов микроорганизмов, циркулирующих на данной территории); - межлабораторную воспроизводимость результатов исследований; - низкий риск получения невалидных результатов исследования в комплексе с применением диагностических тест-систем. 6.6. В отношении возбудителей вирусной этиологии используются методы, основанные на прямом секвенировании вариабельного участка (участков) их генома. Для исключения получения ложноположительных результатов методом прямого секвенирования исследуются смещенные или альтернативные по отношению к используемым для диагностики области генома возбудителя. Предпочтение должно отдаваться методикам, позволяющим провести исследование возможно более протяженного участка генома возбудителя. 6.7. В отношении возбудителей бактериальной этиологии, используются методы, минимизирующие возможность субъективной оценки их результатов. Предпочтение должно отдаваться широко используемым в мире методикам, позволяющим провести сопоставление получаемых результатов с международными данными (мультилокусное секвенирование-типирование - MLST и его варианты, амплификация тандемных повторов с переменной копийностью - VNTR и его варианты, электрофорез в пульсирующем поле - PFGE, оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации - AFLP). Желательно более широкое применение методик, основанных на прямом секвенировании участка (участков) генома возбудителя, как методик, обеспечивающих абсолютную воспроизводимость исследований. Не рекомендуется применение методик, обладающих низкой межлабораторной воспроизводимостью - например амплификации со случайными праймерами (RAPD) или низкой дифференцирующей способностью. 6.8. При необходимости проведения одновременного исследования клинического материала от пострадавших и материалов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, предполагаемые источники инфицирования) придерживаются следующей последовательности выполнения работ: 1. Обработка материала и выделение нуклеиновых кислот (без проведения детекции патогенов) из образцов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, лица - предполагаемые источники инфицирования). 2. Обработка и исследование материала от пострадавших лиц и установление доминирующего возбудителя или доминирующих возбудителей. 3. Тестирование проб ООС и материала от лиц - предполагаемых источников инфицирования на наличие доминирующего патогена или патогенов. При проведении лабораторной диагностики заболеваний данной группы следует учитывать возможную крайне высокую концентрацию их возбудителей в клиническом материале. Особенно характерным это является для ротавирусов и аденовирусов. 6.9. При проведении исследования продуктов питания на содержание ПБА наряду с самим продуктом исследуются смывы с его упаковки. 6.10. При тестировании материалов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя с применением тест-систем на основе амплификационных технологий количество отрицательных контролей, прошедших все этапы исследований, должно составлять не менее 20% от количества исследуемых образцов. 6.11. По результатам проведенных исследований оформляется заключение, в котором должна быть представлена следующая информация: - количество, характер поступивших на исследование образцов и их состояние после транспортировки (особое внимание должно уделяться состоянию целостности первичных контейнеров и упаковок продуктов питания); - перечень использованных тест-систем; - полученные результаты исследования. При проведении исследования части образцов оформляется предварительное заключение, в котором дополнительно приводятся сведения о доле исследованных образцов. 6.12. В заключении, оформляемом по результатам оценки идентичности изолятов, должна быть представлена следующая информация: - количество, состояние полученных культур микроорганизмов; - краткое описание используемой методики, с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, при использовании метода прямого секвенирования - размеров и расположения анализируемых участков генома; - при использовании методик, результаты которых имеют форму паттернов (VNTR, AFLP, PFGE) - графическое представление полученных результатов. 6.13. Организации, ответственные за проведение данных разделов работы, сохраняют образцы клинического материала и ООС, культуры микроорганизмов и результаты исследований в виде первичных материалов (файлы, полученные на детектирующих приборах) до оформления окончательного донесения об очаге инфекционного заболевания с групповой заболеваемостью, а при проведении комиссионной судебной экспертизы в рамках уголовного дела - до истечения срока обжалования решения суда. ### 7. Нормативные ссылки 1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" с дополнением СП 1.3.2518-09 от 02.06.2009 N 42. 2. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности". 3. МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности". 4. МУК 4.2.2029-05 "Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов". 5. МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры".
Приложение 1
**СБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ**
**МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ** Фекалии
Пробу фекалий (1,0 - 2,0 г) у грудных детей забирают из подгузника, у пациентов старшего возраста - из помещенного в горшок или подкладное судно одноразового полиэтиленового пакета или одноразовой пластиковой емкости (чашка Петри). Затем в количестве 1,0 г (примерно) переносят в специальный стерильный контейнер. Контейнер с материалом доставляется в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 сут. Условия хранения и транспортировки материала: - при температуре 2 - 8 °C - в течение 1 суток; - при температуре минус 20 °C - в течение 1 недели. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Приложение 2
**ФОРМА**
**ЕЖЕКВАРТАЛЬНОГО (ЕЖЕМЕСЯЧНОГО БЕЗ ГРАФЫ 12) ОТЧЕТА**
**РЕГИОНАЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ ПО МОНИТОРИНГУ ЗА ИНФЕКЦИОННЫМИ**
**И ПАРАЗИТАРНЫМИ БОЛЕЗНЯМИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМЫХ В РЕФЕРЕНС-ЦЕНТР**
**ПО МОНИТОРИНГУ ЗА КИШЕЧНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ (ЦНИИЭ**
**РОСПОТРЕБНАДЗОРА, Г. МОСКВА, УЛ. НОВОГИРЕЕВСКАЯ, 3)** (заполняется на очаги с групповой заболеваемостью
от 5-ти случаев)
| Субъект РФ | Наименование муниципального образования (город, район, населенный пункт) | Наименование учреждения | Число случаев заболеваний/ в том числе среди детей | Диагноз | Выделен возбудитель (определен молекулярногенетическими методами), не выделен/ не определен | От скольких больных выделен возбудитель | От скольких контактных выделен возбудитель/ работников декретированных групп | С каких объектов внешней среды выделен (определен) возбудитель (вода, продукты, готовые блюда, смывы) | Метод, которым определен возбудитель, используемые тестсистемы | Учреждение, лаборатория, где проводились исследования | Исследования, проведенные в региональном центре по конкретному очагу (наименование материала, число проб, метод, результат) | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ---