---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-1078"
---

## Без названия

# Документ 10287


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждаю<br>
Председатель<br>
Государственного комитета<br>
санитарно-эпидемиологического<br>
надзора Российской Федерации,<br>
Главный государственный<br>
санитарный врач<br>
Российской Федерации<br>
**Е.Н.БЕЛЯЕВ**

</div>

<div align="center">

29 марта 1995 года

</div>



#### <a id="p100003"></a>4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

**БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ**

<a id="p100004"></a>**ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ**

<a id="p100005"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**

<div align="center">

**МУК 4.2.026-95**

</div>


<div align="right">

<a id="p100002"></a>Дата введения:

</div>

<div align="center">

с момента утверждения

</div>



### <a id="p100006"></a>Предисловие


1. <a id="p100007"></a>Разработаны сотрудниками ПНИЛ новых антибиотиков и кафедры микробиологии Российской медицинской академии последипломного образования, Институтом питания РАМН (Шендерович В.А., Пастернак Н.А, Столяровой Л.Г., Соловьевой В.Е., Власовой И.В., Ведьминой Е.А, Шевелевой С.А.).
2. <a id="p100008"></a>Утверждены и введены в действие Председателем Госкомсанэпиднадзора России - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 29 марта 1995 года.
3. <a id="p100009"></a>Введены впервые в качестве дополнения к "Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства", утв. Минздравом СССР N 3049-84.


### 1. <a id="p100010"></a>Область применения


<a id="p100011"></a>Методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора и других организаций, осуществляющих контроль за качеством продуктов питания.


### 2. <a id="p100012"></a>Сущность метода


<a id="p100013"></a>Методические указания содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основанного на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде. (1)
<a id="p100014"></a>Дегидрогеназы-ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки.
<a id="p100015"></a>Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления повреждающего действия антибиотика на различные тест-культуры. В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тест-культур лишаются такой возможности и метиленовый синий не восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.
<a id="p100016"></a>Данные сравнительного изучения экспресс-метода с общепринятым (диффузии в агар) свидетельствуют о высокой степени корреляции (коэффициент Р = 0,84 - 0,93 и значим с вероятностью 99,9%).
<a id="p100017"></a>Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения ответа через 4 - 5 ч, относительной простоте и значительной экономии питательной среды.
<a id="p100018"></a>Методика может быть осуществлена как в качественном, так и в количественном варианте, при этом при подсчете концентрации выявленного загрязнения использован титрационный принцип, в определенной степени облегчающий постановку анализа в баклабораториях и позволяющий получить достоверные результаты без построения стандартной кривой или расчета по таблицам активности антибиотиков.
<a id="p100019"></a>Лабораторный контроль, позволяющий выявить непосредственные источники загрязнения, принимать меры, снижающие контаминацию продуктов и, соответственно, риск для потребителей, целесообразно, главным образом, осуществлять в первичном звене получения животноводческой продукции: на молочно-товарных фермах, птицефабриках, в убойных и мясоперерабатывающих цехах хозяйств и т.п., сельскохозяйственных предприятиях, получающих и перерабатывающих продовольственное сырье животного происхождения. Готовая животноводческая продукция также должна контролироваться путем периодического отбора на молочных заводах, мясокомбинатах, птицеперерабатывающих заводах и т.п.
<a id="p100020"></a>Допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллина 0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (мл) продукта. (2)
<a id="p100021"></a>Метод состоит из нескольких этапов:
1. <a id="p100022"></a>Подготовка проб к исследованию при качественном и количественном определении.
2. <a id="p100023"></a>Получение и хранение взвеси клеток тест-культур.
3. <a id="p100024"></a>Определение "рабочей дозы" тест-культур.
4. <a id="p100025"></a>Определение концентрации антибиотиков и расчет активности.
5. <a id="p100026"></a>Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе.
6. <a id="p100027"></a>Качественное определение антибиотиков.


### 3. <a id="p100028"></a>Этапы исследования



#### <a id="p100029"></a>3.1. Подготовка проб к исследованию при качественном и количественном определении



##### <a id="p100030"></a>3.1.1 Подготовка проб к исследованию при качественном определении.

<a id="p100031"></a>Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде)
<a id="p100032"></a>Сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения (отбор на фермах);
<a id="p100033"></a>до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °С. Пробу в объеме не менее 10 см переносят в пробирку.
<a id="p100034"></a>Сухие молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока)
<a id="p100035"></a>Непосредственно перед исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре не выше (45 +/- 1) °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 куб. см.
<a id="p100036"></a>Яйца, меланж
<a id="p100037"></a>Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при температуре (65 +/- 1) °С в течение 10 - 15 мин до коагуляции белка, затем полностью смешивают содержимое яйца, от которого отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 куб. см.
<a id="p100038"></a>Мясо и субпродукты
<a id="p100039"></a>Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь тканевому соку. Тканевый сок в объеме не менее 10 куб. см переносят в пробирку.
<a id="p100040"></a>Термическая обработка проб пищевых продуктов
<a id="p100041"></a>Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами (см. п. 3.1.1) помещают в водяную баню с температурой (60 +/- 1) °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания - 30 мин. - отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки.

##### <a id="p100042"></a>3.1.2 Подготовка проб к исследованию при количественном определении.

<a id="p100043"></a>Молоко, молочные продукты и яйца
<a id="p100044"></a>Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах пробы, подготовленные к исследованию (см. п. 3.1.1) в количестве 10 мл или 10 г (смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50 мл и добавляют равное количество (10 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: при определении тетрациклина - цитратно-соляно-кислый буфер N 2; стрептомицина или пенициллина - фосфатный буфер N 4 и N 1 соответственно. Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в 2 раза.
<a id="p100045"></a>Мясо и мясные продукты
<a id="p100046"></a>Навески по 10 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и т.д., вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10 мл соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 мин. в термостате при температуре (37 +/- 1) °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при температуре (65 +/- 1) °С 30 мин. и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 мин. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1 мл и прибавляют 1 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т.д. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов.


#### <a id="p100047"></a>3.2. Получение и хранение взвеси клеток тест-культур


<a id="p100048"></a>    Тест-культурами  служат  вегетативные  формы спорообразующих и
неспорообразующих   культур:   Вас.   subtilis,  вар.  6633;  Вас.
subtilis,  вар.  L ;  Вас.  mycoides  537; Micrococcus luteum АТСС
                  2
9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.
<a id="p100049"></a>    Для  определения  пенициллина  и стрептомицина предпочтительно
пользоваться спорообразующими тест-культурами:
<a id="p100050"></a>    Вас.  subtilis,  вар.  6633;  Вас.  mycoides 537 u Micrococcus
luteum ATCC 9341;
<a id="p100051"></a>    для тетрациклина - Вас. subtilis, вар. L .
                                            2
<a id="p100052"></a>Музейные штаммы вегетативных форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4%) питательного агара.
<a id="p100053"></a>Вначале тест-культуру рассевают на чашки с 2%-ным мясопептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 20 +/- 3 ч. После чего мелкие колонии отсеивают в пробирки с 2%-ным мясопептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 20 +/- 3 ч.
<a id="p100054"></a>Микробную взвесь готовят путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °С не более 7 дней.


#### <a id="p100055"></a>3.3. Определение "рабочей дозы" тест-культур


<a id="p100056"></a>Поскольку количество жизнеспособных клеток тест-культуры от смыва к смыву варьирует, предварительно необходимо определить "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 +/- 1) °С. Следует учитывать, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток в смыве.
<a id="p100057"></a>Для постановки реакции выбрано время обесцвечивания, равное 1 ч. Это время, будучи величиной постоянной, выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную нагрузку для каждой тест-культуры в отдельности. "Рабочую дозу" тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.

##### <a id="p100058"></a>3.3.1 Методика определения "рабочей дозы" тест-культуры.

<a id="p100059"></a>Полученную взвесь тест-культур титруют путем последовательных двукратных разведений в объеме 1 мл питательного бульона. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 3 ч. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и охлажденного до температуры (45 +/- 1) °С 1%-ного питательного агара с метиленовым синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1%-ный питательный агар из расчета: на 100 мл среды 0,4 мл 0,5%-ного водного раствора метиленового синего и 1 мл 40%-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 1 - 2 ч, после чего учитывают результат (табл. 1). Дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+) принимают за "рабочую дозу". Функциональная активность дегидрогеназ тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который хранится в холодильнике в течение 1 недели. Поэтому "рабочую дозу" первый раз определяют через сутки, а затем - через 3 дня.

<a id="p100060"></a>Таблица 1

<a id="p100061"></a>**ОПРЕДЕЛЕНИЕ "РАБОЧЕЙ ДОЗЫ" ТЕСТ-КУЛЬТУР**


<table>
<colgroup><col width="22%"><col width="9%"><col width="5%"><col width="5%"><col width="5%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td rowspan="3">Тест-культуры</td><td rowspan="3">Время, ч</td><td colspan="10">Учет интенсивности клеточного дыхания</td></tr>
<tr><td colspan="10">Разведения тест-культур</td></tr>
<tr><td>1:2</td><td>1:4</td><td>1:8</td><td>1:16</td><td>1:32</td><td>1:64</td><td>1:128</td><td>1:256</td><td>1:512</td><td>1:1024</td></tr>
<tr><td>B.subt., вар. 6633</td><td>1</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td></tr>
<tr><td>B.subt, вap. L 2</td><td>1</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td></tr>
<tr><td>B.mycoides 537</td><td>1</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr>
<tr><td>Micrococcus luteum ATCC 9341</td><td>1</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr>
</table>


<a id="p100068"></a>Обозначения: знак плюс (+) - полное обесцвечивание метиленового синего, знак минус (-) - отсутствие обесцвечивания.
<a id="p100069"></a>Максимальное разведение тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное через 1 ч инкубации в термостате при 37 °С, принимают за "рабочую дозу".
<a id="p100070"></a>    В среднем, "рабочая доза" тест-культур определяется у:
<a id="p100071"></a>Вас. subtilis, вар. 6633                        в разведении 1:256
<a id="p100072"></a>Вас. subtilis, вар. L                           в разведении 1:512
                     2
<a id="p100073"></a>Вас. mycoides 537                               в разведении 1:128
<a id="p100074"></a>Micrococcus luteum ATCC 9341                    в разведении 1:64.


#### <a id="p100075"></a>3.4. Количественное определение концентрации антибиотиков и расчет активности


<a id="p100076"></a>При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным содержанием антибиотика в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют в 1 мл соответствующего буфера, получая, таким образом, основной раствор стандарта 1000 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до получения 100 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл и т.д.), разводят соответствующими буферными растворами.
<a id="p100077"></a>Титрование стандарта антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5 мл мясопептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном ряду не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.
<a id="p100078"></a>После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 ч. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.
<a id="p100079"></a>Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в термостате.
<a id="p100080"></a>Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (синий).
<a id="p100081"></a>О степени активности антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 ч инкубации в термостате при температуре (37 +/- 1) °С по сравнению с контролем.
<a id="p100082"></a>3.4.1. Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина и тетрациклина.
<a id="p100083"></a>Приготовление стандарта бензилпенициллина
<a id="p100084"></a>Во флакон, содержащий 500000 ЕД натриевой соли бензилпенициллина товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М фосфатного буфера, рН 7,0. Концентрация исходного раствора пенициллина составляет 50000 ЕД/мл. Далее получают 5000 ЕД/мл, разводя этот раствор в 10 раз. К 1 мл этого раствора прибавляют 4 мл 0,066 М фосфатного буфера, рН 7,0. Получают основной раствор пенициллина - 1000 ЕД/мл. Затем разводят десятикратно 0,066 М фосфатным буфером, рН 7,0 до 100 и 10 ЕД/мл. После этого 0,5 мл последнего разведения, т.е. 5 ЕД/мл, добавляют в 1-ю пробирку с заранее разлитым по 0,5 мл мясопептонным бульоном. Получают разведение пенициллина в 1-й пробирке - 2,5 ЕД/мл. Далее делают двукратные разведения антибиотика в 0,5 мл мясопептонного бульона. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры. В результате микробная нагрузка во всех пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры, при этом концентрация пенициллина в 1-й пробирке уменьшается еще в 2 раза и соответствует 1,25 ЕД/мл. Таким образом, получают разведения пенициллина:
<a id="p100085"></a>в 1-й пробирке 1,25 ЕД;
<a id="p100086"></a>во 2-й пробирке 0,62 ЕД;
<a id="p100087"></a>в 3-й пробирке 0,31 ЕД;
<a id="p100088"></a>в 4-й пробирке 0,15 ЕД;
<a id="p100089"></a>в 5-й пробирке 0,07 ЕД;
<a id="p100090"></a>в 6-й пробирке 0,035 ЕД;
<a id="p100091"></a>в 7-й пробирке 0,017 ЕД;
<a id="p100092"></a>в 8-й пробирке 0,008 ЕД;
<a id="p100093"></a>в 9-й пробирке 0,004 ЕД.
<a id="p100094"></a>Последняя 10-я пробирка не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности тест-культуры (табл. 2).

<a id="p100095"></a>Таблица 2

<a id="p100096"></a>**КОНЦЕНТРАЦИЯ СТАНДАРТА БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА**


<table>
<colgroup><col width="18%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="8%"><col width="10%"><col width="13%"></colgroup>
<tr><td>Время обесцвечивания метиленового синего, ч</td><td colspan="9">Учет интенсивности клеточного дыхания Разведение антибиотика в ЕД/мл</td><td>Контроль тесткультуры</td></tr>
<tr><td></td><td>1,25</td><td>0,62</td><td>0,31</td><td>0,15</td><td>0,07</td><td>0,035</td><td>0,015</td><td>0,007</td><td>0,0035</td><td>К</td></tr>
<tr><td>1</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>+/-</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr>
<tr><td>2</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr>
</table>


<a id="p100101"></a>Обозначения: (+) - полное обесцвечивание метиленового синего, (+/-) - частичное обесцвечивание метиленового синего, (-) - отсутствие обесцвечивания.
<a id="p100102"></a>Приготовление стандарта стрептомицина
<a id="p100103"></a>Во флакон, содержащий 500000 ЕД стрептомицина сульфата товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл 0,066 М, фосфатного буфера, рН 6,0 - 6,2. Концентрация исходного раствора стрептомицина составляет 50000 ЕД/мл. Далее исходный раствор разводят в 10 раз 0,066 М, фосфатным буфером, рН 7,8 - 8,0. Получают раствор 5000 ЕД/мл.
<a id="p100104"></a>Последующие разведения готовят на 0,066 М фосфатном буфере, рН 7,8 - 8,0, аналогично вышеописанной схеме к бензилпенициллину.
<a id="p100105"></a>Приготовление стандарта тетрациклина
<a id="p100106"></a>Для приготовления исходных растворов антибиотиков могут быть использованы лекарственные препараты антибиотиков или стандарты препаратов с известной активностью. В первичном растворе каждого антибиотика учитывают его активность в 1 мг (при использовании стандарта препарата) или содержание активного вещества в лекарственной форме (например, 100000 ЕД во флаконе). Основную концентрацию 1000 ЕД/мл или 1000 мкг/мл готовят, разводя препарат во флаконе, содержащем 100000 ЕД тетрациклина, в 100 раз.
<a id="p100107"></a>При активности стандарта тетрациклина 850 мкг/мл в 10 мг навески содержится 8500 мкг антибиотика.
<a id="p100108"></a>Для получения первого разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливают необходимый объем растворителя: 850 х 10 = 8500:1000 = 8,5 мл. Таким образом, навеску тетрациклина 10 мг растворяют в 8,5 мл 0,01 Н HCl и получают концентрацию основного раствора 1000 мкг/мл. Приготовленный основной раствор может храниться в холодильнике в течение 7 дней.
<a id="p100109"></a>Далее основной раствор 1000 мкг/мл разводят десятикратно цитратно-соляно-кислым буфером, рН 6,0 - 6,2, до 100 и 10 мкг/мл. Все последующие разведения готовят также на цитратно-соляно-кислом буфере, рН 6,0 - 6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина аналогично схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.


#### <a id="p100110"></a>3.5. Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе


<a id="p100111"></a>Параллельно ставят второй ряд с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках с заранее разлитым мясопептонным бульоном в объеме 0,5 мл. Во все пробирки этого ряда также вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры (т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего через 1 ч инкубации в термостате). В результате микробная нагрузка уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.
<a id="p100112"></a>Таким образом, 1-я пробирка каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1:4.
<a id="p100113"></a>Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.
<a id="p100114"></a>Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С.
<a id="p100115"></a>Учет результатов производят по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культуры через 1 или 2 ч инкубации в термостате (табл. 3).

<a id="p100116"></a>Пример

<a id="p100117"></a>Таблица 3

<div align="center">

<a id="p100118"></a>**КОНЦЕНТРАЦИЯ БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА В ИСПЫТУЕМОМ СУБСТРАТЕ**

</div>



<table>
<colgroup><col width="19%"><col width="6%"><col width="6%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="10%"><col width="13%"></colgroup>
<tr><td>Время обесцвечивания</td><td colspan="9">Учет интенсивности клеточного дыхания</td><td rowspan="2">Контроль тесткультуры</td></tr>
<tr><td>метиленового синего, ч</td><td colspan="9">Разведения испытуемого субстрата или образца</td></tr>
<tr><td></td><td>1:4</td><td>1:8</td><td>1:16</td><td>1:32</td><td>1:64</td><td>1:128</td><td>1:256</td><td>1:512</td><td>1:1024</td><td>К</td></tr>
<tr><td>1</td><td>-</td><td>+/-</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr>
<tr><td>2</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr>
</table>


<a id="p100123"></a>Концентрацию антибиотика в исследуемом субстрате с неизвестным его количеством вычисляют путем умножения последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность тест-культуры (табл. 3), на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект (табл. 2).
<a id="p100124"></a>Как видно из табл. 2, последнее разведение стандарта бензилпенициллина вызывает полное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры, по сравнению с контролем, только через 2 ч инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/мл. Через 1 ч инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной активности клеток.
<a id="p100125"></a>Таким образом, концентрация пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует 0,07 ЕД/мл через 2 ч инкубации в термостате при температуре (37 +/- 1) °С.
<a id="p100126"></a>Учесть результат в данном опыте возможно только через 2 ч инкубации по полному подавлению дегидрогеназной активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1:8, так как через 1 ч инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем (табл. 3).
<a id="p100127"></a>Содержание пенициллина в исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата, подавляющее дегидрогеназную активность клеток тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект, т.е. 0,07 х 8 = 0,56 ЕД/мл. Таким образом, в испытуемом субстрате содержится 0,56 ЕД/мл пенициллина.


#### <a id="p100128"></a>3.6. Качественное определение антибиотиков


<a id="p100129"></a>Качественное определение антибиотиков в пищевых продуктах можно проводить по вышеописанной методике (3.5).

##### <a id="p100130"></a>3.6.1 Проведение анализа.

<a id="p100131"></a>Подготовленные к исследованию испытуемые пробы (см. 3.1.1) в объеме 0,5 мл вносят в пробирки с таким же (0,5 мл) количеством мясопептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры.
<a id="p100132"></a>Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.
<a id="p100133"></a>Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.
<a id="p100134"></a>После этого в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и охлажденного до (45 +/- 1) °С мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 1 - 2 ч.

##### <a id="p100135"></a>3.6.2 Учет результатов.

1. <a id="p100136"></a>При отсутствии в испытуемых образцах антибиотика дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.
2. <a id="p100137"></a>В контрольной пробирке, где нет испытуемого образца, также происходит обесцвечивание в течение 1 - 2 ч наблюдения в термостате при температуре (37 +/- 1) °С (контроль ферментативной активности бактериальных клеток тест-культуры).
3. <a id="p100138"></a>При наличии антибиотика в испытуемом образце дыхательные ферменты бактериальных клеток блокируются, метиленовый синий не восстанавливается и пробирки не изменяются, цвет их остается синим.
4. <a id="p100139"></a>Параллельно в качестве второго контроля можно использовать субстраты, содержащие определенную концентрацию антибиотика.


#### <a id="p100140"></a>3.7. Растворы, применяемые для разведения стандартов антибиотиков и испытуемых образцов, реактивы



##### <a id="p100141"></a>3.7.1 Бензилпенициллин.

<a id="p100142"></a>Основной раствор стандарта, рабочие разведения стандарта и испытуемый раствор готовят на буфере N 1 - 0,066 М фосфатный (рН 6,8 - 7,0).
<a id="p100143"></a>Рецепт:
<a id="p100144"></a>Калия фосфат однозамещенный - 3,63 г;
<a id="p100145"></a>Натрия фосфат двузамещенный - 7,13 г;
<a id="p100146"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл.

##### <a id="p100147"></a>3.7.2 Стрептомицин сульфат.

<a id="p100148"></a>Основной раствор стандарта готовят на буфере N 3 0,066 М фосфатный (рН 6,0 - 6,2).
<a id="p100149"></a>Рецепт:
<a id="p100150"></a>Калия фосфат однозамещенный - 7,72 г;
<a id="p100151"></a>Натрия фосфат двузамещенный - 1,78 г;
<a id="p100152"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл.
<a id="p100153"></a>Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере N 4 - 0,066 М фосфатный (рН 7,8 - 8,0).
<a id="p100154"></a>Рецепт:
<a id="p100155"></a>Калия фосфат однозамещенный - 0,68 г;
<a id="p100156"></a>Натрия фосфат двузамещенный - 10,99 г;
<a id="p100157"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл.

##### <a id="p100158"></a>3.7.3 Тетрациклины.

<a id="p100159"></a>Основной раствор стандарта растворяют в 0,01 Н соляной кислоте (HCl).
<a id="p100160"></a>Рабочие разведения стандарта и экстракцию испытуемых образцов готовят на буфере N 2 - цитратно-соляно-кислый (рН 5,8 - 6,0).
<a id="p100161"></a>Рецепт:
<a id="p100162"></a>Натрия цитрат трехзамещенный - 20,6 г;
<a id="p100163"></a>Соляная кислота концентрированная - 1,81 мл;
<a id="p100164"></a>Вода дистиллированная - до 1000 мл.

##### <a id="p100165"></a>3.7.4 Мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

<a id="p100166"></a>Производят согласно ГОСТу 9225-84; ГОСТу 18963-73.
<a id="p100167"></a>3.7.5. 0,5%-ный водный раствор метиленового синего.

<div align="center">

<a id="p100168"></a>3.7.6. 40%-ный коммерческий раствор глюкозы.

</div>



## <a id="p100169"></a>Список литературы


1. <a id="p100170"></a>Пастернак Н.А., Шендерович В.А., Ведьмина Е.А. Экспресс-метод определения концентрации антибиотиков в биологических жидкостях. Лабораторное дело, 1989, N 9.
2. <a id="p100171"></a>Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства. М., 1984.
3. <a id="p100172"></a>Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная химиотерапия. М.: "Медицина", 1982.



<a id="p100173"></a>

---