---
title: "Без названия"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/bez-nazvaniya-106"
---

## Без названия

# Документ 889


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Введен в действие<br>
Постановлением<br>
Государственного комитета РФ<br>
по стандартизации и метрологии

</div>

<div align="center">

от 27 июля 2001 г. N 296-ст

</div>


<a id="p100002"></a>**МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ**

<a id="p100003"></a>**ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ**
**АФЛАТОКСИНОВ  И**

<a id="p100005"></a>Food-stuffs.
Methods for detection and determination
of aflatoxins  and  content

<div align="center">

<a id="p100006"></a>**ГОСТ 30711-2001**

</div>


<div align="right">

<a id="p100007"></a>Группа Н59

<a id="p100008"></a>**МКС 67.040**

<a id="p100009"></a>**ОКСТУ 9109**

<a id="p100010"></a>Дата введения

</div>

<div align="center">

1 июля 2002 года

</div>



### <a id="p100011"></a>Предисловие


1. <a id="p100012"></a>Разработан МТК 93, Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП) и Институтом питания Академии медицинских наук Российской Федерации (ИП АМН РФ) и ТК 08 Кыргызской Республики, Кыргызским научно-исследовательским институтом профилактики и медицинской экологии.
<a id="p100013"></a>Внесен Госстандартом России.
2. <a id="p100014"></a>Принят Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 19 от 24 мая 2001 г.)
<a id="p100015"></a>За принятие проголосовали:


| Наименование государства | Наименование национального органа по стандартизации |
| --- | --- |
| Азербайджанская Республика | Азгосстандарт |
| Республика Армения | Армгосстандарт |
| Республика Беларусь | Госстандарт Республики Беларусь |
| Грузия | Грузстандарт |
| Республика Казахстан | Госстандарт Республики Казахстан |
| Кьргызская Республика | Кыргызстандарт |
| Республика Молдова | Молдовастандарт |
| Российская Федерация | Госстандарт России |
| Республика Таджикистан | Таджикстандарт |
| Туркменистан | Главгосслужба "Туркменстандартлары" |
| Республика Узбекистан | Узгосстандарт |
| Украина | Госстандарт Украины |


3. <a id="p100029"></a>Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации и метрологии от 27 июля 2001 г. N 296-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 30711-2001 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта РФ с 1 июля 2002 г.
4. <a id="p100030"></a>Введен впервые.


### 1. <a id="p100031"></a>Область применения


<a id="p100032"></a>Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает методы выявления и определения содержания афлатоксинов  и .


### 2. <a id="p100033"></a>Нормативные ссылки


<a id="p100034"></a>ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия
<a id="p100035"></a>ГОСТ 1277-75 Серебро азотнокислое. Технические условия
<a id="p100036"></a>ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
<a id="p100037"></a>ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия
<a id="p100038"></a>ГОСТ 3652-69 Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия
<a id="p100039"></a>ГОСТ 4159-79 Йод. Технические условия
<a id="p100040"></a>ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия
<a id="p100041"></a>ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия
<a id="p100042"></a>ГОСТ 4461-77 Кислота азотная. Технические условия
<a id="p100043"></a>ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
<a id="p100044"></a>ГОСТ 5789-78 Толуол. Технические условия
<a id="p100045"></a>ГОСТ 5848-73 Кислота муравьиная. Технические условия
<a id="p100046"></a>ГОСТ 5955-75 Бензол. Технические условия
<a id="p100047"></a>ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
<a id="p100048"></a>ГОСТ 6995-77 Метанол-яд. Технические условия
<a id="p100049"></a>ГОСТ 9411-91 Стекло оптическое цветное. Технические условия
<a id="p100050"></a>ГОСТ 10455-80 1,4-Диоксан. Технические условия
<a id="p100051"></a>ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
<a id="p100052"></a>ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
<a id="p100053"></a>ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
<a id="p100054"></a>ГОСТ 22300-76 Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
<a id="p100055"></a>ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
<a id="p100056"></a>ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
<a id="p100057"></a>ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
<a id="p100058"></a>ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования


### 3. <a id="p100059"></a>Метод тонкослойной хроматографии


<a id="p100060"></a>Метод основан на экстракции афлатоксинов  и  из пробы продукта, очистке экстракта от мешающих веществ и измерении массовой концентрации афлатоксинов  и  с помощью тонкослойной хроматографии при визуальном определении количества вещества в пятне.
<a id="p100061"></a>Диапазон измеряемых содержаний афлатоксина  во всех продуктах, кроме молочных: 0,003 - 0,02 мг/кг; в молочных продуктах: 0,0005 - 0,003 мг/кг; афлатоксина  - 0,0005 - 0,005 мг/кг.

#### <a id="p100062"></a>3.1 Отбор и подготовка проб

<a id="p100063"></a>Отбор проб и подготовка их к испытанию - по методам, указанным в нормативном документе на конкретную продукцию. При испытании зерновых, зернобобовых продуктов, орехов и концентратов с высоким содержанием жира, какао-бобов и шоколада среднюю пробу перед измельчением замораживают при температуре не выше минус 10 °C.
<a id="p100064"></a>Средние пробы орехов, зерна, зернобобовых, кондитерских изделий, какао-бобов, зерен кофе и листового чая измельчают до порошкообразного состояния, шоколад измельчают до получения однородной массы.

#### <a id="p100065"></a>3.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

<a id="p100066"></a>Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 20 г не ниже 2-го класса точности.
<a id="p100067"></a>Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 500 г не ниже 4-го класса точности.
<a id="p100068"></a>Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длине волны 360 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.
<a id="p100069"></a>Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима от 40 до 150 °C с температурной погрешностью +/- 5 °C.
<a id="p100070"></a>Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения 4000 об/мин, стаканы центрифужные стеклянные вместимостью 200 см3.
<a id="p100071"></a>Испаритель ротационный ИР 2М или аналогичный.
<a id="p100072"></a>Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе мод. 833 или диагностическая лампа ОЛД 41, снабженные светофильтром УФС 1, УФС 2 или УФС 5 по ГОСТ 9411.
<a id="p100073"></a>Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С [1].
<a id="p100074"></a>Баня водяная [2].
<a id="p100075"></a>Электроплитка по ГОСТ 14919.
<a id="p100076"></a>Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 с допускаемой погрешностью +/- 2 °C в диапазоне измерений 0 - 100 °C.
<a id="p100077"></a>Микрошприц МШ-10 вместимостью 0,01 см3 [3].
<a id="p100078"></a>Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой.
<a id="p100079"></a>Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.
<a id="p100080"></a>Колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 вместимостью 10, 100 и 250 см3.
<a id="p100081"></a>Цилиндр по ГОСТ 1770 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 100 см3.
<a id="p100082"></a>Пипетки по ГОСТ 29227 типа 3 исполнения 1 1-го класса точности вместимостью 1 и 10 см3.
<a id="p100083"></a>Воронка делительная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом вместимостью 250 см3.
<a id="p100084"></a>Воронка лабораторная по ГОСТ 25336 типа В диаметром 56 мм и высотой 80 мм.
<a id="p100085"></a>Колба плоскодонная по ГОСТ 25336 исполнения 2 вместимостью 250 см3.
<a id="p100086"></a>Колба грушевидная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 100 см3.
<a id="p100087"></a>Колба остродонная по ГОСТ 25336 с взаимозаменяемым конусом 14/23 вместимостью 25 см3.
<a id="p100088"></a>Распылитель стеклянный с грушей.
<a id="p100089"></a>Колонка стеклянная хроматографическая длиной 300 и внутренним диаметром 20 мм.
<a id="p100090"></a>Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по ГОСТ 12026.
<a id="p100091"></a>Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
<a id="p100092"></a>Силикагель Л, 100 - 160 или 100 - 250 мкм, фирма "Лахема", Чехия.
<a id="p100093"></a>Флоризил, 60 - 100 меш, фирма "Мерк", Германия.
<a id="p100094"></a>Пластинки для тонкослойной хроматографии "Силуфол" 15 х 15 см, фирма "Кавалиер", Чехия.
<a id="p100095"></a>Пластинка стеклянная 20 x 20 см.
<a id="p100096"></a>Афлатоксин  кристаллический, фирма "Серва", Германия.
<a id="p100097"></a>Афлатоксин  кристаллический, фирма "Серва", Германия.
<a id="p100098"></a>Афлатоксин  кристаллический, фирма "Серва", Германия.
<a id="p100099"></a>Ацетон по ГОСТ 2603, ч.д.а.
<a id="p100100"></a>Бензол по ГОСТ 5955, ч.д.а.
<a id="p100101"></a>Ацетонитрил [4], ч.
<a id="p100102"></a>Гексан [5], ч.
<a id="p100103"></a>Метанол-яд по ГОСТ 6905, ч.
<a id="p100104"></a>Хлороформ технический по ГОСТ 20015.
<a id="p100105"></a>Эфир этиловый технический [6].
<a id="p100106"></a>1,4-Диоксан по ГОСТ 10455, ч.д.а.
<a id="p100107"></a>Йод по ГОСТ 4159, х.ч., раствор в этиловом эфире массовой концентрации 100 г/дм3.
<a id="p100108"></a>Спирт изопропиловый [7], ч.д.а.
<a id="p100109"></a>Кислота азотная по ГОСТ 4461, ч.д.а., водный раствор 1:2.
<a id="p100110"></a>Кислота лимонная 1-водная по ГОСТ 3652, ч.д.а.
<a id="p100111"></a>Кислота уксусная по ГОСТ 61, ч.д.а.
<a id="p100112"></a>Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277, х.ч., раствор массовой концентрации 250 г/дм3.
<a id="p100113"></a>Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
<a id="p100114"></a>Натрий хлористый по ГОСТ 4233, ч.д.а., растворы массовыми концентрациями 40 г/дм3 и 100 г/дм3.
<a id="p100115"></a>Свинец (II) уксуснокислый основной [8], ч., раствор массовой концентрации 150 г/дм3.
<a id="p100116"></a>Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
<a id="p100117"></a>Допускается использование других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, не уступающих перечисленным выше по метрологическим и техническим характеристикам.

#### <a id="p100118"></a>3.3 Условия измерений

<a id="p100119"></a>Температура и относительная влажность в лабораторном помещении при выполнении измерений не должны превышать значений, оговоренных в нормативных документах на средства измерений, указанные в 3.2.

#### <a id="p100120"></a>3.4 Подготовка к выполнению измерений


##### <a id="p100121"></a>3.4.1 Подготовка растворителей

<a id="p100122"></a>Все растворители квалификации "ч." или "технический" перед использованием перегоняют, строго отбирая фракцию, соответствующую по температуре кипения основному веществу. Этиловый эфир перед перегонкой освобождают от перекисей общепринятыми методами.

##### <a id="p100123"></a>3.4.2 Приготовление основных растворов афлатоксинов  и

<a id="p100124"></a>1 мг кристаллического афлатоксина  количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3. В другую мерную колбу такой же вместимости количественно переносят 1 мг афлатоксина . В колбы вносят по 2 см3 ацетонитрила. Содержимое колб тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов афлатоксинов, после чего объем в колбах доводят до метки бензолом и содержимое колб вновь тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксинов в полученных основных растворах составляет около 10 мкг/см3. Основные растворы хранят в закрытых мерных колбах, плотно завернутых в алюминиевую фольгу, в холодильнике. Срок годности основных растворов афлатоксинов - 1 г.
<a id="p100125"></a>Точную концентрацию афлатоксинов  и  в основных растворах определяют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность слоя раствора толщиной 1 см по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны 362 нм. В качестве контрольного раствора используют смесь бензол-ацетонитрил (98:2).
<a id="p100126"></a>Массовую концентрацию афлатоксинов  и  в основных растворах c, мкг/см3, вычисляют по формуле

<div align="center">

<a id="p100127"></a>,(1)

</div>


<a id="p100128"></a>где D - оптическая плотность раствора;
<a id="p100129"></a>M - молекулярная масса афлатоксина:
<a id="p100130"></a>для афлатоксина  M = 312,3 г/моль;
<a id="p100131"></a>для афлатоксина  M = 314,3 г/моль;
 - <a id="p100132"></a>молярный показатель поглощения раствора афлатоксина в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) при длине волны 362 нм:
<a id="p100133"></a>для афлатоксина  ;
<a id="p100134"></a>для афлатоксина  ;
<a id="p100135"></a>l - толщина слоя раствора, см.

##### <a id="p100136"></a>3.4.3 Приготовление рабочего раствора смеси афлатоксинов  и

<a id="p100137"></a>В мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой вносят 10,0 см3 основного раствора афлатоксина  и 5,0 см3 основного раствора афлатоксина . Объем в колбе доводят до метки смесью бензола с ацетонитрилом (98:2 по объему). Содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксинов  и  в полученном рабочем растворе составляет около 1 мкг/см3 и 0,5 мкг/см3 соответственно. Точная концентрация афлатоксина  в рабочем растворе соответствует его точной концентрации в основном растворе, деленной на фактор разведения 10. Рабочий раствор афлатоксинов  и  хранят в тех же условиях, что и основные растворы. Срок годности рабочего раствора афлатоксинов  и  - 1 г.

##### <a id="p100138"></a>3.4.4 Приготовление рабочего раствора афлатоксина

<a id="p100139"></a>Ампулу, полученную от фирмы-производителя и содержащую 0,01 мг афлатоксина , вскрывают. В ампулу вносят 1,0 см3 ацетонитрила. Содержимое ампулы аккуратно перемешивают и переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3. Остаток афлатоксина  извлекают из ампулы двумя порциями бензола объемом по 1,0 см3, каждый раз тщательно перемешивая содержимое ампулы и перенося его в ту же колбу. Объем содержимого в колбе доводят до метки бензолом. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксина  в полученном рабочем растворе составляет 1,0 мкг/см3. Рабочий раствор афлатоксина  хранят в тех же условиях, что и растворы афлатоксинов  и . Срок годности рабочего раствора афлатоксина  - 1 г.

##### <a id="p100140"></a>3.4.5 Приготовление смешанного раствора хлористого натрия и лимонной кислоты

<a id="p100141"></a>В мерную колбу вместимостью 500 см3 вносят 100 г хлористого натрия и 12 г лимонной кислоты. Содержимое колбы растворяют в небольшом количестве воды, после чего объем в колбе доводят водой до метки.

##### <a id="p100142"></a>3.4.6 Подготовка флоризила

<a id="p100143"></a>100 г флоризила помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 200 см3 смеси гексан-уксусная кислота (99:1). Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, после чего жидкость декантируют. Операцию повторяют еще 2 раза, каждый раз используя порции по 200 см3 гексана. Флоризил высушивают на часовом стекле сначала в вытяжном шкафу при комнатной температуре до исчезновения запаха гексана, затем в сушильном шкафу при температуре 110 °C в течение 12 ч. После охлаждения флоризил переносят в плоскодонную колбу, куда вносят 10 см3 дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 60 мин, после чего флоризил переносят в герметично закрывающийся сосуд и выдерживают в закрытом состоянии в течение суток. Приготовленную порцию флоризила используют в течение недели.

#### <a id="p100144"></a>3.5 Выполнение измерений


##### <a id="p100145"></a>3.5.1 Экстракция


###### <a id="p100146"></a>3.5.1.1 Экстракция афлатоксина  из зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов и концентратов

<a id="p100147"></a>Навеску пробы массой 25,0 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 25 см3 раствора хлорида натрия концентрацией 100 г/дм3. Содержимое колбы тщательно перемешивают, добиваясь равномерного смачивания пробы. В колбу с помощью микрошприца вносят 0,0125 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, и 100 см3 ацетона. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 50 см3 фильтрата.

###### <a id="p100148"></a>3.5.1.2 Экстракция афлатоксина  из плодовых и овощных консервов

<a id="p100149"></a>Навеску пробы массой 25,0 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 25 см3 раствора хлорида натрия концентрацией 100 г/дм3. Содержимое колбы тщательно перемешивают. В колбу с помощью микрошприца вносят 0,0125 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, и 100 см3 ацетона. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3. Содержимое колбы доводят до метки смесью ацетон-вода (4:1), тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 100 см3 фильтрата. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C приблизительно до половины объема.

###### <a id="p100150"></a>3.5.1.3 Экстракция афлатоксина  из какао-бобов, какао-порошка и шоколада

<a id="p100151"></a>Навеску пробы массой 25,0 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 50 см3 гексана. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 15 мин, выдерживают до полного осаждения нерастворимых в гексане веществ, после чего осторожно декантируют гексановый слой. Процедуру повторяют еще два раза аналогичным способом, каждый раз используя свежие порции гексана. Остатки гексана удаляют высушиванием в сушильном шкафу при 50 °C до исчезновения запаха растворителя.
<a id="p100152"></a>К сухому остатку добавляют 0,010 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, 25 см3 раствора азотнокислого серебра и 125 см3 хлороформа. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего переносят в делительную воронку. После разделения фаз нижний хлороформный слой фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 75 см3 фильтрата. Фильтрат переносят в плоскодонную колбу, куда добавляют 10 см3 раствора азотнокислого серебра. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, после чего переносят в делительную воронку. После разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Процедуру повторяют, используя свежую порцию раствора азотнокислого серебра. Хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон. Отбирают 50 см3 фильтрата и упаривают его на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C приблизительно до половины объема.

###### <a id="p100153"></a>3.5.1.4 Экстракция афлатоксина  из кофе и чая

<a id="p100154"></a>Навеску пробы массой 25,0 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 15 см3 воды и перемешивают содержимое до равномерного смачивания пробы. Туда же вносят 0,010 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, и 125 см3 хлороформа. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, после чего переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. После этого верхний водный слой отбрасывают и отбирают 50 см3 хлороформного экстракта.

###### <a id="p100155"></a>3.5.1.5 Экстракция афлатоксина  из растительных масел и афлатоксинов  и  из животных масел

<a id="p100156"></a>Навеску пробы массой 15,0 г помещают в плоскодонную колбу, куда добавляют 0,0125 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, 25 см3 гексана, 5 см3 раствора хлорида натрия массовой концентрации 40 г/дм3 и 100 см3 ацетонитрила. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин, затем переносят в делительную воронку. После разделения слоев гексановый слой отбрасывают.

###### <a id="p100157"></a>3.5.1.6 Экстракция афлатоксинов  и  из молочных продуктов

<a id="p100158"></a>Навеску натурального молока, кефира, сливок, ряженки, йогурта, простокваши массой 50,0 г, сухого молока массой 5,0 г, концентрированного молока, сыра и сметаны массой 25,0 г помещают в коническую колбу. К навеске концентрированного молока, сыра и сметаны добавляют 25 см3 воды, к навеске сухого молока - 50 см3 воды. Содержимое колбы доводят до температуры 35 - 38 °C на водяной бане, при этом добиваются растворения сухого молока и диспергирования сыра и кисломолочных продуктов. В колбу вносят 0,0125 см3 основного раствора афлатоксина , используемого в качестве внутреннего стандарта, 10 см3 предварительно подогретого до температуры 35 - 38 °C смешанного раствора хлорида натрия и лимонной кислоты массовыми концентрациями соответственно 200 и 24 г/дм3 и 100 см3 хлороформа, предварительно подогретого до той же температуры. Содержимое колбы встряхивают 5 мин, после чего переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин, после чего верхний водный слой отбрасывают, хлороформный слой переносят в плоскодонную колбу и обезвоживают добавлением 10 г сернокислого натрия. Хлороформный экстракт фильтруют через ватный тампон в цилиндр вместимостью 100 см3, измеряют объем фильтрата. Фильтрат переносят в грушевидную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C. Остаток в колбе растворяют в 1 см3 хлороформа.

##### <a id="p100159"></a>3.5.2 Очистка экстракта

<a id="p100160"></a>3.5.2.1. Очистка экстракта из зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов, плодоовощных консервов и концентратов
<a id="p100161"></a>Водно-ацетоновый экстракт переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3. В колбу вносят 20 см3 раствора уксуснокислого свинца. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают, после чего фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 80 см3 фильтрата. Фильтрат переносят в делительную воронку, куда добавляют 30 см3 гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Процедуру повторяют, используя свежую порцию гексана и отбрасывая гексановый слой после разделения фаз.
<a id="p100162"></a>К оставшемуся в делительной воронке водно-ацетоновому слою добавляют 40 см3 хлороформа. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз нижний хлороформный слой переносят в плоскодонную колбу. Экстрагирование остатков афлатоксинов из водно-ацетоновой фазы проводят еще 2 раза, каждый раз используя по 30 см3 смеси хлороформ-ацетон (3:1). Объединенные хлороформные экстракты обезвоживают в плоскодонной колбе, добавляя 10 г безводного сульфата натрия и выдерживая содержимое в течение 30 мин в темноте. После обезвоживания экстракт по частям фильтруют через ватный тампон в остродонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C. Оставшийся сернокислый натрий промывают 15 см3 хлороформа, смыв добавляют к фильтрату. Содержимое отгонной колбы упаривают досуха. Остаток перерастворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (98:2) и используют для хроматографического анализа.

###### <a id="p100163"></a>3.5.2.2 Очистка экстракта из какао-бобов, какао-порошка и шоколада

<a id="p100164"></a>Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии, для чего на дно стеклянной колонки помещают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и 10 г силикагеля, суспендированного в 30 см3 хлороформа. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя силикагеля, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Хлороформу дают стечь до поверхности слоя сернокислого натрия, после чего через колонку последовательно пропускают 150 см3 гексана и 150 см3 этилового эфира. Элюат отбрасывают. В колонку вносят 150 см3 смеси хлороформ-метанол (97:3) и с этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

###### <a id="p100165"></a>3.5.2.3 Очистка экстракта из кофе и чая

<a id="p100166"></a>Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки помещают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и 5 г флоризила, суспендированного в 20 см3 хлороформа. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя флоризила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Хлороформу дают стечь до поверхности слоя сернокислого натрия, после чего через колонку пропускают 150 см3 диоксана. Элюат отбрасывают. В колонку вносят 100 см3 смеси ацетон-метанол (9:1). С этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

###### <a id="p100167"></a>3.5.2.4 Очистка экстракта из растительных масел

<a id="p100168"></a>Ацетонитрильный экстракт обезжиривают гексаном, предварительно насыщенным ацетонитрилом. Для этого 160 см3 гексана встряхивают в делительной воронке с 10 см3 ацетонитрила. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отбрасывают.
<a id="p100169"></a>Ацетонитрильный экстракт из пробы масла переносят в делительную воронку, куда добавляют 50 см3 гексана, насыщенного ацетонитрилом. Содержимое воронки встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Обезжиривание экстракта повторяют еще два раза в аналогичных условиях, каждый раз используя свежую порцию гексана, насыщенного ацетонитрилом. Обезжиренный ацетонитрильный экстракт обезвоживают добавлением 10 г сернокислого натрия и выдерживанием в темноте в течение 30 мин.
<a id="p100170"></a>Экстракт фильтруют через ватный тампон в грушевидную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40 - 45 °C. Остаток в отгонной колбе растворяют в 2 см3 хлороформа и проводят его очистку с помощью колоночной хроматографии. Для этого на дно стеклянной колонки помещают ватный тампон, на который насыпают слой сернокислого натрия толщиной 5 мм и суспензию 4 г силикагеля в 20 см3 бензола. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя силикагеля, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 20 мм. Растворителю дают стечь, после чего в колонку вносят экстракт. Экстракту дают полностью впитаться в фильтрующий слой, после чего в колонку вносят 100 см3 смеси бензол-гексан-этиловый эфир (1:1:2). Растворителю дают полностью пройти через колонку, элюат отбрасывают. В колонку вносят 100 см3 смеси хлороформ-ацетон (9:1), с этого момента начинают собирать элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0,4 см3 смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

###### <a id="p100171"></a>3.5.2.5 Очистка экстракта из молочных продуктов (включая животное масло)

<a id="p100172"></a>Очистку экстракта проводят с помощью колоночной хроматографии. Для этого готовят колонку по 3.5.2.4, используя при этом 2 г силикагеля. В колонку вносят экстракт и дают ему полностью впитаться в фильтрующий слой. После этого проводят последовательное элюирование следующими смесями растворителей порциями по 25 см3:
- <a id="p100173"></a>толуол-уксусная кислота (9,5:0,5);
- <a id="p100174"></a>гексан;
- <a id="p100175"></a>этиловый эфир-гексан-ацетонитрил (5:3:0,5).
<a id="p100176"></a>Элюаты отбрасывают. В колонку вносят 60 см3 смеси хлороформ-ацетон (4:1), с этого момента начинают отбирать выходящий элюат. После прекращения выхода элюата из колонки его по частям упаривают в остродонной колбе на ротационном испарителе при температуре 35 - 40 °C досуха. Остаток в отгонной колбе растворяют в 0,2 см3 смеси бензол-ацетонитрил (97:3) и используют для хроматографического анализа.

##### <a id="p100177"></a>3.5.3 Качественное определение афлатоксинов  и

<a id="p100178"></a>На пластинку "Силуфол" сверху и снизу наносят две тонкие карандашные линии на расстоянии 1,5 см от краев. На нижней (стартовой) линии отмечают 3 точки на расстоянии 2 см друг от друга, в которые наносят с помощью микрошприца по 0,002, 0,005 и 0,01 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов  и . При испытании молочных продуктов в эти же точки наносят дополнительно по 0,002, 0,005 и 0,01 см3 рабочего раствора афлатоксина . На расстоянии 1 см между пятнами рабочих растворов наносят 0,01 и 0,02 см3 исследуемого раствора. Пластинку стартовой линией вниз помещают в хроматографическую камеру, предварительно заполненную смесью этиловый эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) (при испытании молочных продуктов - этиловый эфир-метанол-вода (90:8:2)). Развитие хроматограммы проводят до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии.
<a id="p100179"></a>Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 мин и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете. На хроматограмме рабочего раствора смеси афлатоксинов последние располагаются по направлению движения фронта растворителя в следующем порядке: , , . Обнаружение на хроматограммах экстракта пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флюоресценции пятнам афлатоксинов  и  из рабочих растворов, свидетельствует о возможном наличии этих афлатоксинов в пищевом продукте. Обнаружение на хроматограммах экстракта пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флюоресценции пятнам афлатоксина , свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из пробы.
<a id="p100180"></a>Для подтверждения присутствия афлатоксинов  и  используют любой из следующих тестов.
<a id="p100181"></a>По первому тесту пластинку опрыскивают из распылителя раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в ультрафиолетовом свете. Если цвет флюоресценции пятен на хроматограммах афлатоксинов изменился с синего на желтый, а цвет флюоресценции соответствующих пятен на хроматограммах экстракта не изменился, то афлатоксин в пробе отсутствует. Если же цвет флюоресценции соответствующих пятен на хроматограммах экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пробе.
<a id="p100182"></a>По второму тесту на стеклянную пластинку 20 x 20 см наносят 2 - 4 см3 раствора йода в этиловом эфире, распределяют его по всей поверхности и дают эфиру испариться. Над хроматографической пластинкой на расстоянии 0,5 - 1,0 см помещают пластинку с тонким слоем йода и подвергают ее воздействию паров йода в течение 1 - 2 мин. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете. Сохранение цвета и интенсивности флюоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в пробе продукта.

##### <a id="p100183"></a>3.5.4 Количественное определение афлатоксинов  и

<a id="p100184"></a>Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями в соответствии с рисунком 1. В точку 1 микрошприцем наносят 0,020 см3 исследуемого раствора. В точку 2 наносят 0,005 см3, в точки 3, 4 и 5 соответственно 0,002, 0,004 и 0,006 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов  и . При испытании молочных продуктов дополнительно наносят рабочий раствор афлатоксина  в тех же количествах и в те же точки, что и рабочий раствор смеси афлатоксинов  и . Массу афлатоксинов  и  , нг, нанесенную в каждую точку, рассчитывают по формуле

<div align="center">

<a id="p100185"></a>, (2)

</div>


<a id="p100186"></a>где c - концентрация афлатоксина в рабочем растворе, мкг/см3;
<a id="p100187"></a>V - объем рабочего раствора афлатоксина, нанесенный в точку на пластинке, см3.



<div align="center">

<a id="p100189"></a>1 - 5 - точки нанесения растворов единицы измерения<br>
приведены в мм

<a id="p100190"></a>Рисунок 1. Схема нанесения растворов<br>
на хроматографическую пластинку

</div>



<a id="p100191"></a>Хроматографическую камеру заполняют смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5) (при испытании молочных продуктов - (90:8:2)). Пластинку помещают в камеру для развития хроматограммы в первом направлении до достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии.
<a id="p100192"></a>Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин, затем развитие хроматограммы проводят во втором направлении в системе хлороформ-ацетон (9:1) (при испытании молочных продуктов - хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5)). После достижения фронтом растворителя верхней карандашной линии пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете.
<a id="p100193"></a>Обнаружение афлатоксинов  и  проводят аналогично 3.5.3. В случае подтверждения присутствия афлатоксинов  и  в пробе их количественно определяют, сравнивая интенсивность флюоресценции пятен афлатоксинов в пробе и пятен из рабочего раствора афлатоксинов. Если интенсивность флюоресценции пятен афлатоксинов в исследуемом растворе выше интенсивности флюоресценции пятен, соответствующих 0,006 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов, проводят повторное хроматографическое разделение. В этом случае на пластинку наносят меньшее количество исследуемого раствора.

#### <a id="p100194"></a>3.6 Обработка результатов измерений

<a id="p100195"></a>3.6.1. Содержание афлатоксина , , мг/кг, для зерновых, зернобобовых, орехов, кондитерских изделий, хлебопродуктов, плодоовощных консервов и концентратов вычисляют по формуле

<div align="center">

<a id="p100196"></a>, (3)

</div>


<a id="p100197"></a>где  - масса афлатоксина , обнаруженная в пятне пробы, нг;
 - <a id="p100198"></a>общий объем водно-ацетонового экстракта (при испытании зерновых, зернобобовых и хлебопродуктов - суммарный объем добавленных растворов хлорида натрия и ацетона), см3;
 - <a id="p100199"></a>объем водно-ацетонового экстракта после прибавления к нему раствора ацетата свинца и воды, см3;
 - <a id="p100200"></a>объем, до которого сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, см3;
<a id="p100201"></a>K - коэффициент извлечения афлатоксина  по таблице 1;
<a id="p100202"></a>m - масса навески пробы, г;
 - <a id="p100203"></a>объем водно-ацетонового фильтрата, взятый на анализ, см3;
 - <a id="p100204"></a>объем водно-ацетонового фильтрата после очистки ацетатом свинца, взятый на анализ, см3;
 - <a id="p100205"></a>объем экстракта, нанесенный на пластинку, см3.

##### <a id="p100206"></a>3.6.2 Содержание афлатоксина , , мг/кг, для кофе, чая и какао вычисляют по формуле


<div align="center">

<a id="p100207"></a>, (4)

</div>


<a id="p100208"></a>где  - масса афлатоксина , обнаруженная в пятне пробы, нг;
 - <a id="p100209"></a>объем хлороформа, добавленный к пробе для экстракции, см3;
 - <a id="p100210"></a>объем, до которого сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, см3;
<a id="p100211"></a>K - коэффициент извлечения афлатоксина  по таблице 1;
<a id="p100212"></a>m - масса навески пробы, г;
 - <a id="p100213"></a>объем хлороформного экстракта, взятый на анализ, см3;
 - <a id="p100214"></a>объем экстракта, нанесенный на пластинку, см3.
<a id="p100215"></a>3.6.3. Содержание афлатоксина , , мг/кг, для растительных масел и афлатоксинов  и , , мг/кг, для животного масла вычисляют по формуле

<div align="center">

<a id="p100216"></a>, (5)

</div>


<a id="p100217"></a>где  - масса афлатоксина  или , обнаруженная в пятне пробы, нг;
 - <a id="p100218"></a>объем, до которого сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, см3;
<a id="p100219"></a>K - коэффициент извлечения афлатоксина  и  по таблице 1;
<a id="p100220"></a>m - масса навески пробы, г;
 - <a id="p100221"></a>объем экстракта, нанесенный на пластинку, см3.

##### <a id="p100222"></a>3.6.4 Содержание афлатоксинов  или , , мг/кг, для молочных продуктов вычисляют по формуле


<div align="center">

<a id="p100223"></a>, (6)

</div>



<a id="p100224"></a>где  - масса афлатоксина  или , обнаруженная в пятне пробы, нг;
 - <a id="p100225"></a>объем хлороформа, добавленный к пробе для экстракции, см3;
 - <a id="p100226"></a>объем, до которого сконцентрирован экстракт перед хроматографическим разделением, см3;
<a id="p100227"></a>K - коэффициент извлечения афлатоксина  или  по таблице 1;
<a id="p100228"></a>m - масса навески пробы, г;
 - <a id="p100229"></a>объем хлороформного экстракта, взятый на анализ, см3;
 - <a id="p100230"></a>объем экстракта, нанесенный на пластинку, см3.

<div align="right">

<a id="p100231"></a>Таблица 1

</div>


<a id="p100232"></a>Коэффициенты извлечения афлатоксинов


| Наименование группы продуктов | Наименование микотоксина | Значение коэффициента извлечения |
| --- | --- | --- |
| Зерновые, зернобобовые, | Афлатоксин B | 0,75 |
| орехи, кондитерские изделия, хлебопродукты, плодоовощные консервы Какао-бобы, какао-порошок, | 1 Афлатоксин B | 0,75 |
| шоколад Кофе, чай | 1 Афлатоксин B 1 | 0,80 |
| Растительные и животные масла | Афлатоксин B 1 | 0,70 |
| Молочные продукты | Афлатоксин B 1 Афлатоксин M 1 | 0,70 0,70 |


<a id="p100240"></a>За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второй значащей цифры.
<a id="p100241"></a>Расхождение между результатами двух параллельных измерений (в процентах от среднего значения) не должно превышать значений показателя сходимости d при доверительной вероятности P = 0,95, указанных в таблице 2.

<div align="right">

<a id="p100242"></a>Таблица 2

</div>


<div align="center">

<a id="p100243"></a>Метрологические характеристики

</div>

метода тонкослойной хроматографии


<table>
<colgroup><col width="30%"><col width="19%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Наименование группы продуктов</td><td rowspan="2">Наименование микотоксина</td><td colspan="3">Значения метрологических характеристик для нижней (н) и верхней (в) границ диапазонов измеряемых содержаний при доверительной вероятности P = 0,95</td></tr>
<tr><td>Сходимость результатов d, %</td><td>Воспроизводимость результатов D, %</td><td>Модули границ интервалов относительной погрешности измерений дельта, %</td></tr>
<tr><td>Зерновые,</td><td>Афлатоксин B</td><td>d = 60</td><td>D = 80</td><td>дельта = 50</td></tr>
<tr><td>зернобобовые, орехи, кондитерские изделия, хлебопродукты, плодоовощные консервы, концентраты</td><td>1</td><td>н d = 50 в</td><td>н D = 70 в</td><td>н дельта = 40 в</td></tr>
<tr><td>Какао, какао-</td><td>Афлатоксин B</td><td>d = 60</td><td>D = 70</td><td>дельта = 40</td></tr>
<tr><td>порошок, шоколад</td><td>1</td><td>н d = 50 в</td><td>н D = 70 в</td><td>н дельта = 40 в</td></tr>
<tr><td>Кофе, чай</td><td>Афлатоксин B 1</td><td>d = 70 н d = 50 в</td><td>D = 80 н D = 60 в</td><td>дельта = 50 н дельта = 40 в</td></tr>
<tr><td>Растительные масла</td><td>Афлатоксин B 1</td><td>d = 50 н d = 30 в</td><td>D = 80 н D = 40 в</td><td>дельта = 50 н дельта = 30 в</td></tr>
<tr><td>Молочные продукты</td><td>Афлатоксин B 1 Афлатоксин M 1</td><td>d = 40 н d = 30 в d = 100 н d = 50 в</td><td>D = 50 н D = 40 в D = 100 н D = 70 в</td><td>дельта = 30 н дельта = 20 в дельта = 60 н дельта = 40 в</td></tr>
</table>


<a id="p100258"></a>Расхождение между результатами измерений в двух лабораториях (в процентах от среднего значения) не должно превышать значений показателя воспроизводимости D при доверительной вероятности P = 0,95, указанных в таблице 2.
<a id="p100259"></a>Модули границ интервала относительной погрешности измерений при доверительной вероятности P = 0,95 указаны в таблице 2.
<a id="p100260"></a>В промежуточных точках диапазона измерений метрологические характеристики могут быть найдены методом линейной интерполяции.


### 4. <a id="p100261"></a>Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии


<a id="p100262"></a>Метод основан на экстракции афлатоксинов  и  из пробы продукта, очистке экстракта от мешающих веществ и измерении массовой концентрации афлатоксинов  и  в экстракте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флюориметрическим детектированием.
<a id="p100263"></a>Диапазон измеряемых содержаний афлатоксина  во всех продуктах, кроме молочных: 0,003 - 0,02 мг/кг; в молочных продуктах: 0,0005 - 0,003 мг/кг; афлатоксина  - 0,0005 - 0,005 мг/кг.

#### <a id="p100264"></a>4.1 Отбор и подготовка проб

<a id="p100265"></a>Отбор проб и подготовка их к испытанию - по 3.1.

#### <a id="p100266"></a>4.2 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

<a id="p100267"></a>При проведении испытания используют средства измерений, реактивы и материалы по 3.2 со следующим дополнением:
<a id="p100268"></a>Хроматограф жидкостный в составе:
<a id="p100269"></a>насоса высокого давления с верхним пределом давления не менее 25 МПа, диапазоном регулирования подачи растворителя не менее 0,1 - 5 см3/мин, погрешностью поддержания скорости подачи растворителя не более 2,5% при скорости потока 1,0 см3/мин и давлении 3,45 МПа;
<a id="p100270"></a>петлевого устройства ввода пробы с рабочим объемом петли 0,020 см3;
<a id="p100271"></a>флюориметрического детектора, позволяющего проводить исследования при длине волны возбуждающего излучения 360 нм и длине волны эмиссии 420 нм, с проточной кварцевой кюветой объемом от 0,015 до 0,025 см3, с уровнем флуктуационных шумов не более  флюоресценции, относительной погрешностью измерения интенсивности флюоресценции не более 2%, пределом детектирования по антрацену ;
<a id="p100272"></a>регистрирующего устройства (самописца или интегратора), позволяющего проводить измерения при чувствительности 0,2 мВ/см, с погрешностью записи в рабочих условиях не более 0,5%;
<a id="p100273"></a>колонки длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненной силикагелем с размером частиц 5 мкм. Эффективность колонки по афлатоксину  - не менее 20000 теоретических тарелок на метр.
<a id="p100274"></a>Толуол по ГОСТ 5789, ч.д.а.
<a id="p100275"></a>Эфир этиловый уксусной кислоты по ГОСТ 22300, ч.д.а.
<a id="p100276"></a>Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч.д.а.

#### <a id="p100277"></a>4.3 Условия измерений

<a id="p100278"></a>Температура и относительная влажность в лабораторном помещении при выполнении измерений не должны превышать значений, оговоренных в нормативных документах на средства измерений, указанные в 4.2.

#### <a id="p100279"></a>4.4 Подготовка к выполнению измерений


##### <a id="p100280"></a>4.4.1 Подготовка растворителей

<a id="p100281"></a>Подготовка растворителей - по 3.4.1.

##### <a id="p100282"></a>4.4.2 Приготовление рабочего раствора смеси афлатоксинов  и

<a id="p100283"></a>В мерную колбу вместимостью 100 см3 пипеткой вносят 1,0 см3 основного раствора афлатоксина  и 0,5 см3 основного раствора афлатоксина , приготовленных по 3.4.2. Содержимое колбы доводят до метки смесью бензола с ацетонитрилом (98:2 по объему) и тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксинов  и  в полученном рабочем растворе составляет около 0,1 мкг/см3 и 0,05 мкг/см3 соответственно. Точная концентрация афлатоксинов  и  в рабочем растворе соответствует их точной концентрации в основных растворах, деленной на фактор разведения 100 и 200 соответственно. Рабочий раствор афлатоксинов  и  хранят в тех же условиях, что и основные растворы, приготовленные по 3.4.2. Срок годности рабочего раствора афлатоксинов - 1 г.

##### <a id="p100284"></a>4.4.3 Приготовление рабочего раствора смеси афлатоксинов ,  и

<a id="p100285"></a>0,5 см3 рабочего раствора афлатоксина , приготовленного по 3.4.4, и 1 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов  и , приготовленного по 3.4.3, переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью бензола с ацетонитрилом (9:1 по объему). Содержимое колбы тщательно перемешивают. Массовая концентрация афлатоксина  в полученном рабочем растворе составляет 0,05 мкг/см3, афлатоксинов  и  - около 0,1 мкг/см3 и 0,05 мкг/см3 соответственно. Точная концентрация афлатоксинов  и  в рабочем растворе соответствует их точной концентрации в основных растворах, деленной на фактор разведения 100 и 200 соответственно. Рабочий раствор афлатоксинов ,  и  хранят в тех же условиях, что и основные растворы, приготовленные по 3.4.2. Срок годности рабочего раствора афлатоксинов - 1 г.

##### <a id="p100286"></a>4.4.4 Подготовка флоризила

<a id="p100287"></a>Флоризил готовят по 3.4.5.

##### <a id="p100288"></a>4.4.5 Подготовка хроматографа к работе

<a id="p100289"></a>Готовят смесь толуол-этилацетат-муравьиная кислота (8:4:1), которую используют в качестве подвижной фазы. На флюориметрическом детекторе устанавливают длину волны возбуждающего излучения 360 нм и длину волны эмиссии 420 нм. Чувствительность детектора устанавливают таким образом, чтобы при вводе в хроматограф 1 нг афлатоксина  перо самописца отклонялось на полную шкалу. Чувствительность самописца устанавливают на 10 мВ. Подвижной фазой кондиционируют колонку хроматографа при скорости потока 1,2 см3/мин в течение 20 мин, после чего хроматограф считается готовым к работе.
<a id="p100290"></a>Допускается использование подвижной фазы другого состава, обеспечивающей разделение пиков афлатоксинов ,  и  не хуже, чем на образцовой хроматограмме (рисунок 2).



<div align="center">

<a id="p100292"></a>Рисунок 2. Хроматограмма рабочего раствора<br>
смеси афлатоксинов

</div>



##### <a id="p100293"></a>4.4.6 Определение времени удерживания и градуировочных коэффициентов афлатоксинов

<a id="p100294"></a>В инжектор хроматографа микрошприцем вводят 0,005 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов ,  и  и определяют время удерживания и высоты пиков каждого афлатоксина на хроматограмме. Афлатоксины располагаются на хроматограмме в следующей последовательности по возрастанию времени удерживания: афлатоксин , афлатоксин , афлатоксин . Градуировочный коэффициент K для афлатоксинов  и  рассчитывают по формуле

<div align="center">

<a id="p100295"></a>, (7)

</div>


<a id="p100296"></a>где c - массовая концентрация афлатоксина  или  в рабочем растворе, мкг/см3;
 - <a id="p100297"></a>высота пика афлатоксина  (внутреннего стандарта), мм;
 - <a id="p100298"></a>массовая концентрация афлатоксина  (внутреннего стандарта) в рабочем растворе, мкг/см3;
<a id="p100299"></a>h - высота пика афлатоксина  или , мм.
<a id="p100300"></a>За окончательный результат определения градуировочных коэффициентов принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 2% от среднего значения.
<a id="p100301"></a>Градуировку следует проводить через каждые 6 ч работы прибора.

#### <a id="p100302"></a>4.5 Выполнение измерений


##### <a id="p100303"></a>4.5.1 Экстракция

<a id="p100304"></a>Экстракцию афлатоксинов проводят по 3.5.1.

##### <a id="p100305"></a>4.5.2 Очистка экстракта

<a id="p100306"></a>Очистку экстракта проводят по 3.5.2.

##### <a id="p100307"></a>4.5.3 Хроматографический анализ

<a id="p100308"></a>В инжектор хроматографа с помощью микрошприца вводят 0,020 см3 очищенного и сконцентрированного экстракта. При появлении на хроматограмме экстракта пика, совпадающего по времени удерживания с пиком афлатоксина ,  или  на хроматограмме рабочего раствора, определяют его высоту. Если пик афлатоксина  или  на хроматограмме экстракта выходит за пределы шкалы регистрирующего устройства, хроматографический анализ экстракта проводят повторно, вводя в инжектор меньший объем экстракта. Обнаружение на хроматограмме экстракта пика афлатоксина  свидетельствует о правильном извлечении афлатоксинов из пробы.

##### <a id="p100309"></a>4.5.4 Качественное определение афлатоксинов  и

<a id="p100310"></a>При обнаружении на хроматограмме пиков, совпадающих по времени удерживания с пиками афлатоксинов  или  в рабочем растворе, для подтверждения присутствия афлатоксинов в пробе проводят их качественное определение по 3.5.3.

#### <a id="p100311"></a>4.6 Обработка результатов измерений

<a id="p100312"></a>Содержание афлатоксина  во всех продуктах и афлатоксинов  и  в молочных продуктах X, мг/кг, рассчитывают по формуле

<div align="center">

<a id="p100313"></a>, (8)

</div>


<a id="p100314"></a>где h - высота пика афлатоксина  (или ), мм;
<a id="p100315"></a>K - градуировочный коэффициент для афлатоксина  (или ), рассчитанный по 4.4.6;
<a id="p100316"></a>c - массовая концентрация афлатоксина  (внутреннего стандарта) в основном растворе, мкг/см3, рассчитанная по 3.4.2;
<a id="p100317"></a>V - объем основного раствора афлатоксина , внесенный в пробу, см3;
 - <a id="p100318"></a>высота пика афлатоксина  (внутреннего стандарта), мм;
<a id="p100319"></a>m - масса навески пробы, г.
<a id="p100320"></a>За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второй значащей цифры.
<a id="p100321"></a>Расхождение между результатами двух параллельных измерений (в процентах от среднего значения) не должно превышать значений показателя сходимости d при доверительной вероятности P = 0,95, указанных в таблице 3.
<a id="p100322"></a>Расхождение между результатами измерений в двух лабораториях (в процентах от среднего значения) не должно превышать значений показателя воспроизводимости D при доверительной вероятности P = 0,95, указанных в таблице 3.

<div align="right">

<a id="p100323"></a>Таблица 3

</div>


<div align="center">

<a id="p100324"></a>Метрологические характеристики

</div>

метода высокоэффективной жидкостной хроматографии


<table>
<colgroup><col width="30%"><col width="19%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Наименование группы продуктов</td><td rowspan="2">Наименование микотоксина</td><td colspan="3">Значения метрологических характеристик для нижней (н) и верхней (в) границ диапазонов измеряемых содержаний при доверительной вероятности P = 0,95</td></tr>
<tr><td>Сходимость результатов d, %</td><td>Воспроизводимость результатов D, %</td><td>Модули границ интервалов относительной погрешности измерений дельта, %</td></tr>
<tr><td>Зерновые,</td><td>Афлатоксин B</td><td>d = 20</td><td>D = 30</td><td>дельта = 20</td></tr>
<tr><td>зернобобовые, орехи, кондитерские изделия, хлебопродукты, плодоовощные консервы</td><td>1</td><td>н d = 10 в</td><td>н D = 20 в</td><td>н дельта = 10 в</td></tr>
<tr><td>Какао-бобы, какао-</td><td>Афлатоксин B</td><td>d = 20</td><td>D = 30</td><td>дельта = 20</td></tr>
<tr><td>порошок, шоколад</td><td>1</td><td>н d = 10 в</td><td>н D = 30 в</td><td>н дельта = 20 в</td></tr>
<tr><td>Кофе, чай</td><td>Афлатоксин B 1</td><td>d = 20 н d = 20 в</td><td>D = 30 н D = 30 в</td><td>дельта = 20 н дельта = 20 в</td></tr>
<tr><td>Растительные масла</td><td>Афлатоксин B 1</td><td>d = 20 н d = 10 в</td><td>D = 30 н D = 20 в</td><td>дельта = 20 н дельта = 10 в</td></tr>
<tr><td>Молочные продукты</td><td>Афлатоксин B 1</td><td>d = 20 н d = 10 в</td><td>D = 30 н D = 20 в</td><td>дельта = 20 н дельта = 10 в</td></tr>
</table>


<a id="p100336"></a>Модули границ интервала относительной погрешности измерений при доверительной вероятности P = 0,95 указаны в таблице 3.
<a id="p100337"></a>В промежуточных точках диапазона измерений метрологические характеристики могут быть найдены методом линейной интерполяции.


### 5. <a id="p100338"></a>Требования безопасности


<a id="p100339"></a>При работе с афлатоксинами следует соблюдать особую предосторожность из-за их высокой токсичности. После проведения испытания и приготовления основного и рабочего растворов афлатоксинов необходимо ополоснуть рот и руки раствором гипохлорита натрия, затем тщательно вымыть руки с мылом. Раствор гипохлорита натрия готовят по Приложению А.
<a id="p100340"></a>Оборудование, находящееся в контакте с афлатоксинами, после проведения испытания необходимо обработать раствором гипохлорита натрия. Для обеззараживания растворов, содержащих афлатоксин, их упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в 1 см3 метанола, к полученному раствору добавляют 20 см3 раствора гипохлорита натрия, выдерживают смесь в течение 2 ч и сливают в канализацию.
<a id="p100341"></a>При работе с метанолом следует соблюдать правила техники безопасности в соответствии с общими санитарными правилами работы с метанолом [9].
<a id="p100342"></a>Помещение, в котором установлен жидкостный хроматограф, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.





<div align="right">

<a id="p100343"></a>Приложение А

</div>

<div align="center">

(справочное)

<a id="p100344"></a>**МЕТОДИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ГИПОХЛОРИТА НАТРИЯ**

</div>


<a id="p100345"></a>Готовят растворы: 10 г хлорной извести в 170 см3 воды и 7 г углекислого натрия в 170 см3 воды. Второй раствор приливают к первому при непрерывном перемешивании. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Полученный раствор хранят в темноте.





<div align="right">

<a id="p100346"></a>Приложение Б

</div>

<div align="center">

(справочное)

<a id="p100347"></a>**БИБЛИОГРАФИЯ**

</div>



1. <a id="p100348"></a>ТУ 64-1-1080-78 Аппарат универсальный для встряхивания жидкостей
   в колбах и пробирках АВУ 6с
2. <a id="p100349"></a>ТУ 46-22-603-75 Баня водяная лабораторная с электрическим или
   огневым подогревом
3. <a id="p100350"></a>ТУ 25-03-2152-76 Микрошприц МШ-10
4. <a id="p100351"></a>ТУ 6-09-3534-74 Ацетонитрил
5. <a id="p100352"></a>ТУ 6-09-3375-78 Гексан
6. <a id="p100353"></a>ГФХ ст. 34 Эфир медицинский
7. <a id="p100354"></a>ТУ 6-09-402-87 Спирт изопропиловый
8. <a id="p100355"></a>ТУ 6-09-4140-75 Свинец (II) уксуснокислый основной
9. <a id="p100356"></a>N 4132-86 от 18.07.86 Общие санитарные правила работы с метанолом
   <a id="p100357"></a>------------------------------------------------------------------


## Иллюстрации

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$c = \frac{DM1000}{\epsilon l}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$\epsilon$

$B_{1}$

$\epsilon = 1,98 \cdot 10^{4}\text{дм}^{3} \cdot \text{моль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1}$

$B_{2}$

$\epsilon = 2,09 \cdot 10^{4}\text{дм}^{3} \cdot \text{моль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$m_{\text{а}}$

$m_{\text{а}} = cV \cdot 1000$

![](https://i.bukva.ai/ZgVOHBT7/img_0.png)

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$X_{1}$

$X_{1} = \frac{m_{1}V_{1}V_{3}V_{5}}{KmV_{2}V_{4}V_{6}} \cdot 10^{- 3}$

$m_{1}$

$B_{1}$

$V_{1}$

$V_{3}$

$V_{5}$

$B_{1}$

$V_{2}$

$V_{4}$

$V_{6}$

$B_{1}$

$X_{2}$

$X_{2} = \frac{m_{1}V_{1}V_{3}}{KmV_{2}V_{4}} \cdot 10^{- 3}$

$m_{1}$

$B_{1}$

$V_{1}$

$V_{3}$

$B_{1}$

$V_{2}$

$V_{4}$

$B_{1}$

$X_{3}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$X_{3}$

$X_{3} = \frac{m_{1}V_{1}}{KmV_{2}} \cdot 10^{- 3}$

$m_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$V_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$V_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$X_{4}$

$X_{4} = \frac{m_{1}V_{1}V_{3}}{KmV_{2}V_{4}} \cdot 10^{- 3}$

$m_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$V_{1}$

$V_{3}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$V_{2}$

$V_{4}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$8 \cdot 10^{- 5}\text{ед}.$

$8 \cdot 10^{- 12}\text{г}/\text{см}^{3}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

![](https://i.bukva.ai/ZgVOHBT7/img_1.png)

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$K = \frac{ch_{1}}{c_{1}h}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$h_{1}$

$B_{2}$

$c_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{2}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$X = \frac{hKcV}{h_{1}m}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{1}$

$M_{1}$

$B_{2}$

$B_{2}$

$h_{1}$

$B_{2}$