Методические указания по определению пропаквизафопа в растительном материале, волокне и семенах хлопчатника, воде и почве методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 29.07.1991 № 6251-91)
Утверждено Министерством здравоохранения СССР 29 июля 1991 г. № 6251-91
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПРОПАКВИЗАФОПА В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ, ВОЛОКНЕ И СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА, ВОДЕ И ПОЧВЕ МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Разработано: Мурашко С.В. ВНИИГИНТОКС г. Киев.
Ажил, 100% концентрат эмульсии.
2-изопропилиденамино-оксиэтил(R)-2-[4-(6-хлорхиноксамин-2-окси) фенокси] пропионат (ИЮПАК).
Кристаллическое вещество, Tпл. 62,5 °C. Растворимость в воде — 1,0·10-3 г/л (1,9 ppm). Растворимость в органических растворителях:
10 — 50 г/л — гептан, технический этиловый спирт, изопропанол;
> 100 г/л — хлороформ, метанол, диметилсульфоксид, диоксан;
> 250 г/л — толуол, ацетон, ацетонитрил, ксилол, циклогексанон.
Давление паров: 1,2·10-7 Pa (25 °C) или 9,00·10-10 мм рт. ст.
Ажил — гербицид, эффективный против широкого спектра злаковых сорняков в посевах сахарной свеклы, льна, хлопчатника при норме расхода 1,5 — 2,0 л/га.
Пропаквизафоп относится к малоопасным препаратам. Острая оральная ЛД50 для крыс 2800 мг/кг, дермальная 2000 мг/кг. Наблюдается умеренное раздражение глаз и кожи у кроликов. Токсичен для рыб. Отрицательного действия для птиц и других организмов не было обнаружено.
2.1.1 Принцип метода.
Метод основан на извлечении пропаквизафопа из исследуемого объекта ацетоном и хроматографическом (ТСХ) разделении в тонком слое пластинок «Силуфол» в подвижной фазе гексан:этилацетат:уксусная кислота и проявлении реагентом на основе бромфенолового синего.
Газохроматографический метод (ГЖХ) определения пропаквизафопа основан на извлечении его метаболита после гидролиза экстракта в кислой среде органическим растворителем и последующим определении с детектором постоянной скорости рекомбинации в виде ацильного производного.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода.
2.2 Реактивы и растворы.
Ацетон, осч., ТУ 6-09-3513-86.
Диэтиловый эфир (медицинский).
Этилацетат, чда., ГОСТ 22300-76.
Сульфат натрия безводный, ч., ГОСТ 4166-76.
Ажил (производство фирмы Сиба-Гейги, 99,9%).
Окись алюминия II ст. активности.
Уголь активированный марки OV-«A».
Бензол, хч., ГОСТ 5955-78.
Пентафторбензилбромид, ч., 1% раствор в ацетоне (реактив по заказу синтезирует институт органической химии СО АН СССР: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, д. 9).
Углекислый калий, хч., ГОСТ 4221-76, 30%-ный водный раствор, промытый бензолом.
Азот в баллоне, особой чистоты, ГОСТ 9293-74.
Неподвижная фаза — 5% XE-60 на Хроматоне N-AW-DMCS.
2.3 Приборы и посуда.
Ротационный испаритель типа ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.
Колбы грушевидные (круглодонные) емкостью 50, 250, 100, 50 мл, ОКШ 500-29150-14, ГОСТ 10384-72.
Колбы мерные на шлифах, вместимостью 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.
Пробирки мерные на шлифах, вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 1770-74.
Аппарат для встряхивания, ТУ 25-11-917-79.
Воронка Бюхнера, ГОСТ 6574-63.
Делительная воронка вместимостью 500 мл.
Колбы конические, емкостью 500 мл, ГОСТ 1770-74.
Микрошприц на 10 мкл, МШ-10, TYSE-2833.024.
Секундомер СД Спр.1.2000, ГОСТ 5072-79.
Газовый хроматограф серии «Цвет» с ДПР.
Колонки стеклянные длиной 2 м и внутренним диаметром 3,5 мм.
Камера хроматографическая, ГОСТ 23932-79.
Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-79.
Пластинки хроматографические «Силуфол» (Хемапол, ЧССР).
2.4 Отбор, хранение и подготовка проб.
Отбор, хранение и доставка проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденных заместителем Главного государственного санитарного врача СССР № 2051-79 от 21.08.79 г.
2.5 Подготовка к определению.
2.5.1 Приготовление стандартных растворов.
Основной стандартный раствор (ОСР) ажила с концентрацией 100 мкг/мл готовят взятием навески 10 мг (0,0100 г) и растворением в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл. Хранить в холодильнике в течение 3-х месяцев. Рабочие стандартные растворы с содержанием 10 мкг/мл и 1,0 мкг/мл готовят соответствующим разбавлением ОСР ацетоном. Хранить в холодильнике в течение 2-х месяцев.
2.5.2 Приготовление проявляющего реактива.
- 0,05%-ный раствор бромфенолового синего в ацетоне (10 мл) разбавляют до 100 мл 1%-м водно-ацетоновым (1:3) раствором азотнокислого серебра; 2) 5% раствор уксусной кислоты.
2.5.3 Подвижная фаза для ТСХ.
Гексан:этилацетат:уксусная кислота = 33:16,5:0,5
2.6 Описание определения.
2.6.1 Экстракция, очистка экстрактов.
2.6.1.1. Вода. К 200 мл H2O прибавляют 20 г хлористого натрия и экстрагируют 50 мл хлороформа в течение 1 часа на Шуттель-аппарате. Отделяют органический слой. Экстракцию повторяют. Объединенные экстракты сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 50 мл 0,1 № HCl, колбу закрывают пробкой и проводят гидролиз при 100 °C в течение 40 минут. Охлаждают и водный слой подщелачивают 1,0 № NaOH до pH 9 — 10.
Экстрагируют 2 x 10 мл гексана, экстракт выбрасывают. К водной фазе прибавляют 1,0 № HCl до pH 1 — 2 и экстрагируют 3 x 10 мл смесью гексан:эфир = 4:1. Экстракт упаривают досуха. Далее проводят бензилирование.
2.6.1.2. Почва. 25,0 г анализируемой пробы помещают в плоскодонную колбу, емкостью 500 мл, заливают 80 мл ацетона. Смесь перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 2-х часов, фильтруют на воронке Бюхнера с фильтром «синяя лента». Остаток на фильтре тщательно промывают 50 мл ацетона. Объединенный фильтрат упаривают досуха в вакууме водоструйного насоса при температуре водяной бани 40 °C и проводят очистку на колонке (l = 50 см, d = 0,5 см), заполненную в следующей последовательности: 10 г окиси алюминия II ст. активности, 5 г силикагеля марки КСК и 2 г безводного сульфата натрия. Остаток после упаривания растворяют в 2 мл гексана и переносят на колонку.
Затем проводят элюирование 70 мл смеси гексан:этилацетат (9:1), эту фракцию выбрасывают. Элюируют вещество 200 мл гексан:этилацетат (7:3), элюат упаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 50 мл 0,1 № HCl, закрывают пробкой и проводят гидролиз при 100 °C в течение 40 минут. Охлаждают и экстрагируют 3 x 10 мл смесью гексан:эфир (4:1). Объединенные экстракты упаривают досуха и проводят бензилирование.
2.6.1.3. Растительный материал. 10 г измельченной зелени помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, заливают 100 мл ацетона, экстрагируют в течение 1 часа. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера с фильтром «синяя лента». Экстракцию повторяют. Остаток на фильтре тщательно промывают 50 мл ацетона. Объединенный экстракт упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл гексана и проводят очистку на колонке (l = 50 см, d = 0,5 см), заполненную 10 г окиси алюминия II ст. активности, 5 г силикагеля марки КСК, 2 г безводного сернокислого натрия.
Элюируют 70 мл смеси гексан:этилацетат (9:1), эту фракцию выбрасывают. Затем проводят элюирование 200 мл смеси гексан:этилацетат 7:3, его упаривают досуха в вакууме водоструйного насоса. К остатку прибавляют 50 мл 0,1 № HCl, колбу закрывают пробкой и проводят гидролиз при температуре водяной бани 100 °C в течение 40 мин. Охлаждают и экстрагируют 3 x 10 мл смесью гексан:эфир 4:1. Экстракт упаривают досуха и проводят бензилирование.
2.6.1.4. Хлопковые семена. 25 г хлопковых семян, освобожденных от волокон и измельченных, заливают 50 мл ацетона и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 2-х часов. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера и упаривают до 2 — 3 мл. К остатку прибавляют 100 мл 10%-ого водного раствора NaCl и экстрагируют 3 x 50 мл гексаном. Затем проводят реэкстракцию объединенных гексановых экстрактов 3 x 40 мл ацетонитрилом. Ацетонитрильный экстракт упаривают досуха и проводят очистку на колонке, размером 50 см x 0,4 см, заполненную в следующей последовательности: 10 г Al2O3 II ст. активности, 5 г силикагеля марки КСК, 2 г безводного сульфата натрия.
Остаток растворяют в 2 мл гексана и проводят хроматографию на колонке: элюируют 70 мл смеси гексан:этилацетат (9:1) и эту фракцию отбрасывают, собирают фракцию 200 мл гексан:этилацетат (7:3), ее упаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 50 мл 0,1 № HCl, закрывают пробкой и проводят гидролиз при 100 °C в течение 40 минут. Охлаждают, прибавляют 1,0 № NaOH до pH 9 — 10 и экстрагируют 2 x 10 мл гексаном, органический слой выбрасывают, к водному слою прибавляют 1,0 № HCl до pH 1 — 2 и экстрагируют 3 x 10 мл смесью гексан:эфир (4:1). Объединенные экстракты упаривают в вакууме водоструйного насоса при 40 °C досуха и проводят бензилирование.
2.6.1.5. Волокно хлопчатника. 10 г волокна хлопчатника измельчают, заливают 100 мл ацетона и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 2-х часов. Дальнейшее определение проводят аналогично разделу 2.6.1.4.
2.6.2 Получение производного.
К сухому остатку прибавляют 10 мл ацетона, 0,2 мл 1% ацетонового раствора пентафторбензилбромида, 30 мкл 30%-ного водного раствора углекислого калия и 3 г безводного сульфата натрия. Бензилирование проводят в круглодонной колбе с обратным холодильником при температуре водяной бани 70 — 75 °C в течение 40 минут. Охлаждают и хроматографируют.
2.6.3 Условия хроматографирования.
2.6.3.1 ГЖХ.
Газовый хроматограф серии «Цвет» с ДПР.
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 2,0 м и внутренним диаметром 3,5 мм.
Неподвижная фаза 5% XE-30 на Хроматоне N-AW-DMCS.
Температура испарителя — 230 °C.
Температура детектора — 260 °C.
Газ-носитель — азот с расходом 65 — 70 мл/мин.
Скорость диаграммной ленты — 240 мм/час.
2.6.3.2 ТСХ.
Пробу, сконцентрированную до 0,5 мл, количественно переносят на пластинку «Силуфол». Параллельно наносят серию стандартных растворов с содержанием 0,3, 0,5 и 1,0 мкг действующего вещества ажила. Хроматографируют в системе растворителей гексан:этилацетат:уксусная кислота = 66:33:1. После высушивания пластинку обрабатывают 0,05% раствором бромфенолового синего и обесцвечивают фон обработкой пластинки 5%-ным раствором уксусной кислоты. Ажил обнаруживается в виде синих пятен на желтом фоне. Rf = 0,50 +/- 0,02. Предел обнаружения — 0,3 мкг.
Определение содержания ажила в пробе проводят путем сравнения интенсивности окраски и размера пятен проб с пятнами стандартных растворов. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации наблюдается в пределах 0,3 — 2 мкг. При больших концентрациях анализируют аликвоту экстракта.
2.6.4 Обработка результатов анализа.
2.6.4.1 ГЖХ.
Количественную оценку проводят методом абсолютной калибровки по сравнению со стандартом ажила.
Расчет результатов анализа проводят по формуле:
X = \frac{C \cdot \text{Н}_{2} \cdot V_{1} \cdot V_{3}}{\text{Н}_{1} \cdot V_{2} \cdot P} , где
X — содержание пропаквизафопа в анализируемой пробе, мг/кг;
C — концентрация стандартного раствора для ГЖХ, вводимого в хроматограф, мкл/мл;
H1 — высота пика стандартного раствора, мм;
V1 — объем бензилированного экстракта пробы, мл;
V2 — объем стандартного бензилированного раствора, введенного в хроматограф, мкл;
V3 — объем бензилированной пробы, введенный в хроматограф, мкл;
P — навеска анализируемой пробы, г (мл).
2.6.4.2 ТСХ.
Количество пропаквизафопа (X, мг/кг, л) в анализируемой навеске пробы вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{\text{У } \cdot V}{V_{1} \cdot P} , где
У — количество пестицида в хроматографируемом объеме пробы, мкг;
V1 — объем пробы, взятый для хроматографирования, мл;
Соблюдать все требования техники безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями и токсическими веществами.