Определение чувствительности вируса иммунодефицита человека к лекарственным препаратам. Методические рекомендации
(утв. Минздравсоцразвития России 06.08.2007 № 5956-РХ)
Утверждаю Заместитель Министра здравоохранения и социального развития Российской Федерации Р. А. Хальфин 6 августа 2007 г. № 5956-РХ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА К ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПРЕПАРАТАМ
Настоящие методические рекомендации подготовлены Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации в соответствии с условиями и Соглашением между Российской Федерацией и Международным банком реконструкции и развития о займе для финансирования проекта «Профилактика, диагностика, лечение туберкулеза и СПИДа» № 4687-RU в рамках подготовки нормативно-правовых актов и методических документов по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний (Приказ Минздравсоцразвития России от 1 апреля 2006 г. № 251 «О создании Рабочей группы по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний) при участии ФГУ „Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со СПИДом Роспотребнадзора“ (к.б.н. Круглова А.И., к.б.н. Шипулин Г.А., к.м.н. Богословская Е.В., Буравцова Е.В.).»
Методические рекомендации предназначены для специалистов медицинских учреждений, осуществляющих лабораторный мониторинг эффективности антиретровирусной терапии и аккредитованных для проведения генотипического исследования по определению лекарственной устойчивости ВИЧ.
Список сокращений
ВИЧ вирус иммунодефицита человека РНК рибонуклеиновая кислота ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота АРВ антиретровирусная (терапия) АРВП антиретровирусные препараты ПЦР полимеразная цепная реакция ОТ обратная транскрипция Nested-ПЦР гнездовая ПЦР ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота кДНК комплиментарная ДНК MuLV Moloney Murine Leukemia Virus (вирус мышиного лейкоза) FDA Food and drug administration
Введение
Определение лекарственной устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам (АРВП) является важным дополнением в общей схеме противовирусной терапии, так как в большинстве случаев позволяет объяснить причину неэффективности терапии и назначить оптимальную комбинацию препаратов. Смена терапии без учета данных о развившейся устойчивости к используемым препаратам приводит к развитию перекрестной резистентности ВИЧ к большинству известных лекарств, что создает огромную проблему в выборе эффективной схемы лечения.
Для определения лекарственной устойчивости ВИЧ наибольшее распространение получили молекулярные тесты, основанные на секвенировании ДНК. Секвенирование ДНК позволяет получить информацию обо всех нуклеотидных заменах в выбранном фрагменте генома ВИЧ, в том числе о мутациях, вызывающих устойчивость к АРВП. Поскольку основными АРВП для лечения ВИЧ-инфекции являются ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы, то появление мутаций именно в этих генах приводит к развитию лекарственной устойчивости.
Основным недостатком генотипического подхода (в частности, секвенирования ДНК) является сложная интерпретация результатов. Решением этой проблемы стала разработка программ, которые позволяют сопоставлять данные нуклеотидной последовательности вируса, полученного от пациента, с международной базой данных генотипов и фенотипов. С помощью таких программ можно количественно оценить вклад каждой выявленной мутации, а также возможные влияния одних мутаций на другие. Такое усовершенствование генотипического подхода называют «виртуальным фенотипированием». Мутации включены в алгоритм «виртуального фенотипирования» на основании:
2. Рекомендаций Международного Общества США по СПИДу
3. Рекомендаций Объединенной Группы по Устойчивости
4. Базы данных Стенфордского Университета (http://hivdb.stanford.edu/).
Основным недостатком генотипических методов определения резистентности является низкая чувствительность тестов в отношении минорных штаммов. Поэтому одним из противопоказаний к применению метода является его назначение после отмены препарата, когда резистентный штамм переходит в минорное состояние за счет подавления его репликации более жизнеспособными штаммами «дикого» типа.
Показания и противопоказания к проведению теста по определению устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам
Показания к применению охватывают следующие группы:
1. ВИЧ-инфицированные при неэффективности АРВ терапии, если нет других явных причин неэффективности терапии (нарушение приема АРВ препаратов, нарушение всасывания препарата). Вирусологическими критериями неэффективности терапии являются:
- отсутствие снижения концентрации РНК ВИЧ до недетектируемого уровня через 24 недели лечения, если не было перерыва в приеме препарата;
- выявление РНК ВИЧ (в двух определениях с интервалом 1 месяц) после исходной супрессии до недетектируемого уровня, если не было перерыва в приеме препарата.
2. ВИЧ-инфицированные в период острой инфекции перед началом АРВ-терапии, если заражение ВИЧ произошло от партнера с неэффективной АРВ-терапией. В остальных случаях острой инфекции проведение исследования до начала АРВ-терапии не рекомендуется до тех пор, пока уровень первичной резистентности в регионе не достигнет 5%.
Противопоказания к применению метода:
1. Показатель вирусной нагрузки меньше чувствительности используемого теста по определению резистентности.
2. После отмены препарата, т.к. штаммы обуславливающие резистентность могут стать минорными и поэтому не будут выявляться существующими тестами.
Принципы организации лаборатории для проведения генотипического исследования по определению чувствительности ВИЧ к лекарственным препаратам
Лабораторию для проведения генотипического исследования по определению чувствительности ВИЧ к лекарственным препаратам размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здания) с соблюдением требований СП 1.2.731-99. М., 1999 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами» и учетом особенностей устройства ПЦР-лаборатории, изложенных в методических указаниях «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I — II групп патогенности» МУ 1.3.1794-03. М., 2003.
Рабочая зона лаборатории для молекулярного тестирования в соответствии с этапами анализа должна включать определенный набор последовательно расположенных самостоятельных помещений:
- Для подготовки проб, выделения РНК (зона 1);
- Для приготовления реакционных смесей, проведения реакций обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) (зона 2).
В случае использования тест-систем, включающих методику Nested-ПЦР (двухраундовая), необходимо использование отдельного помещения или ПЦР-бокса с отдельным комплектом лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования;
- Для проведения секвенирования (зона 3).
Материально-техническое обеспечение генотипического исследования
Сертифицированные тест-системы для генотипирования ВИЧ-1 методом ПЦР с дальнейшим секвенированием ДНК.
Для этапа выделения РНК из клинического материала требуются:
1. Стерильный ламинарный шкаф.
2. Термостат под пробирки типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс. об./мин.
4. Центрифуга с охлаждением (21 — 25 тыс. g).
6. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости.
7. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема:
20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%;
100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%.
8. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.
9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл.
10. Штативы для микропробирок на 1,5 мл и наконечников.
11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 200 и 1000 мкл.
12. Холодильник от 2 до 8 °С и на минус 18 +/- 2 °С.
13. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим раствором.
Для проведения реакции обратной транскрипции и этапа амплификации требуются:
2. Стерильный ламинарный шкаф.
3. Стерильный ламинарный шкаф для Nested-ПЦР.
5. Дополнительный вортекс для Nested-ПЦР.
6. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема:
0,5 — 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%;
20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%;
100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%.
7. Дополнительный набор автоматических пипеток переменного объема для Nested-ПЦР:
0,5 — 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%;
20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%;
100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%.
8. Штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников.
9. Дополнительные штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников для Nested-ПЦР.
10. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 (0,2) мл.
11. Одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером до 10, 200 и 1000 мкл.
12. Дополнительные одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером до 10, 200 и 1000 мкл для Nested-ПЦР.
13. Холодильник от 2 до 8 °С и на минус 18 +/- 2 °С.
14. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
15. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим раствором.
Для проведения секвенирования.
1. Настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный ламинарный шкаф.
2. Термостат под пробирки типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
3. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс. об./мин.
5. Камера для горизонтального электрофореза для анализа 120 реакций.
6. Источник постоянного тока (150 — 200 В).
7. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей.
8. Видеосистема с цифровой камерой для регистрации и передачи изображения.
10. Автоматический секвенатор.
11. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема:
0,5 — 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%;
20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%;
100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%.
12. Штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл.
13. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 1,5 (0,2) мл.
14. Одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным барьером до 10, 200 и 1000 мкл.
15. Холодильник от 2 до 8 °С и на минус 18 +/- 2 °С.
16. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
17. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим раствором.
18. Оптические 96-луночные планшеты.
Сбор, хранение и транспортировка образцов для проведения генотипического исследования
Способы сбора, условия хранения и транспортирования материала для проведения тестирования по определению чувствительности ВИЧ к лекарственным препаратам должны соответствовать требованиям СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».
Для проведения тестирования по определению чувствительности ВИЧ к лекарственным препаратам может быть использована только плазма крови. Цельная кровь в количестве не менее 5 мл должна собираться в одноразовую пробирку с 3% ЭДТА в соотношении 1:20. После забора пробирка с кровью закрывается крышкой, перемешивается переворачиванием 3 — 4 раза и хранится при температуре +2 — 8 °С не более 24 часов. Плазма крови должна быть отобрана не позднее 24 часов после забора крови. Для этого пробирку с цельной кровью необходимо центрифугировать при 800 — 1600 g в течение 20 минут. Хранить плазму можно не более 3 дней при +4 °С и длительно — при температуре минус 70 °С. Не рекомендуется замораживать/оттаивать плазму более 2-х раз.
Пробоподготовка (выделение РНК ВИЧ-1)
Для повышения чувствительности тест-систем рекомендуется использовать методику предварительного ультрацентрифугирования плазмы крови. Для этого 0,5 — 1 мл плазмы крови пациента центрифугируют в течение 1 часа при температуре +2 — 8 градусов при 24,000g в ультрацентрифуге, супернатант удаляют, а полученный осадок вирусных частиц выделяют по описанной в тест-системе методике.
Выделение РНК ВИЧ-1 из плазмы крови может быть проведено с помощью двух методик. Одна методика основана на специфической обратимой сорбции РНК в присутствии хаотропных солей (гуанидинтиоцианат) на частицах силикагеля и последующей отмывке сорбента с РНК от белков, солей и других ингибиторов ПЦР. Другая методика основана на осаждении вирусной РНК изопропанолом и последующей очистке 70% этанолом.
Из-за нестабильности выделенной РНК не рекомендуется ее длительное хранение. В некоторых тест-системах возможно хранение выделенной РНК при температуре минус 70 °С не более двух недель.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
Для проведения реакции обратной транскрипции выделенная РНК инкубируется в реакционном буфере, содержащем фермент обратную транскриптазу, например, Moloney Murine Leukemia Virus (MuLV) для получения однонитевой комплементарной ДНК (кДНК).
Полученную кДНК можно хранить в холодильнике при температуре от -15 °С до -25 °С до проведения ПЦР не более двух недель или при -70 °С — длительно.
В ходе ПЦР может нарабатываться как один общий фрагмент, включающий ген протеазы и 2/3 гена обратной транскриптазы, так и несколько фрагментов (например, фрагмент гена протеазы и фрагмент 2/3 гена обратной транскриптазы). Кроме того, наработка ампликона может проходить в один раунд либо в два раунда (так называемая, Nested-ПЦР). Во втором раунде ПЦР используется дополнительная пара праймеров, которая локализуется внутри ампликона, полученного в первом раунде. Так как при использовании Nested-ПЦР возрастает опасность контаминации ампликонами первого раунда, необходимо использовать не менее двух отрицательных контролей на панель из 10 образцов и соблюдать правила работы в боксе для Nested-ПЦР (см. пункт 3).
Продукты амплификации могут храниться в течение недели при 2 — 8 °С и длительно — при -20 °С.
Полученный ампликон поступает в 3 зону для проведения реакции секвенирования.
Циклическое секвенирование
Реакция циклического секвенирования включает 4 стадии:
Очистка ПЦР-продукта необходима для освобождения полученного ампликона от нуклеотидов и праймеров и может проводиться двумя способами:
1. Очистка путем сорбции на силикагеле (см. п. 6);
2. Очистка с использованием колонок основана на использовании ультрафильтрующей мембраны, которая пропускает малые по размеру нуклеотиды и праймеры, а крупные по размеру фрагменты ДНК (ампликоны) задерживаются на поверхности фильтра.
Полученный в ПЦР и очищенный ПЦР-продукт анализируют методом электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием. Одновременно с продуктами амплификации в агарозный гель вносится маркерная ДНК, которая включает фрагменты различной длины с известной концентрацией. Количество ДНК в каждом образце можно полуколичественно оценить, сравнивая интенсивность полосы, соответствующей определенному образцу, с интенсивностью маркерной ДНК. После чего выбирается схема для последующего разбавления образцов для циклического секвенирования по инструкции к тест-системе.
Реакционная смесь для секвенирования содержит нуклеотиды, меченные флуорофором, ДНК полимеразу, праймер для секвенирования. Для каждого исследуемого образца ставится несколько реакций секвенирования, в зависимости от количества и длины получаемых в ПЦР продуктов амплификации. Для длинных фрагментов необходимо поставить несколько реакций секвенирования с разными затравочными праймерами.
Секвенирование проводят на амплификаторе, рекомендуемом производителем тест-системы.
Принцип циклического секвенирования основан на встраивании цветных флуоресцентных меток в растущую цепь ДНК за счет терминирующих нуклеотидов. Каждый из четырех терминирующих нуклеотидов содержит метку, флуоресцирующую определенным цветом. Растущая цепь одновременно терминируется и метится в момент присоединения нуклеотидов. В ходе такого процесса образуется каскад последовательностей ДНК, причем каждый синтезированный ДНК-продукт на одно основание длиннее последующего.
Продукт реакции секвенирования подвергается очистке от не включенных нуклеотидов с флуорофорами. Для этого используется методика двукратного осаждения 70 — 75% раствором изопропанола.
Автоматическая детекция продуктов
Автоматическая детекция продуктов реакции секвенирования осуществляется в капиллярных секвенаторах, рекомендуемых производителем тест-системы. В процессе детекции отрицательно заряженные фрагменты каскадной ДНК, полученной в ходе циклического секвенирования, мигрируют в полиакриламидном геле или полимере в капилляре под действием электрического поля. При этом фрагменты малого размера мигрируют быстрее крупных. Каждый фрагмент возбуждается аргоновым лазером, сигнал флуоресценции детектируется CCD-камерой. Дальнейший сбор и преобразование данных осуществляется автоматически.
Интерпретация результатов
Для интерпретации результатов секвенирования ДНК используются запатентованные программы, прилагаемые к тест-системам. Кроме того, анализ результатов может быть осуществлен с помощью специализированных программ, находящихся в свободном доступе в Интернете (например, на сайте Госпиталя Стенфордского Университета, http://hivdb6.stanford.edu). Как правило, результаты представлены в таком виде, что для каждого препарата из группы ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы определена степень устойчивости ВИЧ. Вирус может быть чувствителен к препарату либо иметь высокую, среднюю или низкую степень устойчивости. По этим данным врач принимает решение о необходимости изменения схемы терапии.