Эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией (методические рекомендации)

(вместе с «Противоэпидемическими мероприятиями в очаге дифтерийной инфекции», «Бактериологическими исследованиями при дифтерийной инфекции (методическими рекомендациями)»)

(утв. Приказом Минздрава РСФСР от 10.09.1982 № 575)

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

В течение последних двадцати лет показатели заболеваемости дифтерией и смертности от нее в РСФСР, как и на территории всей страны снижены в десятки раз, уже к 1965 году был достигнут спорадический уровень заболеваемости.

Однако, начиная с 1978 года в нашей республике отмечается увеличение числа больных, участились случаи этой инфекции у подростков и взрослых, стабильно высокими остаются показатели летальности.

Многолетние исследования показали, что антитоксический иммунитет не является препятствием к носительству коринебактерий дифтерии. В условиях резкого сокращения числа больных, носительство токсигенных коринебактерий дифтерии также сократилось, но не исчезло полностью, в связи с чем эпидемический процесс продолжается. При заносе инфекции (в виде заболевания или носительства) в коллективах иммунных детей в ряде случаев формируются очаги носителей токсигенных коринебактерий дифтерии без манифестных форм заболевания. Наиболее часто случаи заболевания и носительства токсигенных коринебактерий дифтерии имеют место в закрытых детских коллективах (в школах — интернатах, детских домах, психиатрических больницах), а также среди взрослых контингентов повышенного риска инфицирования; учащихся ПТУ, лиц, проживающих в общежитиях, медицинских работников, сотрудников школ, детских учреждений, сферы бытового обслуживания населения и других.

Следует учесть, что иммунизация анатоксином не дает пожизненного иммунитета. В то же время низкий уровень носительства токсигенных коринебактерий дифтерии среди населения в настоящее время не обеспечивает естественной иммунизации лиц старших возрастных групп.

При специальном изучении иммунологической структуры населения, проведенном в 1981 году установлено, что от 40 до 70% взрослых лиц не имеют защитных титров дифтерийного антитоксина.

Сложившаяся эпидобстановка в республике требует постоянного внимания к дифтерийной инфекции со стороны руководителей здравоохранения, специалистов лечпрофучреждений и необходимости введения системы эпидемиологического надзора, главной целью которого является: оценка динамики эпидемического процесса; достижение стабильно низких показателей заболеваемости на всех административных территориях РСФСР и предупреждение летальных исходов.

Система эпидемиологического надзора включает:

1. Наблюдение за иммунологической структурой населения;

2. Слежение за циркуляцией возбудителя;

5. Раннее выявление дифтерии;

4. Эпидемиологический анализ.

Результаты обобщения полученных данных должны быть использованы как основа для оперативного проведения целенаправленных профилактических и противоэпидемических мероприятий, а также для прогнозирования дальнейшего развития эпидпроцесса дифтерийной инфекции на конкретной территории.

Эпидемиологический надзор в городах и сельских районах осуществляют врачи эпидемиологи, педиатры и инфекционисты под руководством областных, краевых, республиканских санэпидстанций. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г. Н. Габричевского совместно с эпидемиологическим отделом Главного санэпидуправления Минздрава РСФСР осуществляет общее научно — методическое руководство этой работой в РСФСР.

Ежегодную информацию о результатах эпиднадзора следует представлять в Главное санэпидуправление к 1 февраля.

1. НАБЛЮДЕНИЕ ЗА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРОЙ НАСЕЛЕНИЯ

Эту работу следует начинать с оценки состояния привитости каждой возрастной группы по имеющимся документальным данным. В ходе проверки отбирается и анализируется не менее 100 историй развития детей (ф. 112) или карт учета профилактических прививок (ф.63) каждой возрастной группы. Для характеристики привитости ребенка следует руководствоваться терминами «привит по схеме» или «привит вне схемы» (в недекретированном возрасте, пропуск одной из возрастных ревакцинаций, нарушение первичного вакцинального комплекса и т.д.). В каждой возрастной группе необходимо принимать во внимание общий процент охвата детей прививками. Сюда включаются данные не только о детях с законченным курсом вакцинаций и ревакцинаций, но и о находящихся в стадии вакцинации. Общий процент охвата детей прививками должен составлять не менее 95-97%.

Контингенты детей	% охвата прививками	оценка охвата прививками
дети в возрасте до одного	80-85	достаточный
года, получившие законченную вакцинацию	70-79 менее 70	удовлетворительный недостаточный
дети в возрасте трех лет	80-85	достаточный
(3 года, 11 мес., 29 дней), получившие первичную ревакцинацию	70-79 менее 70	удовлетворительный недостаточный
дети в возрасте 7 лет,	95-96	достаточный
получившие 1-ю возрастную ревакцинацию	90-94 менее 90	удовлетворительный недостаточный
дети в возрасте 12 лет,	95-96	достаточный
получившие 2-ю возрастную ревакцинацию	90-94 менее 90	удовлетворительный недостаточный

Эпидемиолог и педиатр определяют причины, из-за которых дети не были привиты и принимают необходимые меры.

Наиболее простым методом определения напряженности поствакцинального иммунитета является реакция пассивной гемагглютинации с сывороткой крови, взятой из пальца обследуемых детей или взрослых <*>.

---

<*> Производственный выпуск антитоксического диагностикума Ленинградским НИИЭМ им.Пастера предполагается в 1983 г. После внедрения этого препарата в практику здравоохранения реакция Шика будет полностью заменена на РПГА, методика постановки которой будет разослана дополнительно.

В настоящее время для определения противодифтерийного иммунитета у детского населения следует пользоваться реакцией Шика, ее ставят детям, получившим законченную вакцинацию и не менее одной ревакцинации. С этой целью 1 раз в 5 лет следует проводить обследование выборочных групп детского населения в возрасте от 4-х до 14-ти лет.

На первом этапе методом случайной выборки отбирают 9 районов, в каждом из них в течение года обследуют 200 детей одной возрастной группы, в том числе 60-70% проживающих в сельской местности. Группировку случайно выбранных контингентов производят таким образом: в первом, втором и третьем районах — по 200 детей соответственно 4, 5, 6 лет (до проведения первой возрастной ревакцинации), затем в четвертом, пятом, шестом и седьмом районах — по 200 детей соответственно 8, 9, 10 и 11 лет (до проведения второй возрастной ревакцинации). Детей 7 и 12 лет с помощью реакции Шика не обследуют, так как в 6 и 11 лет им была сделана прививка. И, наконец, в восьмом и девятом районах — по 200 детей соответственно 13 и 14 лет.

Таким образом, с помощью реакции Шика на первом этапе должно быть обследовано 1.800 человек.

Реакцию Шика целесообразно ставить в школах и дошкольных детских учреждениях. При этом следует учесть, что в группах детских учреждений и в классах школ находятся дети разных возрастов (например, в 1 классе могут быть дети 7 и 8 лет, во 2-ом — 8 и 9 лет и т.д.). Поэтому в одном районе можно поставить 100 реакций Шика детям 8 лет и 100 — детям 9 лет. Аналогичные возрастные группы взять в другом районе.

Общее суждение о привитости детей в области (крае, АССР) будет складываться при расчете на 200 детей данного возраста. Полученные результаты реакции Шика у детей соответствующих возрастных групп в девяти районах области достаточно репрезентативны для характеристики состояния иммунитета у детей.

Если в результате обследования окажется, что реакция Шика положительная (без учета сомнительных) менее чем у 5% обследованных в данных возрастных группах во всех районах, то обследование заканчивается и следует считать, что уровень иммунитета в отношении дифтерии достаточен.

Если в одном из районов в какой — либо возрастной группе число лиц с положительной реакцией Шика окажется 6% и выше, то в данном районе следует провести второй этап обследования: постановку реакции Шика у детей остальных восьми возрастных групп. Например, в районе «А» при обследовании 200 детей в возрасте восьми лет реакция Шика оказалась положительной у 10% обследованных. Это означает, что следует поставить реакцию Шика детям 4, 5, 9, 10, 11, 13 и 14 лет (по 200 человек каждого возраста). Если в других возрастных группах данного района число лиц с положительной реакцией Шика окажется в пределах 6-15%, необходимо реакцию Шика поставить всем детям.

Дети с положительной реакцией Шика должны быть привиты в соответствии с приказом Минздрава СССР № 580 от 24.06.74.

Учет реакции рекомендуется проводить через 96 часов (на 4-е сутки). При сомнительном результате реакции Шика дополнительная иммунизация ребенка не проводится.

Результаты реакции обобщаются по форме, предложенной настоящими рекомендациями (приложение № 2).

Наблюдение за иммунологической структурой взрослых предполагается проводить при внедрении в широкую практику РПГА или в настоящее время в комплексе с институтами, имеющими лабораторные диагностикумы. При этом исследование проводится также методом случайной выборки — по 100 человек каждой группы повышенного риска инфицирования (см. стр.1).

Материалы об иммунной структуре детей и взрослых анализируются раздельно. Полученные данные позволяют составить представление об иммунологическом статусе взрослого населения. Число неиммунных взрослых при благоприятной ситуации не должно превышать 30%.

На основании практического опыта и анализа деятельности различных учреждений здравоохранения предлагаются следующие критерии оценки прививочной работы медицинских учреждений (таблица № 1).

2. СЛЕЖЕНИЕ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ

В целях максимального и своевременного выявления источника инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерий дифтерии необходимо проводить бактериологическое обследование следующих контингентов:

1. с диагностической целью: больных дифтерией; детей и взрослых с острыми воспалительными явлениями в носоглотке при подозрении на дифтерийную этиологию заболевания (ринит, ларинготрахеит, ларингит, круп); больных ангинами с патологическим выпотом на миндалинах, всех больных с диагнозом «перитонзиллярный абсцесс»;

2. по эпидемическим показаниям: реконвалесцентов дифтерии (дети и взрослые) перед допуском их в коллективы (однократно); носителей токсигенных коринебактерий дифтерии, посещающих дошкольные детские учреждения (по окончании санации однократно); детей и взрослых, бывших в общении с источником инфекции (однократно);

3. с профилактической целью: лиц, вновь поступающих в детские дома, лесные школы, специальные учреждения для детей с поражением центральной нервной системы, детские и взрослые психоневрологические стационары, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией (однократно).

Бактериологическое обследование с целью эпидемиологического надзора желательно совместить с профилактическим осмотром обследуемых ЛОР-специалистами. При этом, прежде всего, материал для исследования должен быть взят у лиц с хроническими изменениями в носоглотке.

При появлении заболеваний дифтерией или очагов носительства токсигенных коринебактерий дифтерии на данной территории помимо обследований по эпидемическим показаниям, в зависимости от конкретной ситуации, проводится бактериологическое обследование контингентов повышенного риска инфицирования: детей и взрослых, проживающих в общежитиях, преподавателей школ, ГПТУ, учащихся школ — интернатов, студентов высших и средних учебных заведений, работников сферы обслуживания населения, детских дошкольных, медицинских учреждений.

Ориентировочным критерием качества бактериологических исследований на дифтерию является выделение из материалов, поступивших на исследование в лабораторию, не только токсигенных и нетоксигенных коринебактерий дифтерии, но и других представителей рода коринебактерий (дифтероидов и палочек Гофмана).

Учитывая неоднородность коринебактерий дифтерии в практических лабораториях следует определять токсигенность выделенных культур.

В целях повышения высеваемости и ускорения выдачи окончательного результата анализа (токсигенность) необходимо проводить постоянный контроль за качеством всех поступающих серий коммерческого питательного агара, а также ингредиентов, используемых для приготовления сред («Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции» — методические рекомендации Минздрава РСФСР от 10.04.80).

В случаях сомнения при определении токсигенности в областных, краевых, республиканских лабораториях выделенные штаммы коринебактерий направляются спецпочтой (в пробирке на сывороточном агаре) в лабораторию дифтерии эпидотдела Московского НИИ им.Габричевского с приложением характеристики культуры по форме (приложение № 4) <*>.

Результаты идентификации сообщаются институтом на места в течение месяца.

---

<*> Адрес Московского НИИЭМ им.Габричевского — 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

При подведении итогов работы по изучению циркуляции возбудителя необходимо проанализировать распространенность носительства токсигенных коринебактерий на территории по возрастным, профессиональным группам, а также характеристику очаговости и сезонности.

3. РАННЕЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ДИФТЕРИЕЙ

В настоящее время при отсутствии практического опыта в распознавании дифтерии необходимо ежегодно проводить краткосрочные семинары по диагностике, клинике и лечению дифтерии для врачей различного профиля и средних медицинских работников.

В целях раннего выявления дифтерии осуществляется активное наблюдение за больными ангиной с патологическими наложениями на миндалинах (включая паратонзиллярные абсцессы) в течение не менее 3-х дней от начала заболевания, проводится однократное бактериологическое обследование на дифтерию. Материал для исследования берется при первом обращении больного к врачам или медсестрой на дому, на фильтре или на поликлиническом приеме до начала лечения антибиотиками.

В связи с регистрацией в последнее время случаев изолированного дифтерийного крупа у детей и взрослых необходимо проводить раннее бактериологическое обследование на дифтерию больных острым ларинготрахеитом.

В наблюдении за больными ангиной и с подозрением на дифтерию должна соблюдаться четкая преемственность на всех этапах от момента обращения до госпитализации (ФАП, ФП, скорая и неотложная помощь, поликлиника, стационар). Медицинские работники скорой и неотложной помощи, отоларингологи и цеховые врачи обязаны передавать активные вызовы участковым педиатрам и терапевтам. В направлениях на госпитализацию необходимо указывать первоначальные симптомы заболевания, лечение, сведения о проведенных профилактических прививках и эпидемиологические данные.

Появление заболеваний дифтерией в данной местности является основанием для обеспечения провизорной госпитализации больных тяжелыми ангинами, больных ангиной из закрытых детских учреждений и общежитий, из неблагоприятных бытовых условий, из очагов дифтерийной инфекции.

Особое внимание требуют к себе непривитые дети. Они нуждаются в активном наблюдении при возникновении у них любого острого заболевания верхних дыхательных путей. В случае заболевания ангиной с наложениями или крупом следует принять меры к их ранней госпитализации, либо обеспечить им консультативную помощь квалифицированного врача — инфекциониста или педиатра.

Больные дифтерией или с подозрением на нее должны немедленно госпитализироваться в боксы или отдельные палаты инфекционных отделений больниц.

Ранняя диагностика токсической или распространенной формы дифтерии, а также дифтерийного крупа основывается только на клинической симптоматике, поэтому очень важно при подозрении на дифтерию определить форму и степень тяжести заболевания. Если имеется подозрение на токсическую форму дифтерии, лечение противодифтерийной сывороткой нужно начинать немедленно в соответствии со степенью тяжести заболевания. Противодифтерийная сыворотка вводится в стационаре. При невозможности быстрой транспортировки больного тяжелой формой дифтерии в стационар в исключительных случаях введение противодифтерийной сыворотки начинают на ФАП (ФП) или на дому со строгим соблюдением всех необходимых правил.

Бактериологическое обследование больного на дифтерию в стационаре проводится в день поступления и затем в течение 2-х дней подряд, на протяжении которых нецелесообразно назначать антибиотики тетрациклинового ряда, левомицетин или эритромицин.

При типичной клинической картине отсутствие бактериологического подтверждения не является основанием для отмены диагноза, при этом следует учитывать эффект сывороточной терапии (если она применялась). При сомнительной клинической картине первоначальный диагноз дифтерии (или подозрении на нее) может быть отменен при получении трехкратных отрицательных результатов бактериологических исследований и отсутствии характерных осложнений.

В очаге дифтерийной инфекции заболевание ангиной с наложениями рассматривается как подозрение на дифтерию. Высев токсигенных коринебактерий дифтерии у таких больных подтверждает диагноз. Высев нетоксигенных коринебактерий дифтерии при типичной клинической картине заболевания не является основанием для отмены диагноза и расценивается как сопутствующее носительство, при сомнительной клинической картине — подтверждает возможность отмены диагноза.

Возникновение характерных для дифтерии осложнений (миокардит, токсический нефроз, парез мягкого неба, полирадикулоневрит) у больных, перенесших ангину, является основанием для проведения ретроспективной дифференциальной диагностики дифтерии. Диагностика дифтерии в периоде осложнений — результат грубых диагностических ошибок, что свидетельствует о низком уровне клинического и бактериологического выявления больных дифтерией.

Диагноз «ангина с сопутствующим носительством токсигенных коринебактерий» на практике устанавливаться не должен. Он допускается только при проведении специальных исследований, когда заболевание дифтерией исключается на основании комплексного обследования больного: клинического наблюдения специалистов, квалифицированного бактериологического обследования, определения дифтерийного антитоксина количественным методом Иенсена.

Носители токсигенных коринебактерий дифтерии подлежат госпитализации в инфекционные отделения. При поступлении у них берут 2 посева на дифтерию с интервалом в 1 день. В санации носителей основное значение имеет выявление и лечение хронической патологии лорорганов, которая является одним из факторов, способствующих длительному бактериовыделению. С этой целью все бактерионосители должны быть консультированы отоларингологом.

Антибиотики (тетрациклин, олететрин, эритромицин, левомицетин), назначаются по усмотрению лечащего врача и только после повторного высева токсигенных коринебактерий дифтерии. Курс лечения продолжается от 5 до 7 дней, дозы возрастные. Кроме того, проводится симптоматическая и общеукрепляющая терапия.

Контрольное бактериологическое обследование на дифтерию проводится через три дня после отмены антибиотиков — два анализа через день. Выписка осуществляется при отрицательных результатах бактериологического обследования. Лечение хронической патологии лорорганов при необходимости проводят по месту жительства, о чем следует указать в справке при выписке из стационара.

При повторном и длительном высеве лечение продолжается в стационаре (повторное курсовое лечение антибиотиков, физиотерапия, активное лечение хронической патологии лорорганов вплоть до тонзиллэктомии).

Носители нетоксигенных коринебактерий дифтерии не подлежат госпитализации и лечению антибиотиками. Им проводится консультация отоларинголога с целью диагностики и лечения хронической патологии лорорганов по месту жительства.

Для оценки работы по раннему выявлению больных дифтерией специалисты лечебной сети (педиатр, терапевт) проводят анализ:

• полноты охвата больных ангинами активным наблюдением и бактериологическим обследованием на дифтерию;
• сроков обращения, госпитализации и введения противодифтерийной сыворотки больным дифтерией;
• структуры заболеваемости по формам, частоты и тяжести осложнений, причин летальных исходов;
• причины заболеваний дифтерией привитых детей, особенно развития тяжелых форм, а тем более летальных исходов у привитых детей.

    Примечание: В спорных  или  сомнительных   случаях   сыворотку
                крови, полученную  в  первые дни заболевания можно
                направлять  в  лабораторию   дифтерии   эпидотдела
                Московского  НИИЭМ  им.Габричевского  с  указанием
                паспортных данных больного,  проведенных прививок,
                срока    заболевания,    цели    исследования    и

            предварительного диагноза.
            Метод количественного  определения  антитоксина  в
            крови по Иенсену является диагностическим тестом в
            установлении диагноза дифтерии.

                Исследование крови проводят в первые 3-5  дней  от
                начала  заболевания до введения противодифтерийной
                сыворотки.  Низкий  уровень  антитоксина  или  его
                отсутствие   (<=   0,03   МЕ/МЛ)   в   эти   сроки
                подтверждает диагноз дифтерии;  титры  антитоксина
                от  0,03  до  0,5 МЕ/МЛ не могут обосновать отмену
                или установление диагноза дифтерии;  титры  0,5  -
                1,0  МЕ/МЛ  и выше свидетельствуют против диагноза
                дифтерии     в     пользу     бактерионосительства

(см. приложение № 3).

4. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ОБОБЩЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

Результаты проведенного надзора за дифтерийной инфекцией обобщаются и анализируются врачами эпидемиологами.

Эпидемиологическую ситуацию следует считать благополучной, а проведенные мероприятия эффективными, если обследуемые контингенты характеризуются высоким уровнем иммунитета.

Обязательным условием оценки эпидситуации как благоприятной является отсутствие летальных исходов дифтерии за последние 5 лет. Количество выявленных носителей токсигенных коринебактерий от обследованных лиц групп повышенного риска инфицирования является единичным. Указанные сведения принимаются во внимание при хорошем качестве работы бактериологических лабораторий и полноценной клинической диагностики.

Неблагоприятными прогностическими признаками являются:

1. Низкий уровень противодифтерийного иммунитета (положительные реакции Шика — у 5 и более процентов от числа обследованных лиц прививаемых контингентов, а у взрослых — выше 30%).

2. Рост высеваемости токсигенных коринебактерий дифтерии в 2-3 раза по сравнению с предыдущим годом, наличие «вспышек» носительства в иммунных коллективах.

Косвенным критерием распространенности носительства токсигенных коринебактерий дифтерии может быть показатель частоты выявления высоких титров дифтерийного антитоксина в сыворотках крови непрививаемых контингентов.

3. Регистрация групповых или отдельных заболеваний дифтерией, наличие летальных исходов.

Дополнительными показателями возможного неблагополучия может служить смена биовара коринебактерий дифтерии (гравис, митис).

При выявлении неблагополучных показателей иммунитета среди детей и взрослых и росте числа носителей токсигенных коринебактерий дифтерии следует рассматривать данную территорию как потенциальный очаг инфекции. Необходимо улучшить проведение профилактических прививок детям, а также провести однократную иммунизацию АДС-м анатоксином среди взрослых контингентов повышенного риска инфицирования (см. стр.1).

При благополучных показателях иммунитета у детей и росте носительства токсигенных коринебактерий принимаются меры по повышению внимания врачей к ранней диагностике дифтерии.

При регистрации случаев заболевания дифтерией проводится тщательная работа по выявлению источников инфекции, определению границ очага, особое внимание обращается на причины заболевания привитых детей. Наличие летальных исходов и тяжелых форм заболевания является показателем неудовлетворительной работы по выявлению, диагностике и лечению заболеваний дифтерией. Разбор каждого случая дифтерии, оценку диагностики и лечения необходимо осуществлять в сопоставлении с очаговостью и своевременностью проведения противоэпидемических мероприятий комиссионно с участием главных специалистов.

Углубленный поиск эпидемиологических связей позволит определить тактику работы эпидемиолога в каждом конкретном случае.

Эффективность проведения профилактической и противоэпидемической работы выразится в отсутствии летальных исходов и стойком снижении заболеваемости.

---

Методические рекомендации составлены сотрудниками эпидемиологического и клинического отделов Московского научно — исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР имени Г. Н. Габричевского (к.м.н. Корженкова М.П., к.м.н. Максимова Н.М., к.м.н. Маркина С.С., к.м.н. Петрова М.С., д.м.н. Сухорукова Н.Л., д.м.н. Фаворова Л.А., Черкасова В.В.), эпидемиологического отдела Главного санитарно — эпидемиологического управления Минздрава РСФСР (к.м.н. Иванова Л.М., Гимпелевич С.Д., Тымчаковская И.М.), Омского государственного медицинского института (к.м.н. Долматов В.В.).

Эпидемиологическая эффективность иммунизации зависит от полного и своевременного охвата прививками против дифтерии детского населения. С этой целью один — два раза в год проводится перепись детей в возрасте до 14 лет включительно. Перепись на участке осуществляется медицинскими сестрами или фельдшерами при подворных обходах. В журнал участка (врачебного, ФАП, ФП) вносятся следующие сведения о ребенке: фамилия, имя, отчество, адрес, дата рождения (детские ясли, сад, школа, школа — интернат).

Учет детей в детских дошкольных учреждениях, школах и школах — интернатах, расположенных на территории обслуживания лечебно — профилактического учреждения, проводится однократно осенью.

В период между переписями в журнал медицинского участка вносятся сведения о вновь прибывших детях и снимаются с учета выбывшие (временный отъезд на срок не более одного года не является поводом для снятия с учета). Эти данные уточняются при посещении медицинскими работниками новорожденного или вновь прибывшего ребенка, при патронажных обходах и при обслуживании больных детей на дому.

По окончании переписи списки детей сверяются с картами профилактических прививок (форма 63), с историями развития детей (форма 112) и индивидуальными картами развития ребенка (форма 26), уточняются расхождения и на вновь выявленных детей заполняется соответствующая документация.

Медицинская сестра участка или сестра — картотетчица поликлиники ежемесячно получает сведения о профилактических прививках, проведенных детям, посещающим дошкольные детские учреждения, школы, школы — интернаты.

Годовой план профилактических прививок составляется на основании полного учета детских контингентов и проведенных ранее прививок. В план включаются прививки детям, посещающим и непосещающим детские учреждения, а также учащимся школ, школ — интернатов, расположенных на территории обслуживания данного лечебно — профилактического учреждения.

В детских поликлиниках план прививок составляет участковый врач совместно с медицинской сестрой — картотетчицей на основании указанных выше форм (112, 63, 26). Сводный план лечебно — профилактического учреждения передается в СЭС.

В сельской местности при работе по принципу централизованных картотек план прививок составляет картотетчица при участии врача участковой больницы или медицинского работника ФАП, ФП. При отсутствии централизованной прививочной картотеки планирование проводит медицинский персонал сельских врачебных участков, фельдшерско — акушерских и фельдшерских пунктов под контролем педиатра. Планы представляются в участковую или центральную райбольницу; последняя составляет план по району и передает в СЭС.

При проверке планов прививок эпидемиолог использует данные о рождаемости, численном составе детского населения и отчеты о прививках, проведенных в предыдущем году. В конце года санэпидстанцией в план прививок вносятся коррективы предварительно согласовав их с руководителями лечебно — профилактических учреждений.

При составлении плана вакцинации следует исходить из данных о количестве детей, родившихся в четвертом квартале предыдущего года и ориентировочном числе новорожденных за девять месяцев планируемого года:

а) число детей, родившихся в четвертом квартале предыдущего года устанавливается на основании сведений, получаемых лечебно — профилактическими учреждениями из родильных домов, а также из ЗАГСов;

б) сведения о числе родов, предстоящих в течение девяти месяцев планируемого года определяется средними данными о числе родившихся за аналогичный период в предшествующие три года. Кроме того, в план вакцинации включается число непривитых детей в возрасте до 14 лет, не имеющих постоянных противопоказаний к проведению прививок.

Планирование первичной ревакцинации; в число лиц, подлежащих ревакцинации включаются:

а) дети с законченным курсом вакцинации;

б) все вакцинированные дети, не получившие своевременно первичную ревакцинацию, независимо от сроков, прошедших после законченной вакцинации.

    Примечание: если после второй вакцинации прошло  более  одного
                года,   ребенку   следует  планировать  проведение

            первичной ревакцинации.

Первой возрастной ревакцинации подлежат:

а) дети 6 лет, получившие первичную ревакцинацию;

б) дети старше 6 лет, у которых с момента первичной ревакцинации прошло более 5 лет.

В число детей, подлежащих второй ревакцинации включаются:

а) дети 11 лет, получившие первую возрастную ревакцинацию в 6 лет;

б) дети старше 11 лет (до 14 лет 11 мес. и 29 дн.), получившие первую возрастную ревакцинацию не менее 4-5 лет назад.

Постоянные медицинские противопоказания устанавливаются комиссией с участием заведующего отделением, соответствующего специалиста и участкового врача с обязательным оформлением эпикриза (приказ МЗ СССР № 580 от 24.06.74, приложение № 1, глава 3). Временные длительные медицинские противопоказания оформляются в истории развития ребенка участковым врачом и заведующим отделением и пересматриваются по истечении их сроков.

Учетно — оперативными документами для регистрации профилактических прививок и иммунологических проб являются карты профилактических прививок (форма 63 и форма 63-село в сельских районах не переведенных на централизованные формы прививок). Они заполняются на всех детей в возрасте до 14 лет включительно, проживающих в районах обслуживания лечебно — профилактического учреждения, в том числе и на детей, посещающих детские учреждения и школы, независимо от места нахождения этих учреждений. Карты учета профилактических прививок (форма 63) раскладываются по отдельным врачебным участкам. На каждом участке карты формы 63 ставят по предстоящим срокам прививок (по месяцам) и видам прививок на всех детей, в том числе и на посещающих детские учреждения, находящиеся на территории обслуживания других поликлиник. На детей, проживающих на участке и посещающих детские учреждения на территории обслуживания данного лечебно — профилактического учреждения карты формы 63 раскладываются по детским учреждениям (детские комбинаты, школы, школы — интернаты).

Ежемесячно медицинский работник, ведающий картотекой, пересматривает карты всех детей, подлежащих прививкам, и выписывает их в «Дневник записи работы на дому участковой (патронажной) медсестры» или в ее рабочую тетрадь на данный месяц.

Проведенные противодифтерийные прививки записываются медицинским работником, проводящим прививку, в историю развития ребенка (ф.112). В карту (ф.63) эти данные вносятся ответственным за картотеку лицом.

Контроль за правильностью ведения картотеки и полнотой охвата детей прививками возлагается в городе на заведующего отделением поликлиники, в сельской местности — на районного педиатра, которые обязаны систематически проверять:

1. Своевременность проведения прививок.

2. Обоснованность временных и постоянных медицинских противопоказаний к проведению прививок.

3. Получение сведений о сделанных прививках детям, проживающим на территории данной поликлиники, но посещающих детские учреждения, находящиеся под наблюдением других поликлиник.

4. Запись участкового врача об осмотре ребенка и термометрирование перед прививкой.

5. Регистрацию прививок в учетных картах и историях развития с указанием даты прививки, названия препарата, его дозы и серии.

Метод количественного определения дифтерийного антитоксина в крови по Иенсену является диагностическим тестом в установлении диагноза дифтерии (в ряде случаев ретроспективно).

Уточнение диагноза дифтерии проводится у больных с клиническим подозрением на дифтерию; ангиной с патологическим выпотом и предварительным результатом о высеве коринебактерий; ангиной с патологическим выпотом из очага дифтерийной инфекции.

Исследование этих групп больных позволит избежать гипердиагностику дифтерийной инфекции.

Кровь на исследование забирать при поступлении в стационар до введения противодифтерийной сыворотки (в первые 3-5 дней от начала заболевания) в количестве 1,0 мл.

Низкий уровень антитоксина или его отсутствие (0,03 МЕ/мл) в эти сроки является доводом в пользу дифтерии. Титры 0,5-1,0 МЕ/мл и выше свидетельствуют против дифтерии в пользу бактерионосительства.

При обследовании в более поздние сроки больных с подозрением на дифтерию, не получивших противодифтерийную сыворотку, низкие титры дифтерийного антитоксина свидетельствуют в пользу дифтерии, тогда как высокие титры не могут быть доводом против этого заболевания.

Сыворотку, запаянную в ампулу (0,5-0,7 мл), направлять в дифтерийную лабораторию эпидотдела Московского НИИЭМ им.Габричевского (125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, дом 10).

Направление должно содержать данные: фамилию, имя, отчество, возраст (дату рождения для детей); прививки против дифтерии (для детей и подростков), адрес, место работы, учебы (детское учреждение), клинический диагноз (указать форму заболевания), дата заболевания, дата и результаты бактериологических обследований, дата забора крови, противодифтерийная сыворотка введена, не введена, дата введения противодифтерийной сыворотки.

ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ В ОЧАГЕ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

В результате плановой активной иммунизации детского населения заболеваемость дифтерией в нашей стране резко снижена; в течение последнего десятилетия (1973-1982 гг.) в подавляющем большинстве административных территорий регистрируются единичные случаи этой инфекционной формы.

Однако, при продолжающейся циркуляции дифтерийного микроба, сохраняется потенциальная возможность возникновения единичных или групповых заболеваний среди лиц, не обладающих достаточным уровнем антитоксического иммунитета, обеспечивающего защиту от заболевания. Причинами, способствующими возникновению манифестных форм дифтерии, в настоящее время могут явиться:

• ослабление плановой профилактической работы по активной иммунизации детского населения;
• позднее начало вакцинации;
• значительное количество непривитых детей с поражением центральной нервной системы и детей с аллергической реактивностью из-за недостаточного использования щадящих методов иммунизации;
• временное снижение уровня антитоксического иммунитета после перенесенных инфекционных заболеваний;
• вспышки носительства токсигенных коринебактерий в организованных коллективах среди привитых детей.

Следует учесть, что в настоящее время, в период снижения естественной иммунизации увеличилось количество случаев заболевания дифтерией лиц старших возрастов.

Задачей санэпидслужбы при выявлении дифтерийной инфекции является своевременная локализация и ликвидация очага.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ

При получении экстренного извещения о заразном больном <*> врач эпидемиолог проводит обследование в очаге инфекции, которым может быть квартира, общежитие, ясли, школа, профессионально — техническое училище (ПТУ), предприятие, населенный пункт сельской местности и т.д.

---

<*> больном дифтерией, больном с подозрением на эту инфекцию, носителе токсигенных коринебактерий.

Эпидемиологическое обследование очага предусматривает:

1. Установление источника инфекции.

2. Выявление лиц, контактировавших с больными и определение границ очага.

3. Изучение прививочного анамнеза лиц, контактировавших с заболевшим по месту жительства и учебы, в детском учреждении, на работе, а также состояния активной иммунизации в коллективе.

4. Выявление причин, которые могут способствовать распространению заболеваний в очаге.

На основании анализа полученных сведений врач эпидемиолог составляет план противоэпидемических мероприятий по ликвидации очага инфекции.

УСТАНОВЛЕНИЕ ИСТОЧНИКА ИНФЕКЦИИ

При опросе больного и соприкасавшихся с ним лиц выясняют его контакты с больными дифтерией, ангинами; пребывание в местностях, где были заболевания детей или взрослых (не менее, чем за последний месяц).

В городских поликлиниках, на селе, в поликлинических отделениях ЦРБ, участковых больницах, на ФАП и ФП проверяют (не менее, чем за месяц до заболевания дифтерией) истории развития детей, истории болезни взрослых, больных ангинами, журналы вызовов на дом, журналы амбулаторного приема больных.

В детских учреждениях, ПТУ, техникумах, на производстве за месяц до заболевания дифтерией проверяют табель посещаемости, медицинские справки на отсутствовавших, журнал больных в изоляторе, больничные листы персонала и т.д.

Лицам с подозрением на дифтерию, выявленным при проверке указанной документации, назначаются осмотры специалистами (ЛОР-врачом, инфекционистом) с обязательным бактериологическим обследованием.

Если эпидемиологическим обследованием установлено, что заражение произошло вне данной местности, об этом должно быть срочно сообщено органам здравоохранения, откуда прибыл больной, для принятия там соответствующих мер.

ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИЦ, КОНТАКТИРОВАВШИХ С БОЛЬНЫМИ И УСТАНОВЛЕНИЕ ГРАНИЦ ОЧАГА

Предусматривает выявление всех лиц, соприкасавшихся с больным по месту жительства, учебы, работы, в детском учреждении и назначается бактериологическое их обследование, медицинское наблюдение в течение 7 дней с момента госпитализации больного.

С целью проведения полного объема противоэпидемических мероприятий эпидемиологом определяются границы очага на основании анализа полученных данных о контактировавших с заболевшим. Учитывая наличие легких и стертых форм дифтерии, эпидемиолог должен предусмотреть расширение границ очага.

При выявлении случая заболевания должны быть установлены связи: в комнате, квартире, подъезде, общежитии и т.д.; в организованных коллективах детей и подростков — в целом по учреждению; в коллективах взрослых (студентов, служащих, рабочих и др.) в зависимости от местных условий; общежитие, служебная комната, цех и т.д. должны быть также учтены родственные и дружеские связи. К определению контактных в границах очага следует привлекать местных медицинских работников и администрацию.

Окончательные границы очага определяются после получения всех сведений и результатов бактериологического обследования.

СОСТАВЛЕНИЕ ПЛАНА ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ПО ЛИКВИДАЦИИ ОЧАГА ИНФЕКЦИЙ

На основании анализа полученных данных о возможном источнике инфекции, состоянии активной иммунизации, определении границ очага — эпидемиологи составляют план противоэпидемических мероприятий по ликвидации очага инфекции. К реализации плана, который составляется конкретно по датам, привлекается санэпидслужба, лечебная сеть. План противоэпидемических мероприятий утверждается горздравотделом (райздравотделом); главным врачом района — в сельской местности. Указанный план включает следующие разделы:

Предусматривают: а) выделение дополнительного медперсонала (врачей и средних медицинских работников) для проведения подворных обходов с целью выявления больных, а также для постановки и учета реакции Шика (реакции пассивной гемагглютинации) и проведения активной иммунизации;

б) выделение дополнительных коек для провизорной госпитализации больных ангинами и бактерионосителей;

в) определение объема работы бактериологической лаборатории, обеспечение своевременного забора и доставки материала для исследования;

г) выделение дополнительного транспорта (при необходимости). Необходимо указать, что для своевременной ликвидации очага инфекции все мероприятия, предусмотренные планом, должны проводится без установления какой — либо очередности — одновременно.

Раннее выявление и госпитализация больных дифтерией и носителей токсигенных коринебактерий дифтерии имеет особо важное значение для предупреждения дальнейшего распространения инфекции среди лиц, не обладающих иммунитетом к дифтерии.

В связи с этим после выявления больного дифтерией необходимо проводить:

1. Выявление и госпитализацию больных дифтерией, подозрительных на эту инфекцию, больных ангинами и носителей токсигенных коринебактерий. С этой целью по месту жительства в течение 7 дней с момента госпитализации больного или носителя проводят ежедневный осмотр контактных. В сельском населенном пункте при повторном случае заболевания назначаются ежедневные обходы силами средних медицинских работников под руководством врача, для выявления всех температурящих больных и их госпитализации (провизорная госпитализация).

В организованном коллективе (детском учреждении, школе, ПТУ и др.) после последнего посещения заболевшим в течение 7 дней проводится ежедневная термотерапия и врачебный осмотр учащихся и персонала; с целью выявления больных дифтерией носа, выявления и лечения больных хроническим тонзиллитом в стадии обострения обеспечивается обязательный осмотр врачом отоларингологом.

2. Бактериологическое обследование контактировавших с больным дифтерией и мероприятия в отношении выявленных бактерионосителей.

После выявления больного или носителя токсигенных коринебактерий дифтерии немедленно проводят бактериологическое обследование детей, подростков и взрослых контактных по месту жительства и в организованном коллективе (одномоментно в течение одного дня).

В случае выявления после первого бактериологического обследования носителей токсигенных коринебактерий, одномоментные обследования продолжают до прекращения выявления носителей.

Бактерионосители атоксигенных дифтерийных микробов из коллектива не удаляются. Все выявленные носители токсигенных коринебактерий госпитализируются для дифференциальной диагностики с легкими случаями дифтерии и их лечения.

После создания прочной иммунной прослойки в коллективе вопрос о допуске бактерионосителя с затяжным носительством решается комиссионно с участием эпидемиолога, педиатра и отоларинголога при условии проведения следующих мероприятий, предусмотренных приказом МЗ СССР № 580 от 26 июня 1974 года:

а) еженедельного бактериологического обследования (с проверкой токсигенности выделенного штамма) до получения двух отрицательных результатов исследований мазков из зева и носа;

б) продолжения лечения воспалительных явлений носоглотки;

в) за коллективом, куда допущен носитель, устанавливается наблюдение эпидемиолога, периодически проводятся медицинские осмотры с целью выявления детей с острыми воспалительными процессами в носоглотке, лечение их и обследование на носительство дифтерийных бактерий. В период пребывания в коллективе носителей токсигенных бактерий вновь принимаются только дети правильно привитые.

Мероприятия по разрыву механизма передачи инфекции сводятся к соблюдению текущей и заключительной дезинфекции. Большое внимание должно быть уделено санитарно — гигиеническим мероприятиям в организованных коллективах: уменьшению скученности, достаточной вентиляции, правильному питьевому режиму, правильной обработке посуды, и др.

Известно, что при ревакцинации — введение дифтерийного анатоксина стимулирует выработку в короткий срок напряженного иммунитета против дифтерии. Следовательно, для предупреждения распространения инфекции с целью повышения иммунной прослойки основное значение имеет проведение прививок, как детям так и взрослым.

Для иммунизации детей, у которых наступил срок очередной вакцинации или ревакцинации, применяют адсорбированную коклюшно — дифтерийно — столбнячную вакцину (АКДС-вакцину) или адсорбированный дифтерийно — столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигеном (АДС-М — анатоксин).

С целью выявления неиммунных детей в возрасте от 4-х до 14 лет применяют реакцию Шика. Эта проба ставится по эпидемическим показаниям не ранее чем через 8-10 месяцев после последней ревакцинации, при этом повторная постановка этой реакции разрешается не ранее чем через 1 год.

К постановке к учету реакции Шика допускается подготовленный средний медперсонал под постоянным контролем и в присутствии врача.

Постановке реакции Шика должно предшествовать составление списков детей от 4 до 14 лет (включительно), по следующей форме:

Список детей для постановки реакции Шика. ______________________________________ (детское учреждение, школа) ______________________ (населенный пункт) ______________ (область) токсин Шика серия _____________ срок годности ____________________ контроль _________________________________________________________ Реакцию Шика проводили под руководством врача ____________________

---

                     (фамилия, и.о.)

средними работниками _____________________________________________

---

                     (фамилия, и.о.)

NN п/п	Фамилия, И., О.	Возраст	Дата постановки р. Шика	Дата учета	Результаты
					в размерах	в крестах

При постановке реакции Шика следует строго следить за введением токсина в середину левого предплечья. Введение токсина в нижнюю часть предплечья не допускается. При неудачном введении токсина (под кожу, неполная доза и т.д.) повторное введение запрещается.

В списке делают отметку о неудачном введении токсина Шика, данный ребенок в разработке не учитывается.

Учет реакции проводят через 96 часов (на 4 сутки) после постановки реакции Шика. В отдельных случаях допускается проведение учета и в более поздние сроки (на 5-6 день). Учет реакции Шика проводят только при дневном освещении при рассеянном свете. Детей по списку вызывают в наиболее благоприятное по освещенности место. Запрещается проводить учет этой реакции у школьников, сидящих за партами.

Реакция Шика оценивается следующим образом:

а) Реакция Шика положительная, если на месте введения токсина появляется кожная реакция в виде гиперемии и инфильтрата.

Степень реакции обозначается:

«+» если краснота в диаметре 1-1,5 см.

«++» если диаметр красноты равен 1,5-3 см.

«+++» если он больше 3 см.

б) Реакция считается сомнительной (+/-), если краснота и инфильтрат выражены неясно или размер инфильтрата не превышает 0,5 см. в диаметре.

Результаты реакции Шика обобщаются по следующей форме:

Результаты реакции Шика

_______________________________(детское учреждение, школа)

---

_________________________ (населенный пункт) _____________________ ___________________________ (область) ____________________________ токсин Шика серия ________________ срок годности _________________ ______________________ контроль __________________________________ Реакция Шика проведена в период __________________________________

---

под руководством врача ___________________________________________ (фамилия и.о.) средними мед. работниками ________________________________________ (фамилия и.о.)

Возраст	Постановка р.Шика абс.ч.	Учтено р.Шика абс.ч.	В том числе положительных реакций
			всего		из них по интенсивности абс. ч.
			абс. ч.	%	+/- + ++ +++
4-5 лет
7-10 лет
12-14 лет

При анализе состояния иммунной прослойки в очаге инфекции процент неиммунных состоит из лиц с положительной и сомнительной реакциями к общему числу учтенных (а не поставленных) реакций.

После учета реакции Шика, детей со слабо положительной (+) реакцией в кратчайший срок (1-2 дня) следует привить АДС-М анатоксином однократно в дозе 0,5 мл; детей до 11 лет с интенсивно выраженной положительной реакцией (++ или +++) — двукратно дозой 0,5 мл с интервалом в 30 дней: детей 12-14 лет, независимо от интенсивности реакции — однократно в дозе 0,5 мл.

Данные о результатах реакции Шика и прививках по ее показаниям заносятся в карту профилактических прививок (форма № 63) и историю развития (форма № 112).

Учитывая, что на современном этапе изменялась возрастная структура дифтерии в сторону увеличения старших возрастных групп, в очагах инфекции следует проводить активную иммунизацию подростков и взрослых.

Лиц в возрасте 15 лет и старше (без ограничения возраста) с повышенным риском заражения в пределах очага: в общежитии, по месту работы, учебы, контактировавших с больным дифтерией или носителем токсигенных коринебактерий прививают (без предварительной постановки реакции Шика) адсорбированным дифтерийно — столбнячным анатоксином с уменьшенным содержанием антигенов (АДС-М анатоксин) однократно в дозе 0,5 мл.

Санитарное просвещение должно быть направлено на разъяснение детям и их родителям, подросткам, персоналу, педагогам о необходимости выполнения всех рекомендаций медицинских работников, включающих своевременное обращение и госпитализацию больных дифтерией, с подозрением на эту инфекцию, больных ангиной; направление соприкасающихся больных для постановки реакции Шика: проведения прививок и т.д.

При этом должны быть использованы все доступные методы: лекции, беседы в учреждениях и на дому, выступление по радио, привлечение к санитарно — просветительной работе по дифтерии всех медицинских работников.

Необходимо также широко использовать в работе по ликвидации очага дифтерии санитарный актив.

После ликвидации очага дифтерийной инфекции, необходимо в кратчайший срок проверить состояние активной иммунизации с целью исправления недостатков на всех врачебных и фельдшерских участках города и сельских районов данной административной территории.

В настоящих методических рекомендациях, составленных в соответствии с действующими инструктивными материалами, особое внимание обращено на правильность взятия и доставки материала в лаборатории, обязательное применение комплекса тестов для идентификации микроорганизмов рода коринебактерий, четкое соблюдение хода исследования (с использованием бинокулярного стереоскопического микроскопа) для своевременной и правильной выдачи ответа. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от чувствительности питательных сред к титрованному количеству возбудителя, поэтому дается описание схемы бактериологического контроля питательных сред и ингредиентов, рекомендуется определять содержание аминного азота в питательных основах, средах, бульонах и т.д.

---

<*> Составлены научными сотрудниками Московского научно — исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского Минздрава РСФСР (к.м.н. Мазурова И.К., д.м.н. Бочкова В.А., к.м.н. Маргулис И.Л., Головина Н.М., Хац Ю.А., Пчелинцева Т.Г. и бактериологом санэпидстанции г. Москвы, к.м.н. Сальникова Г.П.).

Бактериологические лаборатории республиканских, краевых, областных и городских (в городах с районным делением) СЭС являются методическим центром по бактериологической диагностике:

• организуют подготовку специалистов — бактериологов с высшим и средним медицинским образованием, руководствуясь «Программой семинара по бактериологической диагностике капельных инфекций» МЗ РСФСР от 23.08.1977 № 06Б/7А-4788, с обязательным использованием дифтерийных штаммов и постановкой контрольных задач;
• осуществляют контроль за работой лабораторий по бактериологической диагностике дифтерийной инфекции в районах и городах;
• контролируют правильность идентификации штаммов коринебактерий дифтерии, полученных из лабораторий районов, городов;
• проводят бактериологический контроль и контроль содержания аминного азота всех серий коммерческих питательных сред и ингредиентов, снабжают ими районные лаборатории.

Баклаборатории городских и районных СЭС:

• организуют постоянное получение крови для работы, используя местные ресурсы;
• обучают специалистов больниц и поликлиник (терапевтов, оториноларингологов, инфекционистов, хирургов, медицинских сестер процедурных кабинетов, инфекционных отделений и т.д.) правильному взятию и посеву исследуемого материала.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Взятие и доставка материала

Учитывая в настоящее время значительно меньшую обсемененность возбудителем даже при заболевании дифтерией, необходимо обратить внимание на тщательное и правильное взятие материала для исследования.

Для взятия материала используют сухие ватные тампоны, если посев будет произведен не позднее 2-3 часов после сбора материала. Предварительно каждый тампон помещают в отдельную пробирку и стерилизуют. Материал для исследования во всех случаях берут раздельными тампонами одновременно из зева и носа, а при необходимости и из других мест локализации патологического материала.

Слизь из зева берут натощак или не ранее чем через 2 часа после еды; у лиц, леченных антибиотиками — не ранее чем через 3 дня после окончания лечения, чтобы исключить бактериостатическое действие антибиотиков на возбудителя дифтерии. Язык фиксируют шпателем, при наличии патологического процесса материал забирают на границе здоровой и больной ткани.

Пробирки четко маркируют, скрепляют вместе от каждого лица и придают номер анализа. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, в поликлиниках или стационарах, когда посев будет произведен позже 2-3 часов от момента взятия материала, рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой, транспортировать в баклабораторию или помещать их в термостат на сутки. При использовании в этих случаях полужидкой среды обогащения материал следует забирать также сухим тампоном (на деревянной основе или на проволоке из нержавеющего материала). Опускают тампон в пробирку со средой обогащения и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Применение среды обогащения удлиняет срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.

Необходимо при транспортировке предохранять питательные среды от замораживания.

В случае необходимости исследований на коринебактерии дифтерии постмортально материал целесообразно брать только из полости носа, с миндалин и гортани. Учитывая, что дифтерия является токсико — септической инфекцией, нахождение возбудителя во внутренних органах крайне редко в отличие от других септических заболеваний.

Тампоны необходимо отправлять в лабораторию немедленно после взятия материала. Пробирки от одного лица (зев, нос, кожа) скрепляют вместе. На каждой пробирке должен быть четко написан порядковый номер анализа в соответствии с прилагаемым списком. На все взятые анализы прилагается сопроводительный документ, где указывается фамилия и адрес лиц, у которых взяты анализы, происхождение взятого материала (зев, нос), название учреждения, направляющего материал, цель обследования (диагностическая, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование и пр.).

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый день

Предварительная бактериоскопия мазка с тампона от больных делается только по требованию врача, направляющего анализ. С этой целью материал берется двумя тампонами. Один из них используют для посева, а другим делают несколько мазков на предметном стекле, поворачивая тампон всеми его сторонами. Высохшие на воздухе мазки фиксируют трехкратным проведением через пламя и окрашивают одной из следующих красок: щелочной метиленовой синью Леффлера, уксуснокислой теллуидиновой синью, уксуснокислым кристалл — виолетом или метил — виолетом.

Материал для исследования из зева с миндалин, из носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред в чашку Петри.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом одну половину поверхности среды для посева из зева с миндалин, а вторую половину — для посева из носа.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 х 1 кв. см, а затем этим же тампоном засевают штрихами по поверхности среды. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии непосредственно с чашки, чтобы работать с чистой культурой, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки со средой обогащения помещают в термостат при 37 град. Высев из среды обогащения производят на следующие сутки на плотные питательные среды тампоном, отжатым о стенки пробирки.

Очень важным обстоятельством при чашечном методе исследования является значительное уменьшение объема работы практических лабораторий. При массовых одномоментных обследованиях по эпидемиологическим показаниям исключается необходимость изготовления, окраски и микроскопии большого количества препаратов — мазков. Многолетний опыт исследователей и практических работников привел к единому мнению, что только морфологические признаки не являются достаточно надежным критерием для дифференциации коринебактерий дифтерии от непатогенных представителей рода коринебактерий.

Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала, а при отсутствии подозрительных колоний чашки просматривают через 48 часов. Выросшие колонии изучают с помощью стереомикроскопа (МБС-1, МБС-2, МБС-9), лупы или невооруженным глазом.

Если через 48 часов не обнаруживают рост микрофлоры на поверхности питательных сред, необходимо исследование материала от лиц, обследованных с диагностической целью, произвести вторично.

Чашки с подозрительными колониями отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии препаратов — мазков из подозрительных колоний можно не производить. На кровяно — теллуритовых средах подозрительные колонии выглядят суховатыми серо — черного цвета с приподнятым центром и изрезанными краями или более мелкими блестящими колониями с ровными краями. На хинозольной среде Бучина подозрительные колонии имеют синий цвет (с различными оттенками — от серовато — зеленоватого до фиолетового), а среда на месте их роста приобретает, как правило, фиолетовый оттенок. При просмотре чашек с помощью стереоскопического микроскопа подозрительные колонии на кровяных теллуритовых средах через 24 часа светло — серого цвета, а через 48 часов — серые с металлическим оттенком, с ровными или изрезанными краями.

Из сомнительных колоний готовят препараты — мазки. Морфологические признаки не позволяют установить видовую принадлежность микроорганизма, но дают возможность предположительно отнести их к роду коринебактерий. Представители этого рода являются полиморфными палочками, располагающимися параллельно или под углом, с характерными утолщениями на концах или без них, нередко с выраженными зернами волютина. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии подвергают дальнейшей идентификации по всем тестам.

Обнаружение в мазках чистых культур кокков, дрожжей, споровых палочек и т.д. позволяет прекратить дальнейшее изучение колоний.

Если выросли 1-2 колонии, то их используют для посева одновременно (из каждой колонии) на 3 среды: одну половину колонии засевают петлей (лучше работать с петлей диаметром 1,5 мм) на среду для определения токсигенности, после чего петлю не обжигая погружают в столбик среды для определения цистиназы (среда Пизу); вторую половину колонии засевают в пробирку с сывороточным агаром для размножения чистой культуры и дальнейшего изучения ее свойств.

Если вырастет только одна типичная, но мелкая колония, необходимо ее пересеять в пробирку с сывороточным агаром для размножения чистой культуры и дальнейшей идентификации. Не обжигая петли, посеять уколом в столбик среды для определения цистиназы. При проведении исследования с диагностической целью, если вырастет только одна, мелкая колония, можно ее засеять на среду для определения токсигенности и не обжигая петли — в столбик среды для определения цистиназы.

В случае роста большого количества подозрительных изолированных однотипных колоний необходимо сразу же приступить к изучению нескольких из них по ряду тестов идентификации (токсигенные свойства, определение цистиназы, уреазы, сахаролитической активности). Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду определения токсигенности и необожженной петлей — на среду Пизу, а другой половины колонии — в пробирку с сывороточным агаром для размножения и сохранения этой культуры. Учитывая, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности коринебактерий дифтерии, рекомендуется при множественном росте подозрительных колоний изучать токсигенные свойства по возможности у максимального числа колоний.

Если на чашках нет изолированных колоний, а наблюдается сплошной рост культуры и при микроскопии обнаруживают кокки или другие микроорганизмы вместе с палочками, типичными для рода коринебактерий, необходимо провести рассев на кровяно — теллуритовые или хинозольную среды для получения изолированных колоний и дальнейшего изучения их свойств. Может быть полезна постановка пробы на токсигенность, которую необходимо повторить с чистой культурой.

Через 24 часа при положительной пробе на цистиназу, появлении специфических линий преципитаций на среде для определения токсигенности (с учетом обнаружения характерных морфологических признаков) изучаемая культура идентифицируется как токсигенные коринебактерии дифтерии. При отсутствии специфических линий преципитации чашки с пробой на токсигенность инкубируют еще 24 часа, а выросшую в пробирке на агаре с сывороткой культуру (после определения ее чистоты) засевают на среды Гисса и ставят пробу на уреазу. При отсутствии специфических линий преципитации (через 48 часов), но при положительной пробе на цистиназу, глюкозу, отрицательной пробе на уреазу и сахарозу культура идентифицируется как нетоксигенные коринебактерии дифтерии с указанием биохимического типа. Расщепление сахарозы коринебактериями дифтерии — явление крайне редкое. В таких случаях следует прежде всего думать о загрязнении кокками и необходимо сделать рассев с сахарозы на одну из кровяно — теллуритовых или хинозольную среды, а повторно выделенную культуру посеять на среды Гисса.

При отсутствии специфических линий преципитации, отрицательных пробах на цистиназу, сахарозу, глюкозу, крахмал и положительную — на уреазу, культура идентифицируется как ложно — дифтерийные коринебактерии (палочка Гофмана); при тех же отрицательных пробах, но при разложении сахарозы и глюкозы и положительной пробе на уреазу культура идентифицируется как дифтероид. В качестве одного из тестов идентификации коринебактерий дифтерии может быть поставлена реакция агглютинации с политиповой дифтерийной сывороткой.

СРОКИ ВЫДАЧИ И ФОРМУЛИРОВКА ОТВЕТОВ

Предварительный ответ выдается при исследовании материала из зева и носа у лиц, больных дифтерией, подозрительных на заболевание дифтерией и у контактировавших с ними лиц. Он может быть выдан немедленно, если по требованию лечащего врача производилась бактериоскопия мазка с тампона. В этом случае ответы формулируются так: «При прямой бактериоскопии мазка с тампона обнаружены палочки, подозрительные на дифтерийные, исследование продолжается» или «При прямой бактериоскопии мазка с тампона палочки, подозрительные на дифтерийные, не обнаружены, исследование продолжается».

Предварительный ответ при обследовании указанной категории лиц обязательно выдается бактериологом через 24-48 часов после посева материала на чашки (в случае применения сред обогащения этот срок может быть увеличен еще на 24 часа) на основании макроскопического и микроскопического изучения выросших колоний и формулируется так: «В посевах материала из зева (носа) обнаружены бактерии, подозрительные на дифтерийные, исследование продолжается».

При отсутствии подозрительных колоний выданный отрицательный ответ является окончательным.

При обследовании на бактерионосительство с профилактической целью, а также при исследовании материала из мест редкой локализации дифтерии предварительный ответ не выдается. В этих случаях выдается только окончательный ответ, основанный на идентификации выделенных культур по всем свойствам.

Окончательный ответ при обследовании лиц всех категорий в случае обнаружения дифтерийных колоний в чашках Петри через 24 часа может быть выдан через 48 часов (культура токсигенная) или через 72 часа (культура нетоксигенная). В тех случаях, когда колонии в чашках появляются позднее чем через 24 часа, ответ выдается соответственно позднее.

Формулировка окончательного ответа при положительном анализе: «Выделены токсигенные (или атоксигенные) коринебактерии дифтерии». При изучении культурально — биохимических признаков указывается принадлежность к типу гравис или митис.

В тех случаях, когда в предварительном ответе указывается, что обнаружена дифтерийная палочка, а при последующем изучении выделен дифтероид или другая микрофлора, окончательный ответ формулируется так: «При дальнейшем исследовании обнаруженная палочка оказалась не принадлежащей к виду коринебактерий дифтерии».

При необнаружении коринебактерий дифтерии на плотных питательных средах выдается отрицательный ответ.

Во всех случаях обнаружения дифтерийных микробов лаборатория обязана известить то учреждение, от которого послан анализ и районного эпидемиолога.

При передаче ответа по телефону необходимо записывать дату передачи и фамилии лиц, передавших и принявших телефонограмму.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

В основе метода определения токсигенности дифтерийных микробов ин витро лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит на плотных питательных средах в местах оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого микробами и диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. В тех участках агара, где встречается токсин с антитоксином, выпадает преципитат в виде белых линий, «стрел» или «усов».

При определении токсигенности на плотной питательной среде (in vitro) следует строго следить за плотностью среды, установлением рН, режимом стерилизации, прозрачностью, точным соблюдением целого ряда технических условий постановки пробы. При небольшом объеме работы среду для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл — количество, которое необходимо для приготовления одной чашки, а не во флаконы. Последнее требует многократного расплавления агара, что может ухудшить качество питательной среды. Необходимо помещать полоски фильтровальной бумаги (1,5х8 см), смоченной 0,2-0,25 мл противодифтерийной антитоксической сывороткой диаферм или ферментированным и очищенным специфической сорбцией дифтерийным антитоксином (однозональной сывороткой), содержащих в этом объеме 100 — 120 МЕ, на застывающую поверхность агара. Чашки со средой на токсигенность можно сохранять в холодильнике (4 град.) одни сутки без фильтровальной бумаги. Культуру засевают «бляшками» размером 0,7 см на таком же расстоянии между «бляшками» и на расстоянии 0,5 см от фильтровальной бумаги. При исследовании на токсигенность 1/2 колонии и смеси 2-6 колоний посев производят двумя «бляшками» по обе стороны фильтровальной бумаги, при этом следует всегда засевать с одной стороны фильтровальной бумаги по 1/2 колонии (отдельных, изолированных), а с другой стороны — смеси колоний. На одну чашку следует поглощать не более 10 «бляшек», при этом 6 «бляшек» испытуемой культуры и 4 — контрольного штамма (см. схему).

При использовании в составе среды антитоксической противодифтерийной сыворотки следует учитывать, что появление преципитатов в агаровом геле у дифтерийный культур возможно не только за счет взаимодействия токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и за счет взаимодействия бактериальных антител с соответствующими антигенами микробной клетки (неспецифические преципитаты).

Это зависит от того, что изготовляемые сыворотки не являются в антигенном отношении моновалентными препаратами. Помимо антител к дифтерийному экзотоксину, в них содержатся в различных количественных соотношениях и антитела к микробному компоненту.

Неспецифические преципитаты могут образовываться как у токсигенных, так и у нетоксигенных дифтерийных культур. Эти преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, иногда видимые только в лупу, появляются чаще через 48-72 часа, но у некоторых штаммов — и на 1-е сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям контрольного (заведомо токсигенного штамма). В тех случаях, когда у контрольного штамма появляется несколько линий преципитации, специфическими следует считать наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся преципитаты. Наблюдаются следующие варианты в образовании преципитатов.

1. Испытуемая дифтерийная культура, у которой образуются преципитаты, считается токсигенной, если эти линии преципитации сливаются с соответствующими специфическими линиями заведомо токсигенного штамма или идут на смыкание с ним (схема 1 — пример 14(1); 14(2); 14(3) и др.).

2. Испытуемая дифтерийная культура считается нетоксигенной, если ее линии преципитации располагаются так, что концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма:

а) линии испытуемого штамма идут на перекрест со специфическими линиями контрольного штамма (схема 3 — пример 20(2));

б) линии преципитации испытуемого штамма перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма (схема 3 — пример 20(1); 20(2);

в) линии преципитации испытуемого штамма сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма (схема 2 — пример 15(3).

Иногда отмечается появление множественных неспецифических линий преципитации.

В качестве контроля следует использовать токсигенный штамм суточного или 2-суточного роста. Контрольный токсигенный штамм всегда должен храниться в лаборатории. Его получают в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича, НИИВСах, НИИЭМах или в лабораториях городских и областных СЭС. Нельзя применять производственный штамм Р-8 и его варианты. Хранить штамм следует на сывороточном агаре при 4-10 град. (пересев каждые 14 дней) или на полужидком агаре, приготовленном на мартеновском бульоне рН = 7,6, при комнатной температуре (пересев один раз в три месяца). Штамм необходимо периодически засевать на кровяной агар.

Для установления эпидемиологических связей в очаге дифтерийной инфекции между спорадическими и групповыми заболеваниями, а также выявления возможных случаев реинфекции целесообразно использовать метод фаготипирования коринебактерий дифтерии, разработанный в Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР. С целью установления фаговара санэпидстанции могут выслать выделенные штаммы спецпочтой (на скошенном 10% сывороточном агаре в пробирках) в адрес института (125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского).

Для определения серологического варианта токсигенных коринебактерий дифтерии можно ставить развернутую реакцию агглютинации с типовыми неадсорбированными дифтерийными агглютинирующими сыворотками в соответствии с инструкцией по бактериологическому исследованию на дифтерию.

Для дифференциации заболевания дифтерии от носительства токсигенных коринебактерий дифтерии возможно применение иммунологических методов исследования:

1. Определение титра антитоксина в сыворотке крови по методу Иенсена (нейтрализация экзотоксина антитоксином в коже кролика). Титры дифтерийного антитоксина в первые 3-5 дней заболевания ниже или на уровне защитного (0,03 МЕ/мл) свидетельствует в пользу дифтерии, титры 0,5 МЕ/мл и выше — против дифтерии.

2. Выявление антибактериальных антител по реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием микробных антигенов коринебактерий дифтерии. Диагностическое значение при заболевании дифтерией имеет титр антибактериальных антител 1:80 и выше, а также нарастание титра в сыворотке крови в динамике заболевания (не менее чем на 2 разведения).

Кровь при сомнительной клинической картине заболевания забирают в первые дни и через 10-14 дней пребывания больного в стационаре. Определение титра антитоксина в сыворотке крови может иметь диагностическое значение только в первые дни заболевания до введения антитоксической сыворотки, на титры антимикробных антител последняя не влияет. Сыворотки крови следует присылать в запаянных ампулах для постановки иммунологических диагностических тестов в Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Минздрава РСФСР по адресу, указанному выше.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Качество питательной среды является важнейшим условием при любом бактериологическом исследовании. Если добиваться максимальной всхожести и высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала, то необходимо создать оптимальные условия для роста и размножения этих бактерий, сохранения их биологических свойств и создания условий для ингибиции сопутствующей флоры.

В настоящее время в качестве основ для питательных сред используют сухие питательные агары Дагестанского НИИ питательных сред. Однако некоторые серии этих агаров нестандартны и нередко бывают непригодны для культивирования коринебактерий дифтерии.

Для улучшения качества питательных сред (повышения всхожести и высеваемости) следует использовать для растворения сухого агара или сухой среды Бучина вместо дистиллированной воды перевар Хоттингера, 1% пептонную воду или продукты рыбного происхождения (рыбная паста), выпускаемые Дагестанским НИИ питательных сред (разводится по прописи). Отечественная промышленность изготавливает для нужд лечебной медицины аминопептид, который представляет собой ферментативный гидролизат крови животных и содержит полноценный набор аминокислот и простейших пептидов. Аминопептид выпускается в стерильном виде в стеклянных флаконах по 450 мл. Препарат изготавливается в соответствии с требованиями фармакопейной статьи (ФС 42-630-72), что обеспечивает его высокую стандартность. По истечении срока годности препарат не используется по прямому назначению и подлежит уничтожению. Целесообразно использовать аминопептид с истекшим сроком годности как основу питательных сред для культивирования и выделения коринебактерий дифтерии, что будет способствовать стандартизации и улучшению качества сред, сократит расходование дефицитного пищевого сырья и обеспечит определенный экономический эффект. Аминопептид можно использовать для изготовления питательных сред по истечении срока годности в течение 2-х лет. Приобретение может быть осуществлено в аптечной сети, хирургических стационарах и станциях переливания крови.

Многолетний практический опыт показал, что при бактериологическом исследовании на дифтерию лучшими являются кровяно — теллуритовые среды. Основным ингредиентом питательных сред является кровь в количестве 10-15 мл на 100 мл агара. Если для приготовления питательных сред использовали аминопептид, то крови требуется в 2-3 раза меньшем количестве (5%). Использование сыворотки лошади или крупного рогатого скота снижает высеваемость коринебактерий дифтерии в 2,5-4 раза. Не следует применять и цитратную кровь. Используют дефибринированную кровь скота (крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец), полученную на бойне, дефибринированную кровь лабораторных животных (кроликов), плацентарную кровь и сгустки после отрицательных серологических реакций. Сгустки собирают в стерильные бутыли со стеклянными бусами и разбивают их. В случае, когда не удается разбить бусами, сгустки замораживают и оттаивают (бутыль со сгустками помещают на сутки в морозильную камеру, после чего они легко разрушаются). Затем добавляют стерильный физиологический раствор 1/5-1/4 объема сгустков. Для лучшего сохранения крови (дефибрированной и сгустков после их разрушения) в 14-16 мл добавляют 1 мл 2% раствора теллурита калия. Смесь крови с теллуритом калия можно сохранять в холодильнике до 2 месяцев. При приготовлении среды на каждые 100 мл растопленного питательного агара количество теллурита калия уменьшают на 1 мл, учитывая, что этот ингредиент был добавлен для консервирования крови.

В переваре Хоттингера, бульонах из рыбной пасты и др. должно содержаться аминного азота до 100-150 мг %; в готовых основах приготовления кровяно — теллуритовой среды, в среде Бучина (2% агаровых средах) — до 200 мг%, в среде Клауберг П (3% агаровой среде) — до 300 мг%. Лучше определять аминный азот в 1% агаровых основах, которые предварительно расплавляют, а дистиллированную воду подогревают в водяной бане. Если питательная агаровая основа готовится на стандартном препарате — аминопептиде, содержащем всегда постоянное количество аминного азота, определение данного показателя не требуется.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА

Реактивы

1. Формалин — 40% (продажный без осадка).

2. Фенолфталеин (1% водно — спиртовой раствор в соотношении 1:1).

3. Бромтимоловый синий.

4. NaOH 0,1 N (приготовленный из фиксанала).

5. HCl 0,1 N (приготовленный из фиксанала).

К 100 мл формалина добавляют 2 мл раствора фенолфталеина и подщелачивают 0,1 № раствором едкого натра, добавляя его каплями до появления стойкого слабо — розового окрашивания. В случае выпадения белого осадка смесь к употреблению не пригодна.

Бромтимоловый синий в количестве 0,1 г растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 0,1 № раствор едкого натра (примерно от 0,3 до 16 мл) до тех пор, пока раствор не приобретает цвета бутылочного стекла, и доводят объем дистиллированной водой до 250 мл.

Смешивают 27 мл децинормального раствора буры (раствор 12,404 г борной кислоты в 1 л децинормального едкого натра) с 3 мл децинормального раствора соляной кислоты и 6 мл 0,1% раствора фенолфталеина (водно — спиртового в соотношении 1:1).

В два узких высоких стаканчика с плоским дном объемом в 50 мл наливают 2 мл испытуемого раствора и 18 мл дистиллированной воды. В третий стаканчик наливают 20 мл буферной смеси. В первый стаканчик добавляют 3-5 капель раствора индикатора — бромтимолового синего. Если испытуемый раствор имеет щелочную реакцию (при добавлении бромтимолового синего он окрашивается в синий цвет), то его титруют децинормальным раствором соляной кислоты до цвета бутылочного стекла и отмечают количество соляной кислоты (в мл), израсходованное на титрование (А1). Если исследуемый раствор имеет кислую реакцию (при добавлении бромтимолового синего он окрашивается в желтый цвет), то его титруют децинормальным раствором едкого натра до цвета бутылочного стекла и отмечают количество раствора щелочи (в мл), израсходованное на титрование (А2).

Во второй стаканчик добавляют 2,5 мл формольной взвеси и титруют децинормальным раствором едкого натра до малинового цвета, аналогичного цвету буферной смеси, налитой в третий стаканчик. Учитывается количество децинормального раствора щелочи (в мл) израсходованное на титрование (В).

Количество аминного азота (NH2) вычисляется по следующей формуле:

С х 1,4 х К х 100 NH2 (в мг%) = ----------------- Н

Величину С рассчитывают следующим образом: при щелочной реакции исследуемого раствора С = А1 + В; при кислой реакции С = В — А2;

К — поправка децинормального раствора NaOH при приготовлении из фиксанала равна 1;

1,4 — количество аминного азота (в мг), соответствующее 1 мл децинормального раствора едкого натра;

Н — количество исследуемого раствора.

СРЕДЫ ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО ПОСЕВА МАТЕРИАЛА

1. Среда Клауберг П

К 100 мл 3% питательного агара рН = 7,6, содержащего аминного азота 300 мг% (7,5 г сухого питательного агара или агара «Д» на 100 мл различных бульонов или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50 град., добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой» крови.

Приготовление глицериновой смеси. К 40 мл дефибринированной крови или разбитых в физиологическом растворе сгустков добавить 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуется при температуре 110 град. в течение 30 мин.). Если используемая кровь или сгустки были нестерильны, то глицериновая смесь сохраняется в холодильнике при температуре от 4 до 10 град. в течение 3-6 недель.

Приготовление «лаковой» крови. К 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 26 мл дефибринированной крови или разбитых в физиологическом растворе сгустков.

К 100 мл 2% питательного агара рН = 7,6, содержащего аминного азота 200 мг% (5 г сухого питательного агара или агара «Д» на 100 мл вышеописанного любого бульона или дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50 град., добавляют 2 мл 2% раствора теллурита калия и 15 мл гемолизированной крови.

К 10 мл дефибринированной крови добавить 5 мл стерильной дистиллированной воды (объем гемолизированной крови на 100 мл питательного агара). Гемолизированную кровь можно получить также путем вымывания гемоглобина из сгустков крови. Для этого к разбитым в физиологическом растворе сгусткам добавляют 1/3 объема дистиллированной воды. На 100 мл питательного агара добавляют 15-20 мл этой смеси.

К 100 мл дистиллированной воды или бульона Хоттингера или 1% пептонной воды добавляют 7-9 г (согласно прописи на этикетке) порошка сухой хинозольной среды, тщательно размешивают и нагревают на слабом огне до полного растворения агара. Среду кипятят в течение 2-3 минут, не допуская пригорания агара, до образования крупнопузырчатой, быстро оседающей пены. К охлажденной до 50 град. среде добавляют 10-15 мл стерильной дефибринированной крови.

К 100 мл 2% питательной агаровой основы (вариант I или II) рН = 7,6, содержащего аминного азота 140 мг%, расплавленного и охлажденного до 50 град. C, добавляют 2 мл 2% раствора теллурита калия и 5 мл дефибринированной или гемолизированной крови.

К 100 мл 3% питательной агаровой основы (вариант 1 или 2) рН = 7,6, содержащей 200 мг% аминного азота, расплавленной и охлажденной до 50 град. C, добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой» крови.

Для приготовления кровяных теллуритовых сред рекомендуется использовать два варианта питательных агаровых основ:

1. Аминопептид                                      1 объем

2. Дистиллированная вода                            3 объема

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)            5,0 г

4. Натрий хлористый (NaCl)                          4,0 г

5. Агар                                            20,0 г

6. Л-цистин гидрохлорид (солянокислый)              0,01 г
                                             (1% раствор 1 мл)

Вариант I - состав агаровой основы для среды Клауберг II
                    (расчет на 1 литр)

1. Аминопептид                                      1 объем

2. Дистиллированная вода                            2 объема

3. Сухой экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)            5,0 г

4. Натрий хлористый (NaCl)                          4,0 г

5. Агар                                            30,0 г

6. Л-цистин гидрохлорид (солянокислый)              0,01 г
                                           (1% раствор - 1 мл)

Аминопептид разводят дистиллированной водой, добавляют хлористый натрий (NaCl) и агар, кипятят до расплавления. Добавляют ЭКД, размешивают до его полного растворения, устанавливают рН = 7,8-7,9 20% раствором едкого натра (NaOH) и кипятят 5 мин. Фильтруют через ватно — марлевый фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой, добавляют необходимое количество 1% раствора цистина. В случае отсутствия цистина гидрохлорида, хорошо растворимого в воде, можно использовать Л-цистин, растворимый в 0,1 № растворе едкого натра (NaOH).

Вариант 2 питательных агаровых основ для кровяной теллуритовой среды и среды Клауберг II готовится так же, как и вариант 1, но с добавлением активированного угля из расчета 3,0 г на литр питательной агаровой основы. Уголь добавляют одновременно с цистином.

Питательные агаровые основы (вариант 1 и 2) разливают в стерильные флаконы и стерилизуют при 110-112 град. C (0,5 атм.) в течение 30 мин. с предварительным прогревом текучим паром при 100 град. C.

Сохраняются питательные агаровые основы в холодильнике в течение 2-х месяцев.

Все питательные среды разливают по чашкам Петри слоем 3 — 4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток при условии хранения при Т от 4 до 10 град. Для выделения и размножения чистой культуры используют вместо свернутой сыворотки скошенный в пробирках агар с добавлением 20-30% сыворотки лошади или крупного рогатого скота.

СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ

1. Приготовление мартеновского агара с мясной водой

Приготовление мартеновского пептона. Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью, отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают в бутыли емкостью 3-5 л и заливают подогретой до 40-50 град. водопроводной водой из расчета на один литр воды 300-350 г измельченной массы. Температура должна быть 40 град. Туда же прибавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд. вес 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат при температуре 45-48 град. на 48 часов (не более), не закрывая бутыль пробкой. В течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1-1,5 часа), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутыли лежит небольшой слой темного осадка.

Полноту осаждения балластных белков можно проверить путем добавлении к 5 мл профильтрованного пептона 1-2 капли 10% NaOH. Муть не должна появляться.

Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80 град., устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с переваром. Нагревание продолжается в течение 10 минут. Бутыли тщательно взбалтывают, закрывают пробкой и ставят в прохладное, сухое помещение для отстаивания при температуре не выше 12 град. Пептон годен к употреблению не ранее чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.

Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде может храниться без стерилизации при комнатной температуре.

Приготовление мясной воды. Для приготовления мясной воды желательно пользоваться свежим незамороженным мясом средней упитанности нестарого животного. Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды на 1 кг фарша и оставляют на ночь в холодильнике (от 4 до 10 град.), утром смесь кипятят на асбестовой сетке в течение 15-20 минут с момента закипания. Готовый настой фильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают в стерильные бутыли по 250-500 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут. Хранить по возможности в холодильнике.

Приготовление питательного агара. Мартеновский пептон — 0,5 л, мясная вода — 0,5 л, агар — агар — 15-18 г (1,5-1,8%), уксуснокислый натрий — 5 г, мальтоза — 3 г.

15 или 18 г агара промывают в течение рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 л мясной воды). Устанавливают рН = 7,8-8,0 путем подщелачивания бульона, 20% раствором NaOH по бумажке с индикатором крезоловый красный, которая при этой реакции изменяет желтый цвет в розово — малиновый. Бульон кипятят в течение 10 минут, считая с момента закипания, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксуснокислого натрия, 0,3% мальтозы (3 г на 1 л), проверяют рН и, если нужно, снова доводят до 7,8-8,0, кипятят в течение 15 минут, дают отстояться в теплом месте (в аппарате Коха, термостате) 2-3 часа и фильтруют через тканевый или ватно — марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) при большом объеме работы или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 мин.

Перед разливкой в чашки Петри к растопленному и охлажденному до 50 град. питательному 1,5% агару добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или к 1,8% агара 30% сыворотки крупного рогатого скота. Сыворотка не должна содержать даже следов гемолиза, т.к. это задерживает токсинообразование.

0,1 г крезолового красного растворяют в 100 мл 95% спирта и оставляют при температуре 37 град. на 24 часа, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко — желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

Для приготовления среды сухой порошок растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно размешивают на слабом огне при постоянном помешивании, нагревают до полного расплавления агара, кипятят в течение 5-7 минут с закрытой ватной пробкой, фильтруют через ватно — марлевый или тканевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) или пробирки (10 мл), стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут. Перед разливкой в чашки Петри к растопленной и охлажденной до 50 град. среде добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или 30% сыворотки крупного рогатого скота.

К 90 мл расплавленного 1,5%, только мартеновского агара (не допускается использование агара Хоттингера), рН = 7,6, добавляют 2 мл 1% раствора цистина, приготовленного на 0,1 растворе H2SO4 (или 0,1 № HCl), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 № раствора NaOH. Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы, можно использовать фиксаналы, выпускаемые предприятиями химической промышленности. Среду стерилизуют при температуре 112 град. в течение 30 минут, можно хранить один месяц.

К расплавленной (для сохранения цистина агар с цистином при расплавлении не следует кипятить) и охлажденный до 40-45 град. среде добавляют 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца. Раствор уксуснокислого свинца приготовляют extemporae, используя стерильную пробирку и стерильную дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане при 80-90 град. в течение 20-30 минут, перемешивают со средой, добавляют 9 мл лошадиной или бычьей сыворотки (сыворотка в присутствии уксуснокислого свинца свертывается при 50 град. и среда приобретает молочный цвет, что затрудняет учет реакции — появление «облачка», поэтому следует охлаждать до 40-45 град.). Среду стерильно разливают по пробиркам любого диаметра столбиком высотой 3-4 см. Посев производят уколом.

При росте дифтерийные бактерии благодаря ферменту цистиназе расщепляют цистин. Образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с имеющимся в среде уксуснокислым свинцом, в результате чего последний переходит в сернистый свинец — соединение темно — коричневого цвета. При посеве уколом коринебактерии дифтерии образуют интенсивное потемнение по ходу укола и вокруг него и характерное «облачко» темно — коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности. Ложнодифтерийные бактерии и дифтероиды, как правило, не вызывают никаких изменений среды или дают слабое потемнение по ходу укола, никогда не сопровождающееся «облачком». Результаты учитываются с момента посева через 20-24 часа.

Все другие среды для определения биохимических свойств (ферментов уреазы, сахаролитических) готовятся в строгом соответствии с прописями инструкции по бактериологическому исследованию на дифтерию от 1967 г. № 690-67 или приложение № 4 к приказу Минздрава СССР от 1974 г. № 580.

Ввиду нестандартности питательных основ и ингредиентов, используемых при приготовлении сред для исследований при дифтерии, каждые новые серии сухих агаров Дагестанского научно — исследовательского института питательных сред (агар «Д», хинозольный агар Бучина, другие питательные агары, сухой питательный агар для определения токсигенности, продукты рыбного происхождения и др.), питательные среды, приготовленные в лаборатории (мартеновский, мясо — пептонный агар и агар на переваре мяса по Хоттингеру), среды для определения биохимических свойств и новые ингредиенты подлежат бактериологическому контролю.

1. Качество питательной среды (или питательной основы) устанавливают путем определения: а) всхожести дифтерийных бактерий (контрольного музейного или свежевыделенного токсигенного штаммов); б) ингибирующих свойств в отношении сопутствующей флоры (стафилококка). Готовят 4 чашки Петри с испытуемой средой и в 7 стерильных пробирках делают последовательные разведения суточной культуры коринебактерий дифтерии, а также стафилококка. Используют стандарт мутности (по кишечной палочке).

NN пробирок	Количество физиологического раствора (в мл)	Объем вносимой культуры (в мл)	Количество микробов в 1 мл
Исходное разведение 1 млрд микробных тел в 1 мл физиологического раствора
1.	1,0	1,0 исходной взвеси	1 000 000 000 500 000 000
2.	0,9	0,1 из 1-й пробирки	50 000 000
3.	0,9	0,1 из 2-й -«-»	5 000 000
4.	0,9	0,1 из 3-й -«-»	500 000
5.	0,9	0,1 из 4-й -«-»	50 000
6.	0,9	0,1 из 5-й -«-»	5 000
7.	0,4	0,1 из 6-й -«-»	1 000

На две чашки с испытуемой средой делают высев дифтерийной культуры только из 6-го и 7-го разведений, внося на каждую чашку по 0,1 мл взвеси 6-го и 7-го разведений (500 и 100 микробных клеток соответственно), досуха растирают шпателем. Так же засевают 6-е и 7-е разведения стафилококка.

Учет производят через 24 и 48 часов. Среда или питательная основа признаются годными к применению при следующих условиях: культура коринебактерий дифтерии должна дать рост в виде отдельных колоний через 24 часа инкубации при посеве 6-го разведения и даже одной колонии из 7-го разведения, при отсутствии в 6-м и 7-м разведениях роста стафилококка.

2. Подвергаются испытанию среды для определения токсигенности коринебактерий дифтерии и новые ингредиенты (антитоксическая противодифтерийная сыворотка, лошадиная сыворотка, сыворотка крупного рогатого скота и т.д.).

Данный контроль осуществляется путем приготовления среды для определения токсигенности и испытания ее контрольным токсигенным дифтерийным штаммом, соблюдая все этапы методики определения токсигенных свойств на плотных питательных средах. Пригодными для работы считаются те серии среды, при использовании которых у токсигенного контрольного штамма интенсивные преципитаты образуются через 24 часа после посева «бляшками». Среды (или новые ингредиенты) не могут быть использованы и подлежат замене в случае отсутствия преципитатов или появления их в более поздние сроки.

3. Бактериологический контроль проходят среды для определения биохимических свойств. В среду Пизу, бульон с мочевиной (или реактивы А и В), среды Гисса засевают петлей контрольный дифтерийный штамм; при проверке сред Гисса контрольный дифтерийный штамм должен быть биохимического типа гравис.

Форма регистрации поступающего в лабораторию материала на бактериологическое исследование по дифтерии

NN анализов п/п	Дата поступления	Ф., И., О.	Возраст	Из какого учреждения поступил или домашний адрес	Повод к обследованию	Откуда взят материал	Питательные среды (Клауберг II, кровяно — теллуритовая, хинозольная		Даты выдачи ответа	Бактериологическое заключение
										предварительное	заключительное
							24 час.	48 час.

Примечание. В графе «Питательные среды» указать наличие роста, описать морфологию подозрительных колоний, при необходимости морфологию культуры, если производилась микроскопия.

Форма регистрации результатов исследований с подробным описанием хода исследования и дифференциально — диагностических признаков культуры

NN п/п

NN анализов (из формы регистрации поступ. материала)

Дата поступления

Ф., И., О.

Возраст

Повод к обследованию

Откуда взят материал

Токсигенность

Цистеназа

Разложение углеводов

24 час.

48 час.

сахароза

глюкоза

крахмал

Форма учета контроля питательных основ, ингредиентов и сред

Дата	Что исследовано	№ серии и срок годности	Рост дифтерийных бактерий		Подавление роста стафилококка
			24 час.	48 час.	24 час.	48 час.

NN п/п	Ф., И., О.	Возраст	Повод к обследованию	Бактериологическое заключение
				токсигенность	цистиназа	уреаза	разложение углеводов
							крахмал	сахароза	глюкоза

Примечание. Высылается в 2 экземплярах, последние две графы заполняет МНИИЭМ при ответе.

Ф., И., О.	Возраст	Клинический диагноз	Дата взятия крови	Дата введения антитоксической противодифтерийной сыворотки	Бактериологическое исследование	Прививочный анамнез	Краткое описание клинической картины заболевания

---