Методические указания по определению остатков глина (хлорсульфурона) в зерне и соломе зерновых колосовых культур, в семенах и полове льна-долгунца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 5018-89)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
8 июня 1989 г. № 5018-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТКОВ ГЛИНА (ХЛОРСУЛЬФУРОНА) В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, В СЕМЕНАХ И ПОЛОВЕ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны В.А. Калининым, Т.С. Калининой (ТСХА).
Краткая характеристика препарата. Глин - N-(4-метил-6-метокси-1,3,5- триазинил-2)-N'-[2-метоксикарбонил фенилсульфонил]мочевина. Общепринятое название - хлорсульфурон. Брутто-формула C H ClN O S. Молекулярная масса 12 12 5 4 357,8. Химически чистый глин представляет твердое белое кристаллическое вещество, т. пл. 174 - 178 °C. В виде сухой пленки на стеклянной пластинке он устойчив к УФ-свету, через 1 мес. на ткани сухого растения разрушается на 30%, сухой почве - на 15% и в водном растворе - на 50% под действием искусственного солнечного света. В дистиллированной воде гидролизуется медленно при pH от 5,7 до 7,0 и 20 °C, период полураспада - 4 - 8 недель. В почве фитотоксичные остатки хлорсульфурона сохраняются до 2 лет, хотя период его полураспада составляет 4 - 6 недель. В растительных тканях препарат быстро распадается до нетоксичных метаболитов. Хорошо растворим в метиленхлориде, этилацетате, ацетонитриле, ацетоне, растворимость в воде зависит от pH и колеблется от 27,9 до 300 мг/л. Глин малотоксичен для человека и теплокровных животных. Для крыс ЛД > 5500 мг/кг. Это
50
повсходовый гербицид, эффективный в борьбе с двудольными сорняками в посевах зерновых культур и льна. Особо чувствительны к этому гербициду сахарная и кормовая свекла, кукуруза, подсолнечник, картофель. Гербицид разрешен для применения в посевах льна-долгунца в виде 75-процентной сухой
текучей суспензии при норме расхода 13 — 20 г/га.
Принцип метода. Метод основан на определении глина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, с использованием фотокондуктивного детектора и колонки с силикагелем, после экстракции органическим растворителем и очистки экстракта перераспределением действующего вещества в двух несмешивающихся растворителях. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 104.
(n = 5, p = 0,95)
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, % | Доверительный интервал, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Зерно Солома Полова льна Семена льна | 0,01 0,05 0,05 0,01 | 0,01 — 0,2 0,05 — 0,2 0,05 — 0,2 0,01 — 0,2 | 83 78 81 80 | +/- 7,35 +/- 6,81 +/- 6,76 +/- 8,23 | +/- 9,31 +/- 7,03 +/- 7,52 +/- 10,2 |
Избирательность метода. В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании зерновых и льна-долгунца: 2,4-Д, 2М-4Х, байлетона, тилта, нурел-Д.
Реактивы, растворы. Хлорсульфурон с содержанием действующего вещества 99,9%. Ацетонитрил, высушенный над безводным Na SO и перегнанный. 2 4 н-Гексан. Хлороводородная кислота х.ч., 1 н водный раствор. Кислота уксусная ледяная. Метиленхлорид перегнанный х.ч. Фосфат натрия безводный ч.д.а. Хлорид натрия. Гидроксид натрия, 1 н водный раствор. Метиловый спирт для хроматографии. Изопропиловый спирт х.ч. Хлороформ медицинский.
Циклогексан для хроматографии. Гелий. Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь 750 мл
циклогексана, 125 мл изопропанола, 125 мл метанола, 1 мл смеси 10 мл
ледяной уксусной кислоты с 1 мл дистиллированной воды. Раствор для
кондиционирования колонки для ВЭЖХ: 400 мл изопропанола + 100 мл ледяной
уксусной кислоты + 10 мл дистиллированной воды. Буферный раствор pH 10:
1,42 г безводного Na HPO и 40 г NaCl растворяют в 400 мл воды, доводят pH
2 4
до 10 путем добавления по каплям 1 н NaOH при непрерывном помешивании и
фиксируя pH с помощью иономера. Охлаждающая смесь: 33 г NaCl растворяют в
100 мл воды и добавляют лед до насыщения.
Приборы, аппаратура, посуда. Жидкостный хроматограф с фотокондуктивным детектором, например хроматограф «Waters», модель 510, с детектором Tracor, модель 965, и стальной колонкой длиной 30 см с сорбентом на основе силикагеля с удельной поверхностью 300 кв. м/г и размером частиц 10 мкм, силасорб-300 (ЧСФР, «Хемапол») или мю-порасил («Waters»). Мельница лабораторная. Ротационный испаритель. Водоструйный насос. Иономер. Воронки: Бюхнера фарфоровые диаметром 70 мм; делительные на 150 мл. Концентраторы грушевидные (конические) на шлифах (N 19). Пипетки мерные на 0,2; 1,0; 5,0; 10 и 25 мл. Стаканы стеклянные на 100 и 600 мл. Колбы: мерные на 25; 50 и 100 мл; Бунзена на 800 мл.
Подготовка к определению. Хранение проб. Отобранные пробы подсушивают до стандартной влажности и хранят в сухом, хорошо вентилируемом помещении. Срок хранения до 6 мес. Перед анализом сухую пробу размалывают на лабораторной мельнице до размера частиц не менее 1 мм.
Кондиционирование хроматографической колонки. Перед началом работы хроматографа раствор для кондиционирования колонки и подвижную фазу дегазируют 2 ч, пропуская через растворы гелий. Операцию повторяют ежедневно в течение 1 ч перед началом анализа, не выключая прибора. При добавлении новой жидкой фазы дегазирование проводят в течение 2 ч. Готовую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при 35 °C, пропуская через нее в течение 4 ч раствор для кондиционирования колонки со скоростью 0,5 мл и затем еще 4 ч подвижную фазу для ВЭЖХ с той же скоростью. Эту операцию проводят ежедневно перед началом ввода проб в ночное время с использованием таймеров (реле времени). Нарушение данного режима приводит к резкой потере чувствительности.
Приготовление стандартных растворов. Стандартный раствор № 1 с концентрацией хлорсульфурона 1 мг/мл готовят следующим образом: взвешивают 50 мг хлорсульфурона с точностью +/- 0,02 г, переносят навеску в мерную колбу на 50 мл метиленхлоридом и доводят объем раствора до метки этим же растворителем. Методом последовательного разбавления в метиленхлориде готовят стандартный раствор № 2 концентрацией 100 мкг/мл. Растворы № 1 и № 2 можно хранить в холодильнике не менее 1 мес. Ежедневно из раствора № 2 готовят стандартный раствор № 3 в метиленхлориде с концентрацией хлорсульфурона 1 мкг/мл. Для калибровки хроматографа ежедневно готовят рабочие стандартные растворы с концентрацией хлорсульфурона 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мкг/мл, внося пипеткой соответствующее количество раствора № 3 в мерные колбы, упаривая метиленхлорид досуха током азота и доводя объем раствора до метки подвижной фазой. Хроматографируют по 20 мкл каждого рабочего раствора, измеряют высоту пика (или площадь) и строят график зависимости высоты пика от концентрации хлорсульфурона.
Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Навеску измельченного зерна (50 г) или соломы (10 г) помещают в стакан на 600 мл, заливают 150 мл этилацетата и гомогенизируют в течение 10 мин. при скорости 1000 об./мин. Экстракт декантируют в воронку Бюхнера с фильтром и фильтруют под вакуумом. Экстракцию повторяют дважды порциями по 150 мл этилацетата. Объединенный экстракт (общий объем 450 мл) упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C, обмывая колбу Бунзена этилацетатом. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 мл метиленхлорида, добавляют 25 мл буферного раствора (pH 10), и метиленхлорид полностью отгоняют на ротационном испарителе. Недопустимы капли метиленхлорида в водном растворе! Концентратор с водным буфером помещают в ледяную баню с температурой 10 °C на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют в делительную воронку и промывают его тремя порциями хлороформа по 25 мл и двумя — циклогексана по 25 мл. Органические растворители отбрасывают. Водную фазу переносят в стакан и подкисляют 1 н хлороводородной кислотой до pH 2, фиксируя pH на иономере. Подкисленный раствор переносят в делительную воронку (чистую), обмывая стакан хлороформом, и экстрагируют хлорсульфурон из водной фазы тремя порциями по 25 мл хлороформа. Хлороформ упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы и хроматографируют.
Навеску измельченных семян льна-долгунца (50 г) помещают в стакан на 100 мл, заливают 150 мл ацетонитрила и гомогенизируют в течение 10 мин. Экстракт декантируют в воронку Бюхнера с фильтром и фильтруют под вакуумом. Повторяют экстракцию еще дважды по 150 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают до объема 50 мл на ротационном испарителе при температуре 35 °C и переносят в делительную воронку, обмывая концентратор 10 мл ацетонитрила. Промывают экстракт 3 раза порциями по 50 мл н-гексана, гексан отбрасывают, а ацетонитриловый экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 мл метиленхлорида, добавляют 25 мл буферного раствора (pH 10) и метиленхлорид полностью отгоняют на ротационном испарителе. Концентратор с водным буфером помещают в ледяную баню с температурой минус 10 °C на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют в делительную воронку и промывают его тремя порциями хлороформа по 25 мл и двумя циклогексана по 25 мл. Органическую фазу отбрасывают. Водную фракцию переносят в стакан, подкисляют 1 н хлороводородной кислотой до pH 2, фиксируя pH на иономере. Подкисленный раствор переносят в делительную воронку (чистую), обмывая стакан хлороформом, и экстрагируют хлорсульфурон из водной фазы хлороформом, тремя порциями по 25 мл. Из полученного раствора с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью удаляют растворитель. Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы и хроматографируют.
Условия хроматографирования. Жидкостный хроматограф «Waters», модель 510, с программатором температуры и фотокондуктивным детектором «Тракор», модель 365. Шкала аттенюатора 1 x 5 или 1 x 2. Скорость движения ленты самописца 300 мм/ч. Колонка стальная, длина 30 см, внутренний диаметр 3 мм. Неподвижная фаза — мю-порасил («Waters»). Температура колонки 35 °C. Скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин. Объем пробы, вводимой в колонку, 20 мкл. Абсолютное время удерживания хлорсульфурона 11 мин. Линейность детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг. Каждую анализируемую пробу вводят 2 раза и вычисляют среднюю высоту пика. Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор (1,0 мкг/мл), разбавляют.
Обработка результатов анализов. Содержание глина (X, мг/кг) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
S AV
пр
где:
S , S - высоты пиков соответственно стандарта и образца, мм; с пр
A — концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
P — масса анализируемого образца, г.
Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.