Методические указания по определению действующего вещества препарата торк и его метаболита в воде, почве и растительном материале методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 5004-89)
8 июня 1989 г. № 5004-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА ТОРК И ЕГО МЕТАБОЛИТА В ВОДЕ, ПОЧВЕ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны В.Н. Кавецким, Л.И. Бублик, В.А. Лесовой (УкрНИИЗР), Г.О. Оганесяном, Ю.А. Бунятяном (Филиал ВНИИГИНТОКС).
Торк (оксид фенбутатина) - акарицид. Действующее вещество препарата - ди[трис(2-диметил-2-фенилэтилового)олова]оксид. Брутто-формула C H OSn . 60 78 2
Молекулярная масса 1052. Химически чистое вещество представляет собой белый
кристаллический порошок с т. пл. 138 - 139,5 °C, хорошо растворимый в ряде органических растворителей (ксилол, толуол, бензол, гексан, ацетон и др.), практически не растворимый в воде, нелетуч. В воде гидролизуется с образованием трис(2-метил-2-фенил)пропилоловогидроксида, который при комнатной температуре переходит опять в исходное вещество. Разрушается под действием сильных окислителей. Препарат торк малотоксичен, ЛД для белых
50
крыс 2500 мг/кг (орально).
Принцип метода. Метод основан на извлечении торка из воды, яблок хлористым метиленом, хлороформом, петролейным эфиром или торка совместно с метаболитом из воды, яблок, цитрусовых, огурцов смесью хлороформ-уксусная кислота (75:1), очистке экстрактов на колонках с силикагелем КСК или оксидом алюминия и хроматографировании в тонком слое с последующим обнаружением зон локализации соединений путем обработки гематоксилином, пирокатехиновым фиолетовым, кверцетином, дитизоном.
Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 47.
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (p = 0,95, n = 5)
| Пластинка | Анализируемый объект | Анализируемое соединение <*> | Предел обнаружения, мкг | Объем (масса) анализируемой пробы, мл, г | Диапазон определяемых концентраций мг/кг, мг/л | Среднее значение определения, % |
|---|---|---|---|---|---|---|
| «Силуфол» УФ 254 Силикагель | Вода Яблоки, цитрусовые, огурцы Почва Яблоки | Т М Т М Т Т | 3 2,5 2 3 2,5 10 | 50 50 50 25 50 50 | 0,06 — 0,2 0,06 — 0,2 0,08 — 0,4 0,12 — 0,4 0,05 — 0,4 0,2 — 0,4 | 93,05 +/- 2,57 99,0 +/- 1,57 97,55 +/- 4,38 91,0 +/- 2,96 86,0 +/- 3,8 81,8 +/- 6,1 |
<*> Т — торк, М — метаболит торка.
Избирательность метода. Определению не мешают препараты акрекс, кельтан, антио, рогор, применяемые, как и торк, против растительноядных клещей. Определению могут мешать оловоорганические препараты, например пликтран и его метаболиты.
Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. Уксусная кислота ледяная х.ч. Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Хлороводородная кислота ч.д.а., 0,2 н водный раствор. Метилен хлористый ч. Серная кислота ч.д.а., 0,2 н водный раствор. Петролейный эфир (используется только фракция с т. кип. 40 - 60 °C) ч. Пирокатехиновый фиолетовый (индикатор) ч.д.а., 0,1-процентный раствор в этиловом спирте. Лимонная кислота х.ч., 0,5-процентный водный раствор. Гематоксилин х.ч., 0,1-процентный раствор в этиловом спирте. Кверцетин х.ч., 0,1-процентный раствор в этиловом спирте. Вода дистиллированная. Натрия сульфат безводный ч.д.а. Углерод четыреххлористый ч.д.а. Дитизон ч.д.а., 0,01-процентный раствор в четыреххлористом углероде. Анилин
хлороводородный ч.д.а., 0,02-процентный водный раствор. Этиловый спирт х.ч.
Бумажные фильтры обеззоленные ("синяя лента"). Силикагель КСК. Силикагель
Silpearl (Чехословакия) для тонкослойной хроматографии. Хроматографические
пластинки "Силуфол" УФ . Алюминия оксид для хроматографии II степени
254
активности. Стандартные растворы торка и его метаболита с содержанием 10 и 100 мкг в 1 мл смеси ацетон-уксусная кислота (75:1), готовят из х.ч.
веществ.
Приборы и посуда. Весы технические типа ВЛКТ. Весы аналитические типа ВЛДП. Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде. Испаритель ротационный ИР-1М или другого типа. Камера для хроматографирования. Пульверизатор стеклянный. Осветитель ультрафиолетовый. Баня водяная. Плита электрическая. Колбы: мерные на 25 и 100 мл; конические ТС на 50; 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл. Цилиндры мерные на 10; 20; 50; 100 и 250 мл. Воронки лабораторные. Стаканы химические ТС на 50 и 100 мл. Хроматографические колонки стеклянные диаметром 1,5 см и длиной 30 см. Воронки делительные на 250 мл. Пипетки на 0,1; 1; 5; 15 и 20 мл. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Пластинки стеклянные для хроматографии размером 9 х 12 см.
Подготовка к определению. Приготовление растворов. Стандартные растворы торка и его метаболита (100 мкг/мл). 25 мг х.ч. вещества помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют смесью ацетон-уксусная кислота (75:1). Отбирают 10 мл раствора в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1).
Стандартные растворы торка и его метаболита (10 мкг/мл). Из стандартного раствора торка и его метаболита (100 мкг/мл) отбирают 10 мл в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью ацетона с уксусной кислотой (75:1). Растворы хранят в прохладном защищенном от света месте не дольше 1 мес.
0,1-процентный раствор гематоксилина в 95-процентном этиловом спирте. 0,1 г гематоксилина помещают в колбу на 100 мл, добавляют 1 каплю концентрированной хлороводородной кислоты и доводят до метки 95-процентным этиловым спиртом. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.
0,1-процентный раствор пирокатехинового фиолетового. 0,1 г пирокатехинового фиолетового растворяют в 100 мл этилового спирта. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.
0,1-процентный раствор кверцетина в 96-процентном этиловом спирте. Кверцетин (0,5 г) растворяют в 300 мл этилового спирта при слабом нагревании, охлаждают, добавляют 25 мл концентрированной хлороводородной кислоты и доводят объем до 500 мл этиловым спиртом. Раствор хранят в темной склянке не дольше недели.
0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом углероде. Свежеприготовленный 0,01-процентный раствор дитизона в четыреххлористом углероде с последующей обработкой 0,02-процентным раствором хлороводородного анилина хранят в темном и прохладном месте, используя не дольше двух дней.
0,5-процентный раствор лимонной кислоты. Лимонную кислоту (0,5 г) растворяют в 99,5 мл дистиллированной воды. Раствор хранят не дольше 1 мес.
0,2 н раствор серной кислоты. Концентрированную серную кислоту (5,56 мл) разбавляют водой до 1 л. Хранят в сухом прохладном месте не дольше 3 мес.
Приготовление хроматографической колонки с силикагелем. Стеклянную колонку размером 1,5 х 30 см, снабженную краном и стеклянным фильтром, заполняют на 25 см силикагелем КСК (0,7 мм). Колонку перед употреблением промывают смесью хлороформа с уксусной кислотой (75:1).
Приготовление хроматографических пластинок. 20 г силикагеля смешивают в стеклянном стаканчике с 29 мл 0,5 н уксусной кислоты и перемешивают в течение 15 мин. стеклянной палочкой. Смесь наносят на три стеклянные пластинки размером 9 х 12 см. Сушат на воздухе 14 — 15 ч. Пластинку «Силуфол» помещают в хроматографическую камеру с 0,5 н уксусной кислотой. После того как растворитель поднимется до верхнего края, пластинку вынимают и сушат 1 ч на воздухе.
Приготовление колонки с оксидом алюминия. Оксид алюминия II степени активности, нейтральный (100 г) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 6 мл дистиллированной воды и перемешивают при встряхивании в течение 7 ч.
В хроматографическую колонку вкладывают ватный тампон, затем насыпают оксид алюминия слоем высотой 7 см и пропускают 20 — 25 мл растворителя (хлористый метилен, хлороформ).
Ход анализа. Экстракция, очистка экстрактов и хроматографирование. Пробу воды (50 мл) переносят в коническую колбу на 250 мл и заливают 15 мл смеси хлороформа с уксусной кислотой (75:1) (для определения торка и его метаболита) или 15 мл органического растворителя: хлороформ, хлористый метилен, петролейный эфир (для определения торка). Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 — 10 мин. Переносят смесь в делительную воронку и разделяют водный слой. Органическую фракцию собирают в отдельную колбу вместимостью 50 мл. Водный слой еще трижды экстрагируют тем же экстрагентом (порциями по 15 мл) и снова собирают в ту же колбу. Объединенные экстракты фильтруют через фильтр с безводным сульфатом натрия. Отгоняют растворитель на ротационном испарителе и остаток наносят на хроматографическую пластинку, обработанную уксусной кислотой. Рядом наносят стандартные растворы торка и метаболита, содержащие 1 — 5 мкг соединений, и хроматографируют в системе подвижных растворителей гексан-ацетон (4:1). После того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 30 мин. и проявляют хроматограмму.
Воздушно-сухую измельченную почву (50 г) помещают в коническую колбу и заливают 100 мл органического растворителя. Экстрагируют торк при встряхивании в течение 15 мин. Затем экстракт отделяют и фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракцию в течение 7 — 10 мин. повторяют еще дважды, заливая по 50 мл растворителя. Объединенные экстракты упаривают на роторном испарителе до небольшого объема (1 — 2 мл). Остаток наносят количественно полоской с левой стороны на пластинку размером 9 х 12 см с силикагелем и хроматографируют в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). Когда фронт растворителей поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 30 мин., затем поворачивают пластинку против часовой стрелки на 90°, слева наносят стандартный раствор, содержащий 1 — 5 мкг торка, и хроматографируют в той же подвижной фазе. После того как растворители поднимутся на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму.
Измельченный растительный материал (яблок, цитрусовых, огурцов) (25 г) помещают в коническую колбу на 250 мл и заливают 50 мл смеси органического растворителя с уксусной кислотой (75:1). Экстрагируют на встряхивателе в течение 5 мин. Экстракт отделяют, а растительный материал экстрагируют еще трижды порциями растворителя по 15 — 20 мл. Объединенные экстракты пропускают через колонку с силикагелем КСК, собирая элюат в колбу прибора для отгонки растворителя и упарив до 1 — 2 мл, остаток наносят на хроматографическую пластинку. Экстракты можно очищать также, предварительно упарив пробу до 1 — 2 мл, внеся остаток в подготовленную колонку с оксидом алюминия и промыв ее 50 мл хлороформа. Элюат упаривают до 1 — 2 мл и наносят на хроматографическую пластинку. Рядом наносят стандартные растворы торка и его метаболита, содержащие 1 — 5 мкг соединений, и хроматографируют в подвижной фазе гексан-ацетон (4:1). После того как растворитель поднимется на высоту 10 см, пластинку вынимают, сушат на воздухе 1 ч и проявляют хроматограмму одним из четырех способов: 1) опрыскивание 1 мл 0,1-процентного раствора гематоксилина в 95-процентном этиловом спирте, УФ-облучение в течение 5 мин. и опрыскивание 1 мл 0,5-процентного водного раствора лимонной кислоты; 2) УФ-облучение в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл 0,1-процентного этанольного раствора пирокатехинового фиолетового; 3) опрыскивание 1 мл 0,2 н раствора серной кислоты, УФ-облучение в течение 10 мин. и опрыскивание 1 мл 0,1-процентного этанольного раствора кверцетина; 4) опрыскивание 1 — 2 мл 0,01-процентного раствора дитизона в четыреххлористом углероде, опрыскивание 0,02-процентным раствором (1 — 2 мл) хлороводородного анилина.
При наличии торка и его метаболита в пробе на хроматограмме, обработанной гематоксилином, зоны локализации соединений проявляются в виде сиреневых пятен на голубом фоне; при обработке пирокатехиновым фиолетовым
- в виде синих пятен на светло-коричневом фоне; кверцетином — в виде желтых
пятен на светлом фоне; дитизоном - в виде желтых пятен на бледно-розовом фоне. Величины R торка и его метаболита равны соответственно 0,66 +/- 0,01
f
и 0,37 +/- 0,01. Содержание торка и его метаболита в пробе находят путем сравнения размеров и интенсивности окраски пятен с пятнами стандартных
растворов.
Обработка результатов анализа. Концентрацию торка и его метаболита (X, мг/л, мг/кг) рассчитывают по формуле:
A
A — количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;
P — объем (вода) или навеска (почва, растительный материал) исследуемой пробы, взятой для анализа, мл, г.
Требования безопасности. Следует соблюдать все необходимые меры безопасности при работе в химических лабораториях.