Методические указания по экспресс-определению микотоксинов в зерне, кормах и компонентах для их производства
(утв. Россельхозом 10.10.2005 № 5-1-14/1001)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Утверждаю Начальник Управления ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству В. А. Апалькин 10 октября 2005 г. № 5-1-14/1001
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ, КОРМАХ И КОМПОНЕНТАХ ДЛЯ ИХ ПРОИЗВОДСТВА
1. Общие положения
1.1. Настоящие методические указания предназначены для экспресс-определения микотоксинов в пробах зерна, кормов и компонентов для их производства методами иммунохимического анализа.
1.2. В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Специфическое иммунохимическое взаимодействие происходит в объеме иммуносорбента (колонки Aflascan, Ochrascan), в объеме и на поверхности полистиролового планшета (Aflaplate, Ridascreen), на поверхности мембраны (Aflacard, Ochracard) или в капиллярных каналах иммунохроматографической полоски (Rida Quick). В процессе реакции антигены (микотоксины), содержащиеся в экстрактах исследуемых образцов, образуют комплекс со специфическими антителами. Иммуносорбированные микотоксины затем элюируются денатурирующим растворителем и наблюдаются по собственной флуоресценции (Aflascan, Ochrascan), детектируются путем непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (Aflaplate, Ridascreen, Aflacard, Ochracard), либо методами иммунохроматографии (Rida Quick).
1.3. Основными компонентами реакции являются антигены (микотоксины), содержащиеся в экстрактах испытуемых образцов, специфические антитела к определяемым антигенам и конъюгаты определяемых антигенов с пероксидазой или коллоидным золотом.
1.4. При выборе процедуры исследования руководствуются таблицами 1 - 8.
Определение суммы афлатоксинов B1, B2, G1 и G2
| Метод | Результат | Предел обнаружения, мг/кг | Время исследования, мин | |
|---|---|---|---|---|
| Ridascreen FAST Citrinin | Иммуноферментный | Количественный | 0,05 | 30 |
Определение дезоксиниваленола (ДОН)
| Метод | Результат | Предел обнаружения, мг/кг | Время исследования, мин | |
|---|---|---|---|---|
| Ridascreen FAST Зеараленон | Иммуноферментный | Количественный | 0,05 | 30 |
| Ridascreen Зеараленон | Иммуноферментный | Количественный | 0,00175 | 170 |
| Метод | Результат | Предел обнаружения, мг/кг | Время исследования, мин | |
|---|---|---|---|---|
| Ridascreen FAST T-2 toxin | Иммуноферментный | Количественный | 0,05 | 30 |
| Ridascreen T-2 toxin | Иммуноферментный | Количественный | 0,005 | 120 |
2. Необходимое оборудование
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Лабораторный таймер электронный
Мельница для размола сыпучих продуктов типа ЛЗМ, блендер типа Waring или гомогенизатор типа «Ультратюракс» с частотой 8000 — 24000 об/мин
ИФА-анализатор (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Одноканальная автоматическая пипетка на 50 и 100 мкл
Одноканальная автоматическая пипетка на 1000 мкл
8-канальная автоматическая пипетка на 50 мкл
8-канальная автоматическая пипетка на 250 мкл
Наконечники для автоматических пипеток
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 100 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью 25 мл и 100 мл
Стакан лабораторный ВН-50 ХС с меткой по ГОСТ 25336
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 100 мл типа КН-1-100-29/32 по ТУ 92-891.029-91
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стеклянные цилиндры для твердофазной экстракции
Штатив для пробирок на 10 гнезд
Воронка лабораторная В-56-80 ХС по ГОСТ 25336
Фильтры обеззоленные, красная лента, 100 x 15 см
Разовые фильтры на шприц или стеклянные микроволоконные фильтры GMF
3. Необходимые реактивы и материалы
Колонки Aflascan и Ochrascan, полоски Rida Quick, карточки Aflacard и Ochracard, планшеты Ridascreen в стандартной комплектации
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
4. Порядок отбора проб и подготовка к проведению исследований
4.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб.
Пробы доставляют в лабораторию не позднее 6 часов после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодном темном месте.
4.2 Приготовление вспомогательных растворов
4.2.1 Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
4.2.2 Приготовление 70% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 70 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
4.2.3 Приготовление 60% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 60 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
4.2.4 Приготовление 20% раствора метанола (только для колонок Ochrascan)
В мерную колбу на 100 мл помещают 20 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
4.2.5 Приготовление десорбирующего раствора (только для колонок Ochrascan)
Десорбирующий раствор представляет собой смесь метанола (98%) с уксусной кислотой (2%).
Для анализа каждой пробы необходимо 1,5 мл десорбирующего раствора. Приготовьте нужное количество раствора. Можно приготовить большее количество десорбента при условии его последующего хранения в емкости с плотно закрывающейся винтовой пробкой во избежание испарения метанола. Десорбирующий раствор можно хранить при комнатной температуре (22 °C) в течение одного месяца с даты приготовления.
4.2.6 Приготовление моющего буферного раствора
Приготовление 10 мМ фосфатного буферного раствора (только для Ridascreen FAST Aflatoxin SC, Ridascreen Aflatoxin B1 30/15, Ridascreen FAST DON, Ridascreen DON)
В мерную колбу на 1000 мл переносят содержимое пакетика с буферным составом и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
При использовании Aflaplate моющий буфер готовится путем смешивания 1 части 25-кратного концентрированного буфера и 24 частей дистиллированной воды. Срок хранения раствора — 4 недели при температуре 4 °C.
5. Подготовка проб для исследования
5.1. Взвесьте 5 г размолотой пробы в колбе с притертой пробкой, прилейте в колбу 25 мл 70%-го водного раствора метанола <*>.
<*> При необходимости навеска пробы может быть увеличена с пропорциональным увеличением объема экстрагента.
ПРИМЕЧАНИЕ: при использовании Ridascreen FAST Ochratoxin экстракция выполняется 12,5 мл 70%-го водного раствора метанола, при использовании Aflaplate и Aflascan экстракция 50 г пробы выполняется 60% раствором метанола с добавкой 4 г хлорида натрия на 250 мл раствора, при использовании Aflacard и Ochracard 50 г пробы экстрагируются 100 мл 80% раствора метанола, при использовании Ochrascan 10 г пробы экстрагируются 200 мл 1% раствора бикарбоната натрия, при использовании Ridascreen Quick DON 1 г пробы экстрагируются 10 мл экстрагирующего буфера из комплекта поставки, при использовании Ridascreen DON EXPRESS 5 г пробы экстрагируются 50 мл воды, при использовании Ridascreen FAST DON и Ridascreen DON 5 г пробы экстрагируются 100 мл воды, при использовании Ridascreen DON 5 г пробы экстрагируются 25 мл воды.
5.2. Тщательно встряхивайте колбу в течение трех минут (вручную или с помощью лабораторного встряхивателя). Высокую эффективность экстракции можно обеспечить с помощью гомогенизатора или блендера.
5.3. Профильтруйте раствор через фильтровальную бумагу типа «красная лента».
5.4. При дальнейшей работе с планшетами Ridascreen, Ridascreen FAST, Ridascreen EXPRESS, Aflaplate смешайте в пробирке 1 мл фильтрата и 1 мл дистиллированной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: при анализе на дезоксиниваленол фильтрат не разбавляется.
5.5А. Процедура очистки фильтратов при работе с иммуноаффинными колонками Aflascan
5.5А.1. Отфильтруйте 50 — 100 мл экстракта полученного по п. 5.2. Руководствуясь нижеприведенной таблицей перенесите выбранный объем фильтрата в стеклянный цилиндр над иммуноаффинной колонкой.
Примечание: оставшийся объем фильтрата может быть использован для подтверждения результатов анализа хроматографическими методами (ТСХ или ВЭЖХ) с предварительной иммуноаффинной очисткой фильтратов на колонках AFLAPREP.
5.5А.2. Сорбция афлатоксинов на колонке
Снимите пробку с нижней части колонки. Установите шприц с полностью вытянутым поршнем на верхнюю часть стеклянного цилиндра через резиновый переходник. Убедитесь в герметичности соединения. Подставьте под колонку стеклянный стаканчик. Создавая небольшое давление на входе в цилиндр, пропустите через колонку выбранный объем фильтрата со скоростью 2 — 3 мл/мин.
Примечание: для того чтобы обеспечить количественную сорбцию афлатоксинов на колонке необходимо соблюдать рекомендованную скорость пропускания фильтрата через колонку (2 — 3 мл/мин).
Примечание: повышение чувствительности определения достигается при увеличении объема фильтрата, пропускаемого через колонку (см. Таблицу 9).
Примечание: не допускайте контакта метанольных экстрактов с резиновым переходником, резиновыми перчатками и внешней поверхностью колонок, поскольку это может повлиять на результаты определения. Будьте особенно внимательны при элюировании афлатоксинов с колонки на последней стадии иммуноаффинной очистки.
Снимите шприц с цилиндра. Перенесите 10 мл дистиллированной воды в стеклянный цилиндр, установите шприц и пропустите воду через колонку со скоростью примерно 5 мл/мин. Убедившись, что в колонке не осталось воды, повторите промывку еще раз.
Установите под колонкой чистую стеклянную пробирку или виалку. Снимите шприц с цилиндра. Перенесите в цилиндр над колонкой 1,0 мл метанола. Установите шприц и медленно пропустите метанол через колонку со скоростью не более чем одна капля в секунду, собирая элюат в подготовленную чистую пробирку или виалку.
Для того, чтобы обеспечить максимально полную десорбцию афлатоксинов, метанол должен находиться в контакте с антителами не менее, чем 30 секунд в процессе элюирования. Для этого, с помощью шприца, нужно создать разряжение на входе в колонку, чтобы элюат медленно пошел вверх по колонке. Эту процедуру нужно повторить трижды. Соберите весь элюат в подготовленную чистую пробирку или виалку.
5.5А.5. Удаление мешающих примесей из элюата
Внесите в пробирку (виалку) с элюатом 1 мл дистиллированной воды и 1 мл хлороформа. Закройте крышку и осторожно встряхните пробирку (виалку). Оставьте пробирку (виалку) в покое до расслоения на 2 фазы. Снимите иммуноаффинную колонку с цилиндра и утилизируйте ее. Присоедините наконечник с сорбентом флурисил к нижней части стеклянного цилиндра. С помощью пипетки осторожно отберите из пробирки (виалки) нижний хлороформенный слой и перенесите его в стеклянный цилиндр. Установите шприц и медленно пропустите хлороформенный раствор через наконечник с сорбентом флурисил.
5.5Б. Процедура очистки фильтратов при работе с иммуноаффинными колонками Ochrascan
5.5Б.1. Отфильтруйте 50 мл экстракта полученного по п. 5.2.
5.5Б.2. Для определения 4 мкг/кг охратоксина перенесите в стеклянный цилиндр над колонкой 20 мл фильтрата порциями по 10 мл (этот объем фильтрата эквивалентен 1 г пробы). Позвольте раствору протечь через колонку под влиянием гравитации, либо установите шприц на стеклянный цилиндр и создавая небольшое давление на входе в цилиндр, пропустите фильтрат через колонку со скоростью 2 — 3 мл/мин.
Для определения 2 мкг/кг охратоксина перенесите в стеклянный цилиндр над колонкой 40 мл фильтрата порциями по 10 мл (этот объем фильтрата эквивалентен 2 г пробы). Позвольте раствору протечь через колонку под влиянием гравитации, либо установите шприц на стеклянный цилиндр и создавая небольшое давление на входе в цилиндр, пропустите фильтрат через колонку со скоростью 2 — 3 мл/мин.
5.5Б.3. Перенесите 20 мл моющего буфера для зерновых культур (20% раствор метанола) в стеклянный цилиндр, установите шприц и пропустите буфер через колонку со скоростью примерно 5 мл/мин. Подсушите колонку, пропуская через нее воздух.
5.5Б.4. Установите под колонкой чистую пробирку. Снимите шприц с цилиндра. Перенесите в цилиндр над колонкой 1,5 мл десорбирующего раствора. Установите шприц и медленно пропустите раствор через колонку со скоростью не более чем одна капля в секунду, собирая элюат в подготовленную пробирку. Для того, чтобы обеспечить максимально полную десорбцию охратоксина, в процессе элюирования проводится обращение потока элюата. Для этого, с помощью шприца, нужно создать разряжение на входе в колонку, чтобы элюат медленно пошел вверх по колонке. Эту процедуру нужно повторить трижды. Соберите весь элюат в подготовленную пробирку. Пропустите воздух через колонку, для того, чтобы собрать в пробирке последние капли элюата.
5.5Б.5. Внесите в пробирку с элюатом 6 мл готового фосфатного буфера и 3 мл хлороформа. Туго закрутите крышку пробирки, обеспечивая полную герметичность и энергично встряхните пробирку. Оставьте пробирку в покое до полного расслоения на 2 фазы. Осторожно удалите верхний слой водной фазы.
Примечание: если элюат или нижний хлороформенный слой получаются мутными, это может привести к высокому фоновому уровню флуоресценции на стадии детекции охратоксина. В этом случае рекомендуется повторно отфильтровать ранее полученные фильтраты и повторить процедуру иммуноаффинной очистки на колонках OCHRASCAN.
5.5Б.6. Снимите иммуноаффинную колонку с цилиндра и утилизируйте ее. Для просушки стеклянного цилиндра промойте его 5 мл хлороформа. Присоедините наконечник с сорбентом флурисил к нижней части стеклянного цилиндра. С помощью автоматической пипетки осторожно отберите из пробирки нижний хлороформенный слой и перенесите его в стеклянный цилиндр. Установите шприц и медленно пропустите хлороформенный раствор через наконечник с сорбентом флурисил со скоростью 2 — 3 мл/мин.
5.5Б.7. Протрите внешнюю поверхность наконечника с сорбентом флурисил салфеткой, немного смоченной метанолом, для того чтобы снять с наконечника частички пыли. Протирайте наконечник таким образом, чтобы избежать контакта метанола с сорбентом.
5.5В. Процедура очистки фильтратов при работе с карточками Aflacard Total
5.5В.1. Отфильтруйте как минимум 10 мл экстракта полученного по п. 5.2.
5.5В.2. Поместите 5 мл фильтрата на колонку с сорбентом (входит в комплект Aflacard). Создавая небольшое давление на входе в колонку с помощью поршня, пропустите раствор по каплям через колонку в пластиковую пробирку. Если очищенный раствор кажется мутным, следует пропустить его через ту же колонку еще раз с меньшей скоростью.
5.5В.3. С помощью таблицы 10 выберите необходимую чувствительность анализа и соответственно нужную пропорцию разведения растворов.
Смешайте в градуированной пластиковой пробирке необходимые количества очищенного фильтрата и 80% водного раствора метанола в выбранной пропорции. Закройте пробирку крышкой и переверните ее несколько раз. Перенесите 1 мл раствора из градуированной пробирки в пробирку с 3 мл разбавляющего буфера. Закройте крышкой и переверните пробирку несколько раз. Очищенный и разбавленный экстракт готов для последующего анализа с помощью карточки AFLACARD TOTAL.
Пропорции разбавления растворов
5.5Г. Процедура очистки фильтратов при работе с карточками Aflacard B1
5.5Г.1. Отфильтруйте как минимум 10 мл экстракта полученного по п. 5.2.
5.5Г.2. При необходимости определения афлатоксина B1 на уровне 2 мкг/кг поместите 5 мл фильтрата на колонку с сорбентом (входит в комплект набора). Создавая небольшое давление на входе в колонку с помощью поршня, пропустите раствор по каплям через колонку в поставляемую пластиковую пробирку. Если очищенный раствор кажется мутным, следует пропустить его через ту же колонку еще раз с меньшей скоростью.
5.5Г.3. Перенесите 1 мл очищенного раствора в пробирку с 3 мл разбавляющего буфера. Закройте крышкой и переверните пробирку несколько раз. Очищенный и разбавленный экстракт готов для последующего анализа с помощью тест-карточки AFLACARD B1.
5.5Г.4. При необходимости установки других пороговых величин (5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг, 50 мкг/кг, 100 мкг/кг) фильтраты следует разбавить перед выполнением последующих операций. С помощью таблицы 11 выберите необходимую чувствительность анализа и соответственно нужную пропорцию разведения фильтратов.
Пропорции разбавления растворов
5.5Г.5. Смешайте в пробирке необходимые количества фильтрата и 80% водного раствора метанола в выбранной пропорции. Закройте пробирку крышкой и переверните ее несколько раз.
5.5Г.6. Перенесите 1 мл разбавленного фильтрата в пробирку с 3 мл разбавляющего буфера. Закройте крышкой и переверните пробирку несколько раз.
5.5Г.7. Перенесите весь раствор на колонку с сорбентом (входит в комплект набора). Создавая небольшое давление на входе в колонку с помощью поршня, пропустите раствор по каплям через колонку в пластиковую пробирку. Если очищенный раствор кажется мутным, следует пропустить его через ту же колонку еще раз с меньшей скоростью.
5.5Г.8. Разбавленный и очищенный экстракт готов для последующего анализа с помощью тест-карточки AFLACARD B1.
5.5Д. Процедура очистки фильтратов при работе с карточками Aflacard T20
5.5Д.1. Отфильтруйте как минимум 10 мл экстракта полученного по п. 5.2.
5.5Д.2. Откройте крышку пробирки с разбавляющим буфером, добавьте в пробирку 200 мкл фильтрата. Закройте крышку и перемешайте раствор, переворачивая пробирку.
5.5Д.3. Разбавленный экстракт готов для последующего анализа с помощью тест-карточки AFLACARD T20.
5.5Е. Процедура очистки фильтратов при работе с карточками Ochracard
5.5Е.1. Отфильтруйте как минимум 10 мл экстракта полученного по п. 5.2.
5.5Е.2. Внесите 9 мл фильтрата и 18 мл фосфатного буфера в пробирку для разбавления фильтрата. Закройте крышку пробирки и перемешайте раствор, переворачивая пробирку.
5.5Е.3. Присоедините разовый шприц-фильтр к нижней части стеклянного цилиндра. Снимите верхнюю крышку колонки с сорбентом и присоедините колонку к нижней части шприц-фильтра через адаптер. Закрепите полученную сборку на лабораторном штативе. Поставьте под колонку лабораторный стаканчик.
5.5Е.4. Руководствуясь нижеприведенной таблицей (см. таблицу 12) внесите выбранный объем разбавленного фильтрата в стеклянный цилиндр, чтобы обеспечить скрининг исследуемых проб на необходимом уровне концентрации охратоксина (в цилиндр следует последовательно вносить аликвоты объемом 10 мл или меньше).
5.5Е.5. Снимите с колонки нижнюю пробку. Создавая небольшое давление на входе в колонку с помощью шприца, медленно пропустите раствор через колонку со скоростью 1 капля в секунду.
| Пороговый уровень охратоксина для скрининга зерна | ||||
| 3 мкг/кг | 4 мкг/кг | 5 мкг/кг | 10 мкг/кг | |
| Необходимый объем раствора, пропускаемый через колонку | 25 мл | 20 мл | 15 мл | 7,5 мл |
5.5Е.6. Продуйте воздух через колонку с помощью шприца. Внесите в верхний стеклянный цилиндр 5 мл фосфатного буфера и промойте колонку (не нужно подсушивать стеклянный цилиндр). Снимите промежуточный шприц-фильтр с колонки и утилизируйте его. Подсоедините колонку напрямую к стеклянному цилиндру через адаптер.
5.5Е.7. Поместите пластиковую пробирку для сбора растворов непосредственно под колонку. Внесите в стеклянный цилиндр 1 мл метанола. Осторожно элюируйте сорбированный на колонке охратоксин, медленно, по каплям, пропуская через колонку метанол. Для того, чтобы обеспечить максимально полную десорбцию охратоксина с колонки, следует трижды прокачивать одну и ту же порцию метанола через колонку обратным ходом, каждый раз осторожно вытягивая поршень шприца. После элюирования охратоксина внесите 2 мл разбавляющего буфера из комплекта поставки в стеклянный цилиндр, пропустите через колонку и соберите в ту же пробирку. Таким образом, суммарный объем раствора в пробирке составит 3 мл.
5.5Е.8. Продуйте воздух через колонку с помощью шприца, для того, чтобы собрать в пробирку капли раствора, еще оставшиеся в колонке. Закройте пробирку и переверните ее несколько раз для перемешивания раствора. Раствор готов для анализа на тест-карточке OCHRACARD.
6. Постановка реакции
6.1 Работа с планшетами Ridascreen, Ridascreen FAST, Ridascreen EXPRESS, Aflaplate
6.1.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений. Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов.
6.1.2. Добавьте по 50 мкл (100 мкл для Aflaplate) стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.
6.1.3. Осторожно встряхните флакон с готовым конъюгатом, избегая образования пены. Добавьте по 50 мкл (100 мкл для Aflaplate) препарата конъюгата в каждую лунку.
6.1.4. Осторожно встряхните флакон с готовым антителом, избегая образования пены. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 10 мин (+/- 1 мин). Не встряхивайте планшет во время инкубации!
ПРИМЕЧАНИЕ: при работе с планшетами Ridascreen EXPRESS время первой инкубации составляет 3 минуты, при работе с планшетами Ridascreen FAST DON время первой инкубации составляет 5 минут, при работе с планшетами Ridascreen Aflatoxin B1 30/15, Ridascreen DON, Ridascreen Fumonisin время первой инкубации составляет 30 минут, при работе с планшетами Ridascreen T-2 время первой инкубации составляет 60 минут, при работе с планшетами Ridascreen Ochratoxin, Ridascreen Zearalenon, Aflaplate антитела не дозируются, время первой инкубации составляет 2 часа.
6.1.5. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза (4 раза для Aflaplate).
ПРИМЕЧАНИЕ: при работе с планшетами Ridascreen FAST DON, Ridascreen DON, Ridascreen FAST Aflatoxin SC, Ridascreen Aflatoxin B1 30/15, Aflaplate отмывка планшета производится моющим буферным раствором (см. п. 4.2.4).
6.1.6. Добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата или последовательно 50 мл субстрата и 50 мл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут (+/- 0,5 мин) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!
ПРИМЕЧАНИЕ: при работе с планшетами Ridascreen EXPRESS время второй инкубации составляет 2 минуты, при работе с планшетами Ridascreen FAST DON время второй инкубации составляет 3 минуты, при работе с планшетами Ridascreen Aflatoxin B1 30/15, Ridascreen DON время второй инкубации составляет 15 минут, при работе с планшетами Ridascreen T-2, Ridascreen Zearalenon время второй инкубации составляет 30 минут.
6.1.7. Добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.
6.2 Работа с иммунохроматографическими полосками Rida Quick DON
6.2.1. Внесите 120 мкл супернатанта (см. пробоподготовку п. 5.1 - 5.3) на приемную мембрану тест-полоски.
6.2.2 Считайте результат через 5 минут.
6.3 Работа с карточками AFLACARD TOTAL, AFLACARD B1, AFLACARD T20, OCHRACARD
Выньте карточки из холодильника и оставьте при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием.
6.3.1. Снимите защитную пленку с карточки. В каждом порту видны два голубоватых пятна (после нанесения реагентов эти пятна обесцветятся).
6.3.2. С помощью пипетки перенесите 500 мкл (250 мкл для AFLACARD T20) подготовленного экстракта (см. пп. 5.5В.3, 5.5Г.8, 5.5Д.3, 5.5Е.8) в один порт карточки. В течение 5 минут (1 мин для AFLACARD T20) раствор должен впитаться в мембрану карточки.
6.3.3. После впитывания экстракта перенесите в порт карточки 100 мкл (3 капли для AFLACARD T20) готового конъюгата и дождитесь его впитывания в мембрану.
6.3.4. После впитывания конъюгата внесите в порт 100 мкл (3 капли для AFLACARD T20) моющего буфера. Позвольте раствору впитаться в мембрану и протрите поверхность вокруг порта фильтровальной бумагой.
6.3.5. Внесите в порт карточки 100 мкл (3 капли для AFLACARD T20) субстрата. Включите таймер. В течение 5 минут (2 мин для AFLACARD T20) на поверхности мембраны будет развиваться цветная реакция.
6.3.6. Через 5 минут (2 мин для AFLACARD T20) после добавления субстрата внесите в порт карточки 100 мкл (3 капли для AFLACARD T20) стоп-раствора. После впитывания стоп-раствора в мембрану выполняется визуальная интерпретация результатов анализа.
7. Учет результатов
7.1 Полоски Rida Quick
Верхняя черта в реакционном окне полоски называется контрольной.
Испытание считается действительным, если через 5 минут после внесения пробы в приемное окно полоски в аналитическом окне появляется ясно различимая контрольная черта (полоса).
В течение нескольких дней проявившиеся черточки на полоске являются стабильными.
7.1.1 Отрицательный результат
Исследуемая проба не содержит ДОН (или содержит ДОН на уровне, менее 1 мг/кг), если на полоске ясно различимы контрольная и аналитическая черта.
7.1.2 Положительный результат
Исследуемая проба контаминирована ДОН, если на полоске проявляется контрольная черта, а аналитическая отсутствует или слабо различима.
7.2 Карточки AFLACARD TOTAL, AFLACARD B1, AFLACARD T20, OCHRACARD
Если в контрольной зоне появляется ясно различимое пурпурное пятно, результаты считаются действительными. Цвет пятна в контрольной и аналитической зоне не обязательно должен быть одинаковой интенсивности.
7.2.1. Результаты анализа интерпретируются как отрицательные (содержание афлатоксинов в пробе меньше, чем установленная чувствительность определения), если на поверхности мембраны можно наблюдать два цветных пятна.
7.2.2. Результаты анализа интерпретируются как положительные (содержание афлатоксинов в пробе больше, чем установленная чувствительность определения), если на поверхности мембраны можно наблюдать одно цветное пятно только в контрольной зоне мембраны.
7.3 Колонки Aflascan
Поместите наконечник с сорбентом флурисил и компаратор в темный бокс, оснащенный УФ-лампой на 366 нм и наблюдайте голубую флуоресценцию от наконечника, сравнивая ее с флуоресценцией компаратора. Полуколичественный результат анализа афлатоксинов в мкг/кг определяется по наиболее близкому по интенсивности флуоресценции стандарту компаратора при учете пропущенного через колонку объема фильтрата соответственно таблице 9.
Компаратор AFLASCAN имеет 2 шкалы:
Шкала, соответствующая объему фильтрата 10 мл:
0 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг, 50 мкг/кг, 100 мкг/кг.
Шкала, соответствующая объему фильтрата 25 мл:
0 мкг/кг, 4 мкг/кг, 8 мкг/кг, 20 мкг/кг, 40 мкг/кг.
7.4 Колонки Ochrascan
Не более, чем через 20 мин после исполнения п. 5.5Б.7, поместите наконечник с сорбентом флурисил и компаратор в темный бокс, оснащенный УФ-лампой на 366 нм, мощностью 6 Вт. Расстояние от наконечника и компаратора до УФ-лампы должно быть 5 — 10 см. Наблюдайте голубую флуоресценцию от наконечника, сравнивая ее с флуоресценцией компаратора. Полуколичественный результат анализа охратоксина в мкг/кг определяется по наиболее близкому по интенсивности флуоресценции стандарту компаратора при учете пропущенного через колонку объема фильтрата.
Если содержание охратоксина контролируется на уровне 4 мкг/кг (через колонку пропущено 20 мл фильтрата), для интерпретации результатов анализа используется верхняя шкала компаратора: 0 мкг/кг, 4 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг.
Если содержание охратоксина контролируется на уровне 2 мкг/кг (через колонку пропущено 40 мл фильтрата), для интерпретации результатов анализа используется нижняя шкала компаратора: 0 мкг/кг, 2 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг.
Сорбированный охратоксин A наблюдается как узкая полоска голубой флуоресценции в верхней части наконечника флурисил.
Примечание: голубая флуоресценция окошек компаратора служит образцом для атрибуции флуоресценции наконечника. Иногда, при анализе сложных пигментированных образцов, на наконечнике можно наблюдать желтую или зеленую флуоресценцию, которая не относится к флуоресценции охратоксина.
7.5 Планшеты Ridascreen EXPRESS
Если раствор в лунке с исследуемым экстрактом приобрел цвет, который бледнее или такой же, как цвет в лунке со стандартом, результат считается положительным, то есть концентрация микотоксинов в пробе равна или выше, чем концентрация микотоксинов в стандартном растворе.
Если раствор в лунке с исследуемым экстрактом приобрел цвет, который темнее относительно стандарта, результат считается отрицательным, то есть концентрация микотоксинов в пробе ниже, чем концентрация микотоксинов в стандартном растворе.
7.6 Планшеты Ridascreen FAST, Ridascreen и Aflaplate
Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг или мг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат.
Концентрация микотоксинов в исследуемых растворах считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, RIDA Soft. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.
Начальник отдела Управления ветеринарного надзора В. И. Белоусов
ФГУ ЦНМВЛ Г. В. Иванова Л. П. Сатюкова