Методические указания по определению ронита и его метаболитов в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 4999-89)
8 июня 1989 г. № 4999-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОНИТА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГТ и ПЗ).
Краткая характеристика препарата. Ронит - S,N-диэтил-N- циклогексилтиокарбамат. Брутто-формула C H NOS. Молекулярная масса 215,4.
11 21
Светло-желтая маслянистая жидкость с т. кип. 145 - 146 °C при 1300 Па. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей. Растворимость в
воде при 22 °C 100 мг/л. Применяется в качестве гербицида в посевах свеклы.
Принцип метода. Метод основан на экстракции ронита из биологических сред органическим растворителем (хлороформ, гексан) и последующем определении методами тонкослойной (ТСХ) и (или) газожидкостной (ГЖХ) хроматографии. В методе ТСХ используется подвижная фаза на основе гексана, проявляющие реагенты — бромфеноловый синий с нитратом серебра, 2,6-дибром-N-хлорхинонимин или реактив Драгендорфа. В методе ГЖХ используют ТИД, неподвижные фазы SE-30, XE-60, DC-550.
Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 90.
РОНИТА В БИОСРЕДАХ (n = 5 и p = 0,95)
| Анализируемый объект | Метод | Нижний предел обнаружения, мкг/мл, мкг/г, мкг/кв. см | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, % | Доверительный интервал среднего определения, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Желудочный сок, | ГЖХ | 0,02 | 91,9 | +/- 5,5 | +/- 6,8 |
| слюна | ТСХ | 0,25 | 81,2 | +/- 8,2 | +/- 10,2 |
| Желчь | ГЖХ ТСХ | 0,02 0,25 | 86,8 77,6 | +/- 6,4 +/- 8,2 | +/- 7,9 +/- 0,2 |
| Моча | ГЖХ ТСХ | 0,0008 0,01 | 92,8 85,0 | +/- 5,4 +/- 7,6 | +/- 6,7 +/- 9,4 |
| Кровь | ГЖХ ТСХ | 0,04 0,5 | 89,8 85,4 | +/- 5,9 +/- 8,5 | +/- 7,3 +/- 10,5 |
| Кожа | ГЖХ ТСХ | 0,04 0,5 | 90,1 83,4 | +/- 5,5 +/- 8,1 | +/- 6,9 +/- 10,1 |
| Смывы с | ГЖХ | 0,002 | 92,9 | +/- 5,15 | +/- 6,4 |
| поверхности кожи | ТСХ | 0,03 | 85,0 | +/- 7,16 | +/- 8,9 |
Избирательность метода. Определению ронита не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: диазинон, эптам, метоксихлор, линдан.
Реактивы, растворы, материалы. Ронит х.ч. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат х.ч., 5-процентный водный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона). Бромфеноловый синий х.ч. Лимонная кислота х.ч., 2-процентный раствор. Нитрат висмута основной ч. Йодид калия х.ч. Серная кислота х.ч., 40-процентный и 20-процентный растворы. Проявляющие реагенты: № 1 — бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл 0,5-процентным водно-ацетоновым раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 мес.; № 2 — 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане. Хранят в темной склянке в холодильнике до 1 мес.; № 3 — реактив Драгендорфа. Взвешивают 0,85 г нитрата висмута, приливают 40 мл воды и 10 мл 40-процентного раствора серной кислоты. К полученному раствору прибавляют раствор, содержащий 8 г йодида калия в 20 мл воды. Для опрыскивания хроматографических пластинок к 6 мл исходного раствора приливают 6 мл 20-процентной серной кислоты и 6 мл воды. Исходный раствор можно хранить в холодильнике несколько месяцев.
Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а. (или гипс медицинский). Хроматографические пластинки «Силуфол» размером 15 x 15 см. Приготовление хроматографических пластинок с оксидом алюминия: 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см или на 7 — 8 пластинок размером 12 x 15 см. Этанол х.ч. Подвижная фаза: гексан-эфир (3:1) для оксида алюминия; гексан-бензол (7:12), гексан-ацетон (4:1) или гексан-эфир (2:1) для пластинок «Силуфол». Азот, водород в баллонах с редукторами. Насадка хроматографической колонки: хроматон N-AW-DMCS (0,16 — 0,20 мм) с 5% SE-30 либо с 5% XE-60 или 5% DC-550. Бензол х.ч. Диэтиловый эфир х.ч. Вата гигроскопическая, обезжиренная. Приготовление стандартного раствора ронита в хлороформе и гексане с содержанием действующего вещества 100 мкг/мл. Вначале готовят исходный раствор. Для этого взвешивают мерную колбу с небольшим количеством растворителя на аналитических весах. Затем вносят несколько капель пестицида и снова взвешивают. Разница в навеске соответствует массе растворенного вещества. Вычисляют содержание пестицида в 1 мл после доведения растворителем объема раствора в колбе до метки. Из исходного раствора готовят соответствующим разбавлением раствор, содержащий 100 мкг/мл препарата, а из него для ГЖХ — растворы, содержащие 10; 2 и 0,2 мкг/мл препарата.
Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный вакуумный испаритель с набором колб. Газовый хроматограф с ТИД. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы: мерные; грушевидные (для отгонки растворителей). Цилиндры. Пипетки, микропипетки. Стаканы, склянки химические на 50 — 100 мл. Воронки: химические, делительные. Насадка для перегонки с водяным паром (рис. 7 — не приводится). Хроматографическая камера. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см или 12 x 15 см. Микрошприцы на 10 мкл. Колонки хроматографические длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка и лупа измерительная. Микроизмельчитель тканей РТ-2.
Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы из желудочного сока, желчи, слюны приливают 0,5 мл дистиллированной воды, 3 мл гексана (анализ методом ГЖХ) или 3 мл хлороформа (анализ методом ТСХ) и встряхивают в делительной воронке на холоде в течение 30 — 40 мин. Органический слой отделяют, экстракцию проводят еще дважды свежими порциями растворителя. Порции органического растворителя объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, отгоняют при комнатной температуре до объема растворителя 1 мл для ГЖХ и 0,2 — 0,5 мл для ТСХ.
Пробу крови (1 мл) отбирают в пробирку, смоченную нитратом натрия, приливают 3 мл гексана или хлороформа и встряхивают в течение 30 — 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.
К 20 — 50 мл пробы мочи приливают 2 — 5 мл воды, 5 — 10 мл гексана или хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.
Пробу кожи предварительно выдерживают в морозильнике 1 — 2 ч. Затем пробу массой 1 г тщательно измельчают, приливают 4 мл хлороформа или гексана и встряхивают в течение 50 — 60 мин. Органический слой отделяют. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями растворителя. Объединенный экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее поступают так, как описано выше.
Смыв с поверхности кожи проводят ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой или этанолом. Тампон помещают в склянку, приливают 20 мл воды так, чтобы весь тампон был покрыт водой. Встряхивают в течение 60 мин. Экстракт сливают, отжимают вату. Промывают вату свежей порцией воды. К объединенному водному экстракту приливают 10 мл гексана (или хлороформа) и экстрагируют перемешиванием растворов в течение 30 — 40 мин. Органический слой отделяют так, как описано выше.
Ход анализа при ТСХ. Пробу 0,2 - 0,5 мл количественно наносят на хроматографическую пластинку, параллельно на эту же пластинку наносят стандартные растворы ронита, содержащие 0,5 - 10 мкг. Помещают в хроматографическую камеру, куда предварительно наливают подвижную фазу.
После поднятия фронта растворителя на высоте 10 — 12 см пластинку извлекают
из камеры и дают улетучиться следам растворителей. Затем применяют один из проявляющих реагентов. Если хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол", то используют проявляющие реагенты N 1 или N 2. После опрыскивания проявляющим реагентом N 1 пластинку сразу же помещают в термостат при температуре 60 - 80 °C на 15 мин. Затем обрабатывают 2-процентным раствором лимонной кислоты. На желтом фоне пластинки зона локализации ронита окрашивается в синий цвет. Если пластинку опрыскивают проявляющим реагентом N 2, то пластинку после этого следует поместить в термостат при 110 - 115 °C на 3 - 5 мин. Зона локализации ронита и его метаболитов - сульфоксида и сульфона - окрашивается в лимонно-желтый цвет. Величина R ронита 0,56, сульфоксида - 0,18, сульфона - 0,35. Проявляющий
f
реагент N 3 применяют при хроматографировании на пластинках с оксидом алюминия. В этом случае тотчас после опрыскивания реагентом зона локализации ронита окрашивается в красно-коричневый цвет, а его метаболитов - в голубовато-сиреневый (ЦГА), вишнево-красный (ДЦГА), экстрактивных веществ биосред - в желтый. Величина R ронита 0,75,
f
ЦГА — 0,1, ДЦГА — 0,4.
Ход анализа при ГЖХ. Вводят в хроматограф 2 — 5 мкл из 1 мл очищенного гексанового экстракта. Условия газохроматографического определения приведены в таблице 91.
УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ НА РАЗЛИЧНЫХ КОЛОНКАХ
| Параметры | I колонка 5% SE-30 | II колонка 5% XE-60 | III колонка 5% DC-550 |
| Носитель | Хроматон N-AW-DTCS (0,16 — 0,20 мм) | ||
| Детектор | ТИД | ТИД | ТИД |
| Колонка — длина/диаметр, м/мм | 1/3 | 1/3 | 1/3 |
| Температура, °C: | |||
| колонки | 160 | 140 | 160 |
| испарителя | 210 | 200 | 200 |
| Расход газа, мл/мин.: | |||
| азота | 20 | 20 | 20 |
| водорода | 15 | 15 | 15 |
| воздуха | 200 -12 | 400 -12 | 400 -12 |
| Чувствительность шкалы электрометра, А | 50 x 10 | 50 x 10 | 100 x 10 |
| Минимально детектируемое количество, нг | 0,2 | 2 | 2 |
| Время удерживания, мин. | 4,8 | 7,1 | 15,9 |
Обработка результатов анализа. Определение методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен на хроматограмме пробы и стандартных растворов, наиболее близких по размерам к пробе. Содержание ронита (X, мкг/мл или мкг/г) рассчитывают по формуле:
A
A — количество вещества на хроматограмме пробы, найденное путем сравнения со стандартом, мкг;
Определение методом ГЖХ. Количественную оценку результатов проводят методом абсолютной калибровки. Для этого вводят в хроматограф стандартные растворы ронита (2 — 5 мкл), содержащие 0,2 — 20 мкг/мл. Строят градуировочный график зависимости «площадь пика — концентрация» и по нему находят концентрацию ронита в хроматографируемой пробе. Можно воспользоваться формулой, в которую вводят площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пробе. При анализе проб параллельное определение каждой пробы проводят не менее 3 раз.
Расчет концентрации пестицида в исследуемой биологической пробе (X, мкг/мл или мкл/г) проводят по формуле:
C S V
ст пр 1
где:
C — концентрация пестицида на хроматограмме стандарта, мкг; ст
S — площадь пика на хроматограмме пробы, кв. мм; пр
S — площадь пика на хроматограмме стандарта, кв. мм; ст
V — общий объем экстракта пробы, мл; 1
V — хроматографируемый объем экстракта, мл;
P — масса или объем пробы, г или мл.
Требования безопасности. Необходимо соблюдать требования безопасности при работе с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.