Методические указания по определению карбина и хлор-ИФК в биологических средах спектрофотометрическим методом и методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 4998-89)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
8 июня 1989 г. № 4998-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КАРБИНА И ХЛОР-ИФК В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ И МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГГ и ПЗ).
Краткая характеристика препаратов. Карбин (барбан) — действующее начало
O-(4-хлорбутил-2-ил-1)-N-(3-хлорфенил)карбамат. Брутто формула C H O NCl .
11 9 2 2
Молекулярная масса 258,2. Химически чистый карбин - белое кристаллическое
вещество, т. пл. 75 — 76 °C (с разложением). Растворимость: в бензоле — 370 г/кг, толуоле — 295, дихлорэтане — 546, хлороформе — 470, пропиленгликоле -
150, н-гексане - 2 г/кг, в воде - 11 мг/л при 25 °C. Давление насыщенных паров 0,067 Па. Для белых мышей и кроликов ЛД 600 - 820 мг/кг. Следует
50
соблюдать меры предосторожности, исключающие попадание пестицида на кожу. В воздухе рабочей зоны ПДК 0,5 мг/куб. м, в воде 0,03 мг/л. МДУ в СССР в зерновых 1 мг/кг, овощах и фруктах 0,1 мг/кг.
Хлор-ИФК (хлорпрофам) - действующее начало O-изопропил-N- (3-хлорфенил)карбамат. Брутто формула C H O NCl. Молекулярная масса
10 12 2
213,7. Химически чистый хлор-ИФК - белое кристаллическое вещество, т. пл. 41,4 °C, т. кип. 112 - 113 °C при 200 Па. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей, растворимость в воде - 89 мг/л при 25 °C. Для экспериментальных животных ЛД 1500 - 3300 мг/кг. Не раздражает кожу. В
50
воздухе рабочей зоны ПДК 2 мг/куб. м, в воде водоемов — 1 мг/л. В моркови МДУ 0,05 мг/кг.
Карбин и хлор-ИФК применяют в качестве гербицидов.
Принцип метода. Метод основан на извлечении пестицидов из биоматериала органическим растворителем и хроматографировании в тонком слое оксида алюминия или силикагеля в подвижной фазе на основе н-гексана. Зоны локализации пестицидов обнаруживают по реакции азосочетания продуктов их термической деструкции с альфа-нафтолом. Для спектрофотометрического определения используют характеристическое поглощение гексановых растворов карбина и хлор-ИФК в ультрафиолетовой области спектра при лямбда = 276 - 278 и 274 нм соответственно для карбина и хлор-ИФК.
макс
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел обнаружения: методом ТСХ — карбина 1 — 2 мкг (0,05 — 0,1 мг/кг), хлор-ИФК 1,5 — 3 мкг (0,075 — 0,15 мг/кг); методом УФ-спектрофотометрии — карбина 3 мкг, хлор-ИФК 5 мкг в 3 мл раствора (0,5 и 0,85 мг/л соответственно).
Среднее значение определения и доверительный интервал среднего (p = 0,95, n = 10): методом ТСХ — карбина в тканях внутренних органов 90,6 +/- 10,8% и в крови 94,0 +/- 11,0%, хлор-ИФК в тканях 88,0 +/- 10,3%, в крови 90,0 +/- 12,5%; методом УФ-спектрофотометрии — карбина 96,7 +/- 3,9% и хлор-ИФК 92,4 +/- 9,3%.
Избирательность метода. Определению карбина и хлор-ИФК не мешает фосфор и хлорорганические пестициды, применяемые на одинаковых сельскохозяйственных культурах.
Реактивы и растворы. Карбин х.ч. Хлор-ИФК х.ч. н-Гексан нормальный ч. Диэтиловый эфир х.ч. или "медицинский для наркоза". Хлороформ х.ч. Оксид водорода. Гидроксид натрия ч.д.а., 25-процентный раствор. Нитрит натрия х.ч. Лимоннокислый натрий х.ч., 5-процентный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 2-процентный раствор. Гидроксид калия ч.д.а. Бромфеноловый синий ч.д.а., о-толидин ч. Оксид алюминия для хроматографии II степени активности ч. Сульфат кальция безводный ч.д.а. альфа-Нафтол ч.д.а. Хлороводородная кислота концентрированная х.ч. Фенол. Аммиак водный, ч.д.а. Проявляющие реагенты: N 1 (для диазотирования) -
нитрит натрия (к 1,5 г нитрита натрия приливают раствор, состоящий из 46 мл
дистиллированной воды и 4 мл концентрированной хлороводородной кислоты). Применяют свежеприготовленным; N 2 (для азосочетания) - гидроксид калия (2,8 г растворяют в 50 мл дистиллированной воды и прибавляют 0,2 г альфа-нафтола). Реактивы готовят перед употреблением; N 3 - бромфеноловый синий реагент (к 0,5 г бромфенолового синего приливают 10 мл ацетона и разбавляют до 50 мл 2-процентным раствором нитрата серебра). Раствор можно хранить в холодильнике несколько дней, N 4 - на основе о-толидина. Готовят раствор А: 0,5-процентный раствор о-толидина в ацетоне. Раствор Б: смешивают 3 объема 0,5-процентного раствора гидроксида натрия и 2 объема 3-процентного раствора пероксида водорода. Перед употреблением смешивают равные объемы растворов А и Б. Стандартные растворы карбина и хлор-ИФК в диэтиловом эфире с содержанием 100 мкг/мл и гексане с содержанием 100 мкг/мл. Хранят в холодильнике до 1 мес. Пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 см (УФ ). Хлорамин Б.
254
Приборы, аппаратура, посуда. Аппарат для встряхивания, ротационный испаритель с набором колб. Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения в УФ-области спектра, начиная с 220 нм. Колбы на 250 мл; грушевидные для отгонки растворителя; мерные; цилиндры. Воронки делительные на 250 мл. Пробирки мерные на шлифах вместимостью 10 мл. Камера хроматографическая. Пульверизатор стеклянный. Камера для опрыскивания пластинок. Микропипетки или капилляры для нанесения проб. Источник УФ-света. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 или 15 x 15 см. Гомогенизатор. Адсорбционные колонки стеклянные размером 300 x 15 мм. Фарфоровые чашки и ступки.
Подготовка к определению. Приготовление хроматографических пластинок. Навеску оксида алюминия (50 г) смешивают с 5 г сернокислого сульфата кальция (или гипса), тщательно растирают в ступке до однородной массы. Смесь переносят в колбу на 250 мл и порциями приливают 75 мл воды, осторожно встряхивая массу. Полученную смесь встряхивают до однородной консистенции, а затем ровным тонким слоем наливают на 10 — 12 пластинок размером 9 x 12 см (или 8 — 10 пластинок размером 15 x 15 см). Оставляют при комнатной температуре на 10 — 12 ч. Хранят в эксикаторе.
Приготовление адсорбционной колонки. В колонку помещают небольшой тампон из гигроскопической обезжиренной ваты (0,5 г), насыпают слой оксида алюминия на высоту колонки 2 — 3 см (примерно 3 — 4 г). Через колонку пропускают 30 мл ацетона.
Ход анализа. Экстракция для метода ТСХ. Пробу тканей внутренних органов (20 г) тщательно измельчают (или гомогенизируют), приливают 50 мл эфира и энергично встряхивают (при охлаждении льдом) в течение 1 ч. Экстракт сливают. Оставшуюся массу промывают свежей порцией эфира 20 мл. Экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр и отгоняют растворитель досуха. К сухому остатку приливают 5 мл охлажденного ацетона и пропускают через абсорбционную колонку. Элюируют пестициды охлажденным ацетоном (50 мл). Ацетон отгоняют досуха, к сухому остатку приливают 0,5 мл эфира и наносят на хроматографическую пластинку.
Пробу крови (2 мл) вносят в пробирку, предварительно смоченную раствором лимоннокислого натрия, и приливают 10 мл эфира. Встряхивают 20 мин. После 10-минутного отстаивания встряхивают повторно 10 мин. Экстракт сливают и отгоняют растворитель до объема 0,2 — 0,5 мл.
Экстракция для УФ-спектрофотометрии. Пробу крови (2 мл) вносят в пробирку, предварительно смоченную раствором лимоннокислого натрия. Наливают 5 — 6 мл гексана и встряхивают 20 мин., поместив в стакан со льдом. После 10-минутного отстаивания гексан осторожно сливают. К оставшейся массе приливают свежую порцию гексана (5 мл). Встряхивают 10 мин. Экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, на который предварительно насыпают безводный сульфат натрия. Измеряют объем раствора. Для спектрофотометрирования отбирают 3 мл.
Хроматографирование. Эфирный экстракт 0,2 — 0,5 мл вносят на хроматографическую пластинку на стартовую линию. Параллельно слева и справа от пробы наносят смеси стандартных растворов карбина и хлор-ИФК, содержащие
1, 2, 5, 10, 15... 40 мкг исследуемого вещества. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, куда за 30 мин. до хроматографирования наливают смесь гексана с хлороформом (1:3). После достижения фронтом растворителя высоты 10 см пластинку извлекают из хроматографической камеры и оставляют на воздухе до полного испарения следов растворителей. Затем ее помещают в сушильный шкаф на 10 - 15 мин. при 150 - 160 °C. Охлажденную до комнатной температуры пластинку опрыскивают сначала реагентом N 1, а через 1 мин. - N 2. В местах локализации карбина и хлор-ИФК проявляются пятна, окрашенные в розово-кирпичный цвет. Кроме карбина и хлор-ИФК, на пластинке могут проявиться продукты метаболизма: оксикарбамат (метаболит карбина, R 0 - 0,1), анилин и м-хлороанилин. Если величину R карбина принять f f равной 1, то R для анилина равна 1,25; для м-хлоранилина - 1,49, а для
отн
хлор-ИФК — 2.
При опрыскивании пластинок ПР № 3 карбин и хлор-ИФК проявляются в виде коричневых пятен. После обработки ПР № 4 и УФ-облучения карбин, хлор-ИФК и метаболиты проявляются в виде серо-зеленых пятен.
Количественное определение пестицидов проводят путем сопоставления интенсивности окрашивания пятен и их площади на хроматограмме пробы и стандартных растворов. Площадь пятен измеряют с помощью промасленной миллиметровой бумаги или планиметром.
Обнаружение п-аминофенола. Качественным признаком интоксикации N-фенилкарбаматами служит присутствие в моче п-аминофенола. Его обнаруживают по реакции окисления до 4-хлорамина-п-хинона и последующего сочетания с фенолом в щелочной среде. В результате получается окрашенное соединение.
Пробу мочи 20 мл вносят в делительную воронку, приливают 20 мл 1 н раствора соляной кислоты и интенсивно встряхивают 10 мин. Затем вносят 5 мг хлорамина Б и снова встряхивают содержимое воронки 10 мин. Приливают 30 мл эфира и осторожно встряхивают 20 мин. для экстракции 4-хлорамина-п-хинона. Эфирный экстракт отделяют, пропускают через безводный сульфат натрия, концентрируют до объема 0,2 — 0,5 мл и наносят полученную пробу на фильтровальную бумагу, заранее смоченную эфирным раствором фенола. Выдерживают в парах аммиака 1 — 2 мин. Если в пробе мочи содержался п-аминофенол, то на фильтровальной бумаге проявляется пятно, окрашенное в голубой или синий цвет в зависимости от количества п-аминофенола.
Спектрофотометрирование. Для спектрофотометрирования в кварцевые кюветы
l = 1 см вносят 3 мл гексанового экстракта. Измеряют оптическую плотность
раствора при лямбда = 274 нм для хлор-ИФК и лямбда = 276 - 278 нм
макс макс
для карбина. Максимум при 230 - 231 нм принадлежит анилину, при 234 нм -
оксикарбамату, при 237 нм - м-хлоранилину. Количество пестицида в
спектрофотометрируемой пробе определяют по градуировочному графику, для
чего измеряют оптические плотности растворов пестицидов, содержащие от 3 до 100 мкг в 3 мл гексана. Строят график зависимости «Оптическая плотность — концентрация в 3 мл». Эталоном сравнения служит гексан.
Обработка результатов анализа. Содержание пестицида в пробе (X, мкг/г или мг/кг) вычисляют по формуле:
AV
A — количество пестицида, найденное в хроматографируемой или спектрофотометрируемой пробе, мкг;
V — общий объем экстракта, мл;
P — навеска или объем пробы, г или мл.
Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.