Методические указания по определению гибберсиба в луке, чесноке, картофеле, огурцах, кабачках, баклажанах, капусте, горохе, фасоли, винограде методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 11.07.1988 № 4676-88)
11 июля 1988 г. № 4676-88
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИББЕРСИБА В ЛУКЕ, ЧЕСНОКЕ, КАРТОФЕЛЕ, ОГУРЦАХ, КАБАЧКАХ, БАКЛАЖАНАХ, КАПУСТЕ, ГОРОХЕ, ФАСОЛИ, ВИНОГРАДЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Е.Ю. Козловой, С.М. Обут (НИОХ СО АН СССР).
Краткая характеристика препарата. Натриевая соль гибберелловой кислоты (гиббереллин A ) - основное действующее начало препарата гибберсиб.
3
Молекулярная масса 368. Брутто формула C H O Na. Гибберсиб представляет 19 21 6 собой гигроскопический порошок от желтого до коричневого цвета, получаемый высушиванием на распылительной сушилке продуктов метаболизма гриба Fusarium moniliforme. Гибберсиб является смесью натриевых солей гиббереллинов, карбоновых кислот и карбоната натрия. Растворимость гибберсиба в воде 2 г/л при 20 °C. Растворим в этиловом и метиловом спиртах, этилацетате, ацетоне. Нерастворим в бензоле и гексане. Гибберсиб применяют в качестве стимулятора роста растений.
Принцип метода. Определение основано на экстракции гиббереллинов из растительной массы этилацетатом с последующей тонкослойной хроматографией экстракта, обнаружении компонентов путем обработки пластинок 70-процентной серной кислотой, элюировании гиббереллина с пластинок и спектрофотометрировании элюата в области 250 — 270 нм.
Метрологическая характеристика метода. Диапазон определяемых концентраций 0,1 - 25 мг/кг. Предел обнаружения препарата на пластинках 10 мкг, предел определения в растительной продукции - 0,1 мг/кг. Среднее значение определения стандартных количеств гиббереллина A 80%. Стандартное
3
отклонение +/- 11%. Доверительный интервал среднего значения (при p = 95 и n = 5) +/- 13%.
Избирательность метода. Определению не мешают неорганические компоненты препарата, карбоновые кислоты, другие гиббереллины, экстрактивные вещества из плодов, а также хлор- и фосфорсодержащие пестициды.
Реактивы и растворы. Этилацетат ч. Хлороформ. Метанол ч.д.а. Спирт этиловый. Кислота хлороводородная х.ч., 7-процентный водный раствор. Сульфат магния ч., прокаленный. Аммиак водный технический, 0,5-процентный водный раствор. Хлорид натрия х.ч., насыщенный водный раствор. Вода дистиллированная. Серная кислота х.ч., 70-процентный водный раствор. Гиббереллин кристаллический. Стандартный раствор гиббереллина
кристаллического (A ) — 120 мг в 100 мл этилацетата. Срок хранения 1 мес. в 3 холодильнике. Пластинки «Силуфол» размером 5 х 15, 15 х 15 или 20 х 20 см.
Приборы и посуда. Спектрофотометр СФ-16, СФ-26. Комплект для тонкослойной хроматографии типа АТХ-1. Центрифуга типа ЦЛС-31М. Ротационный
вакуумный испаритель. Мясорубка бытовая или измельчитель тканей типа РТ-2. Весы аналитические. pH-метр. Пульверизатор стеклянный. Микропипетки или микрошприц. Цилиндры мерные. Воронки. Колбы. Шаблон для расчерчивания
пластинок на клиновидные полосы из оргстекла (рис. 4 — не приводится).
Подготовка к определению. Построение градуировочного графика. Стандартные количества гиббереллина A хроматографируют методом клиновидной
3
хроматографии, фотометрируют в условиях, описанных в разделе "Условия хроматографирования", строят график зависимости оптической плотности от содержания гиббереллина (табл. 64). Анализ начинают в день отбора проб или
на следующий день.
ШКАЛА СТАНДАРТОВ ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОГО ГРАФИКА
| Показатели | Номер градуировочного раствора | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Количество стандартного раствора, нанесенного на пластинку, мл Содержание A , мг 3 | 0,05 0,060 | 0,10 0,120 | 0,20 0,240 | 0,30 0,360 | 0,40 0,480 |
Примечание. Концентрации стандартного раствора A 1200 мкг/мл, объем 3 раствора для элюирования с пластинок 5 мл.
Ход анализа. Экстракция. К 100 г измельченных на мясорубке плодов приливают 80 мл 0,5-процентного раствора аммиака, тщательно гомогенизируют встряхиванием и полученную массу осаждают на центрифуге в течение 5 — 7 мин. (4000 об./мин.). Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 30 мл раствора аммиака, снова осаждают, объединяют надосадочные жидкости и доводят pH 7-процентной соляной кислотой до 2,4 +/- 0,1. К этому раствору приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и экстрагируют его в делительной воронке этилацетатом трижды порциями по 50 мл. Если при экстракции образуется коллоидный слой, его отделяют на центрифуге или разрушают коллоид этиловым спиртом, прибавляя последний в делительную воронку до растворения коллоидов, и отфильтровывают выпавшие при этом хлопья.
Этилацетатные экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом магния в течение 5 ч, отфильтровывают, выпаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя до постоянной массы с отсчетом до 0,0001 г. Затем сухой остаток растворяют в 3 мл этилацетата.
Условия хроматографирования. Стандартные пластинки «Силуфол» с помощью шаблона (см. рис. 4) расчерчивают на клиновидные полосы. Наносят на старт хроматограмм по 10 мкл проб (5 параллельных) и одну пробу стандартного раствора гиббереллина. Пластинки подсушивают на воздухе и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол (8:2). Элюирование проводят дважды в одном направлении, каждый раз пропуская фронт растворителя до края пластинки.
По окончании элюирования пластинки подсушивают под тягой и опрыскивают 1,5 — 2 мл 70-процентной серной кислоты.
Рассматривают хроматограммы в УФ-свете при 254 нм, обводят флуоресцирующие пятна, соответствующие гиббереллину A , вырезают их,
3
измельчают и заливают 5 мл этилацетата, оставляют стоять 20 мин., периодически взбалтывая. Затем осторожно сливают надосадочную жидкость и измеряют ее спектр в области 250 - 270 нм (через 5 нм) в кювете с толщиной
поглощающего слоя 1 см против холостой пробы. Находят максимум поглощения и определяют содержание гиббереллина A в анализируемой пробе по 3 градуировочному графику.
Обработка результатов анализа. Содержание гиббереллина A в плодах (X, 3 мг/кг) рассчитывают по формуле:
AM
где:
A — содержание гиббереллина A , найденное по градуировочному графику, 3 мг;
M — масса сухого экстракта, выделенного из навески плодов, мг;
m — количество сухого экстракта, нанесенного на пластинку, мг;
P — навеска плодов, взятая для экстракции, кг.
Требования безопасности. Выполняют правила безопасности, необходимые при работе в химической лаборатории.