Методические указания по определению КМП и его метаболита МП в воде, почве, растительном и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии

Министерство здравоохранения СССР · № 4661-88Действующий акт

(утв. Минздравом СССР 14.07.1988 № 4661-88)

Утверждены
Минздравом СССР

14 июля 1988 г. № 4661-88

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КМП И ЕГО МЕТАБОЛИТА МП В ВОДЕ, ПОЧВЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

<*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.С. Петросян (Филиал ВНИИГИНТОКС).

Препарат КМП рекомендуется для применения в сельском хозяйстве в качестве ингибитора нитрификации азотных удобрений на посевах риса, пшеницы, овощей, хлопчатника. МП — продукт разложения КМП.

Краткая характеристика препаратов. КМП — 1-карбамоил-3(5)-метилпиразол. Брутто-формула C H № O. Молекулярная масса 125,1. Химически чистое 5 7 3

соединение - кремоватый порошок  с  резким  запахом,  т. пл. 127 °C. Хорошо
растворим в ацетоне,  хлороформе,  этаноле,  растворимость в воде 6,5 мг/л.
При  нагревании  до  180 °C,  а также  при  действии  разбавленных кислот и
щелочей  разлагается с образованием МП.  КМП - среднетоксичное  соединение,
ЛД   для крыс составляет 1280 мг/кг. МП - 3(5)-метилпиразол. Брутто-формула

50 C H N . Молекулярная масса 82,1. Химически чистое соединение — 4 6 2

светло-желтая    жидкость   с   пиридиноподобным    запахом,     плотностью
1,008 мг/куб. м  при 20 °C,  т. кип. 204 °C.  Неограниченно  смешивается  с
водой  и  большинством  органических растворителей.  МП  -  среднетоксичное
соединение, ЛД   для крыс составляет 240 мг/кг.

Принцип метода. Метод основан на извлечении КМП и МП из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстрактов в кислой среде, реэкстракции препаратов в щелочной среде и хроматографическом разделении в тонком слое пластинок «Силуфол». Зоны локализации препарата и его метаболита обнаруживаются после предварительного облучения УФ-светом и обработки пластинок йод-крахмальным реагентом или реагентом Паули.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 128.

Таблица 128

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (n = 20, p = 0,95)

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг или л	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг или л	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего, %
КМП
Вода	0,01	0,01 — 0,1	93,0	+/- 3,07	+/- 1,40
Почва	0,04	0,04 — 0,4	85,0	+/- 1,77	+/- 0,82
Рис	0,04	0,04 — 0,4	90,2	+/- 3,15	+/- 1,47
Пшеница	0,04	0,04 — 0,4	89,6	+/- 2,96	+/- 1,38
Кукуруза	0,04	0,04 — 0,4	85,0	+/- 1,41	+/- 0,67
Томаты	0,08	0,08 — 0,4	85,0	+/- 1,47	+/- 0,82
Картофель	0,08	0,08 — 0,4	83,0	+/- 1,99	+/- 1,00
Биосубстраты	0,2	0,2 — 2,0	89,0	+/- 2,53	+/- 1,04
МП
Вода	0,01	0,01 — 0,1	93,0	+/- 3,07	+/- 1,4
Почва	0,04	0,04 — 0,4	89,0	+/- 1,89	+/- 0,78
Рис	0,04	0,04 — 0,4	91,0	+/- 5,3	+/- 2,19
Пшеница	0,04	0,04 — 0,4	90,4	+/- 4,45	+/- 1,34
Кукуруза	0,04	0,04 — 0,4	89,0	+/- 2,53	+/- 1,04
Томаты	0,08	0,08 — 0,4	85,0	+/- 1,77	+/- 0,82
Картофель	0,08	0,08 — 0,4	81,1	+/- 1,83	+/- 0,76
Биосубстраты	0,2	0,2 — 2,0	85,0	+/- 1,77	+/- 0,82

Избирательность метода. В предлагаемых условиях хроматографирования метод специфичен в присутствии близких по структуре и области применения таких соединений, как нитрапирин, 6-хлорпиколиновая кислота, ХГИ, ТМДИ, ГМДИ, АТГ, а также применяющихся на посевах риса — пропанид, базагран.

    Реактивы  и  материалы.  КМП  х.ч. МП х.ч. Хлороформ х.ч. н-Гексан х.ч.
Этиловый  спирт  х.ч.  Хлороводородная кислота концентрированная х.ч., 1 н.
Безводный   сульфат   натрия  ч.  Ацетон  х.ч.   Натрия   гидроксид   х.ч.,
20-процентный. Гидроксид калия х.ч.,  10-процентный.  Нитрит  натрия  х.ч.,
10-процентный.    Кислота    сульфаниловая    безводная,    ч.д.а.    Калий
марганцовокислый х.ч.,  3-процентный.  Йодид калия х.ч., 1-процентный  в.р.
Крахмал водорастворимый х.ч.,  3-процентный.  Фильтры бумажные обеззоленные
"синяя лента",  предварительно   промытые   смесью хлороформ-ацетон  (1:1).
Пластинки   хроматографические   "Силуфол"   УФ      размером   15 x 15 см.

Стандартные растворы КМП и МП, содержащие 1; 10 и 100 мкг/мл. Хранить в холодильнике не более 3 мес.

Проявляющие реагенты: № 1 — сульфаниловая кислота диазотированная (реагент Паули). Приготовление соли диазония: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 25 мл 10-процентного раствора гидроксида калия. Охлажденный раствор смешивают с 25 мл 10-процентного раствора нитрита натрия. Этот раствор по каплям при перемешивании прибавляют к охлажденной льдом хлороводородной кислоте (40 мл хлороводородной кислоты + 20 мл дистиллированной воды). Выпавший осадок отмывают на воронке Бюхнера спиртом и сушат на фильтре. При хранении в холодильнике в темной склянке соль устойчива 3 мес. Для опрыскивания готовят рабочий раствор — 1,5-процентный раствор диазониевой соли в 15-процентном растворе гидроксида натрия. Раствор готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового пользования; № 2 — йод-крахмальные реагенты: а — 1-процентный раствор йодида калия; б — 3-процентный раствор крахмала. Перед употреблением смешать растворы а, б и этанол в соотношении 2,5:2,5:1. Раствор для хлорирования. Смешивают равные объемы 3-процентного раствора перманганата калия и 25-процентного раствора хлороводородной кислоты. Готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового пользования.

Приборы, аппаратура, посуда. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Ротационный вакуумный испаритель. Колбы: мерные на 100 мл; конические на 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл. Воронки делительные и химические. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл. Цилиндры мерные на 50 и 100 мл. Камера хроматографическая. Пульверизаторы стеклянные. Камера для хлорирования (эксикатор).

Отбор проб. Отобранные пробы анализировать сразу.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. Пробу воды (100 мл) помещают в коническую колбу, прибавляют безводный сульфат натрия до насыщения и экстрагируют КМП и МП хлороформом трижды порциями по 50; 30 и 30 мл. Объединенные экстракты фильтруют в перегонные колбы через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия (1 — 2 г) и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре не более 30 °C до объема 0,1 — 0,2 мл. Остаток количественно с помощью хлороформа наносят на хроматографическую пластинку.

Навеску (25 г) измельченной и просеянной почвы трижды экстрагируют ацетоном порциями по 50 мл. Объединенные экстракты фильтруют через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия (1 — 2 г) и отгоняют растворитель досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C. К сухому остатку прибавляют 10 мл 1 н раствора хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают колбу и переносят в коническую колбу на 100 мл через фильтр «синяя лента». Колбу еще дважды по 10 мл промывают 1 н раствором хлороводородной кислоты и сливают в ту же колбу. Объединенный экстракт хлороводородной кислоты подщелачивают 20-процентным раствором гидроксида натрия до pH 9, затем прибавляют безводный сульфат натрия до насыщения (10 — 12 г) и экстрагируют КМП и МП хлороформом трижды по 15 — 20 мл. Далее поступают аналогично анализу воды.

Измельченную пробу растительного материала (рис, пшеница, кукуруза, картофель, томаты) (25 г) экстрагируют хлороформом трижды по 50 мл. Растворитель фильтруют в перегонную колбу через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Экстракцию из биологического материала (кровь, печень, легкие, почки, сердце, селезенка, мозг, моча, кал) проводят следующим образом. Измельченную пробу (5 г или 5 мл) трижды экстрагируют хлороформом по 15 — 20 мл. Объединенный экстракт фильтруют в перегонную колбу через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Условия хроматографирования. После отгонки растворителя пробы с помощью хлороформа количественно наносят на пластинки «Силуфол» на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки. Справа и слева от пробы наносят стандартные растворы КМП и МП (в одну точку), содержащие известные количества препаратов. Развитие хроматограммы проводят в системе гексан-ацетон (5:3). После поднятия фронта растворителя на 14 см пластинку проветривают на воздухе до полного удаления растворителей. Затем пластинку подвергают облучению УФ-светом и течение 35 — 40 мин. и обрабатывают из пульверизатора проявляющими реагентами № 1 или № 2.

1. Опрыскивание рабочим раствором реагента Паули (на одну пластинку расходуется 1,5 — 2 мл реагента). Зоны локализации КМП и МП обнаруживаются в виде красных пятен на белом фоне. Окраска пятен МП устойчива в течение нескольких дней, КМП — 5 - 10 мин. Предел обнаружения на пластинке составляет для КМП 2 мкг; МП — 0,5 мкг.

2. <a id="p100041"></a>После  УФ-облучения   пластинки  помещают  в  камеру с раствором для

хлорирования  на 3 мин., оставляют пластинку на воздухе до полного удаления
запаха   хлора   (около   15   мин.)   и   обрабатывают  из  пульверизатора
йод-крахмальным  проявляющим  реагентом.  Зоны локализации обнаруживаются в

виде синих пятен на светлом фоне. Окраска пятен устойчива в течение 3 дней.

Предел  обнаружения  на пластинке составляет для КМП 0,1 мкг, для МП 1 мкг.
Величины R  составляют для КМП 0,55 +/- 0,02, для МП 0,35 +/- 0,02.

Обработка результатов анализа. Количественную оценку проводят путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов. Содержание КМП и МП в анализируемой пробе (X, мг/кг или л) определяют по формуле:

X = -, P

где:

A — количество КМП, МП, найденное путем сравнения со стандартами, мкг;

P — навеска или объем анализируемой пробы, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях.