Методические указания по определению 2,4-Д и аминной соли 2,4-Д в почве методом газожидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 № 4383-87)
8 июня 1987 г. № 4383-87
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ 2,4-Д И АМИННОЙ СОЛИ 2,4-Д В ПОЧВЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Э.И. Бабкиной, Л.Б. Алексеевой, Ж.Н. Трублаевич, Г.А. Борисовой (ИЭМ НПО «Тайфун»), Н.П. Фрей (Калужская областная проектно-изыскательская станция химизации сельского хозяйства).
Краткая характеристика препарата. Брутто - формула 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты C H O Cl N. Молекулярная масса 266,1. 10 18 3 2 Общепринятое название - аминная соль 2,4-Д, 2,4-ДА, 2,4-ДМА. Бесцветное
гигроскопическое кристаллическое вещество, т. пл. 85 — 87 °C. Растворимость
в воде при 20 °C 200 г/л. Хорошо растворима в этаноле, метаноле, практически нерастворима в углеводородах. Применяется в качестве гербицида для уничтожения сорняков в посевах зерновых культур, кукурузы, многолетних
злаковых трав, а также для уничтожения нежелательной древесной поросли.
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) в виде солей и эфиров используется в качестве гербицида. ПДК в почве: аминная соль 2,4-Д — 25 мг/кг, 2,4-Д — 0,1 мг/кг.
Принцип метода. Метод основан на экстракции и одновременном гидролизе 2,4-ДА до свободной феноксикислоты 2,4-Д 1 н раствором серной кислоты при одновременном перераспределении 2,4-Д в диэтиловый эфир, последующем перераспределении 2,4-Д в 1 н раствор едкого натра, очистке последнего хлороформом, перераспределении 2,4-Д в кислый раствор и экстракции последнего диэтиловым эфиром, концентрировании экстракта и этерификации сухого остатка с помощью этилового и (или) бутилового спиртов в присутствии концентрированной серной кислоты. Количество этилового и бутилового эфиров 2,4-Д определяется методом газожидкостной хроматографии с использованием ДЭЗ.
Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения 0,0001 — 0,0002 мкг, предел определения в почве 0,01 — 0,02 мг/кг. Доверительный интервал определения 2,4-Д в почве составляет 90 +/- 15% при концентрациях 10 — 100 мг/кг и 85 +/- 20% при концентрациях 0,1 — 10 мг/кг, p = 0,95, n = 4 и описанных хроматографических условиях с использованием фазы SE-30.
Определению не мешают гербициды ряда карбоновых и феноксиуксусных кислот (далапон, 2М-4Х, трихлорацетат натрия).
При использовании неполярной фазы SE-30 время удерживания этилового эФира 2,4-Д совпадает со временем удерживания альфа-ГХЦГ, однако в процессе экстракции гербицидов и последующей очистки экстрактов изомеры ГХЦГ не переходят в эфирный экстракт и не мешают определению 2,4-Д. Время удерживания бутилового эфира 2,4-Д совпадает со временем удерживания 2,4'-ДДЭ, однако также в процессе экстракции и очистки экстрактов 2,4'-ДДЭ не переходит в эфирный экстракт, поэтому не мешает определению 2,4-Д.
Анализ 2,4-Д в виде двух различных эфиров — этилового и бутилового — обусловлен тем, что среди природных соединений почвы, воды и других объектов встречаются соединения, имеющие время удерживания, совпадающее со временем удерживания одного из этих эфиров.
Реактивы и материалы. Азот особой чистоты. Ацетон ч. или ч.д.а. Эфир диэтиловый (серный) медицинский, перегнанный. Серная кислота х.ч., концентрированная, 1 н раствор. Гидроксид натрия (едкий натр) ч., 1 н раствор. Хлороформ перегнанный. Этиловый спирт ректиф., перегнанный. Сульфат натрия безводный ч.д.а., 10-процентный раствор. Спирт бутиловый ч.д.а., перегнанный. Хлорид кальция ч., прокаленный. Вата обезжиренная, промытая эфиром и гексаном. Наполнители хроматографической колонки: хроматон N-AW-DMCS (0,125 — 0,160 или 0,160 — 0,200 мм) или N-AW-HMDS, пропитанный неподвижной фазой SE-30 (5%) или альтернативной фазой XE-60 (5%), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты х.ч. или чистоты не менее 95%.
Приборы и посуда. Газовые хроматографы «Цвет», «Газохром», ЛХМ-80 или другие с ДЭЗ, ДПР. Колонки стеклянные длиной 1 и 1,5 м, внутренним диаметром 3 мм. Микрошприцы на 1 или 10 мкл. Термометр (0 — 100 °C). Колбы: плоскодонные конические на 250 мл с притертыми пробками или резиновыми, обернутыми в фольгу; мерные на 25; 50 и 100 мл. Делительные воронки на 25; 30 и 250 мл. Мерные цилиндры вместимостью 50 и 100 мл. Пробирки градуированные с притертыми пробками на 10 и 20 мл. Воронки химические диаметром 4 и 7 — 12 см. Микропипетки на 0,2; 1; 2 и 5 мл. Ротационный испаритель. Центрифуга. Аппарат для встряхивания. Сушильный шкаф. Весы аналитические. Плитка электрическая с закрытой спиралью на 800 Вт. Баня водяная.
Подготовка к определению. Приготовление растворов 2,4-Д. Для приготовления раствора А 2,4-Д (1 — 10 мг/мл) в стаканчике или бюксе взвешивают 0,1 — 1,0 г 2,4-Д с точностью +/- 0,0002 г. Содержимое стаканчика или бюкса с помощью 10 — 20 мл ацетона переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают и закрывают. Раствор хранят в течение полугода в холодильнике.
Для приготовления раствора Б 2,4-Д (10 — 100, 1 — 10 или 4 — 40, 0,4 — 4,0 мкг/мл) из мерной колбы с раствором А отбирают 0,2 — 1,0 мл и переносят в градуированную пробирку на 20 мл или мерную колбу на 25 или 50 мл, добавляют необходимое количество ацетона, тщательно перемешивают и закрывают. Хранят в холодильнике не более месяца.
Приготовление стандартных (градуировочных) растворов этилового и бутилового эфиров 2,4-Д. В навески почвы (3 навески по 20 г), помещенные в бюксы, вносят по 4 мл дистиллированной воды. Бюксы закрывают и оставляют на 20 — 28 ч, после чего в каждый бюкс вносят с помощью пипетки по 0,4 мл ацетонового раствора 2,4-Д соответствующей концентрации так, чтобы в каждые серии навесок было внесено, например, по 200, 20 и 2 мкг 2,4-Д. Содержимое бюксов перемешивают стеклянной палочкой в течение 2 — 3 мин., закрывают и оставляют на 20 — 28 ч. На следующий день бюксы открывают и оставляют открытыми вдали от солнечных лучей и вентиляционных устройств до воздушно-сухого состояния навески почвы (2 — 3 сут.). После этого бюксы закрывают и навеску выдерживают в темном месте не менее недели (но не более 2 недель), затем комочки почвы раздавливают и извлекают 2,4-Д, очищают экстракты, концентрируют их и проводят этерификацию.
Объединенные гексановые экстракты этилового или (и) бутилового эфира 2,4-Д, полученные после извлечения 2,4-Д из соответствующих навесок почвы и последующей этерификации, используют в качестве градуировочных (стандартных или эталонных) растворов при определении ГЖХ. При анализе исследуемой пробы используют градуировочный раствор от той серии навесок, в которых концентрация 2,4-Д близка к концентрации 2,4-Д в исследуемой пробе, которую предварительно оценивают с помощью любого градуировочного рабочего раствора этилового или бутилового эфира 2,4-Д.
Перед ГЖХ, в день хроматографирования, из градуировочных растворов отбирают по 2 — 3 мл и очищают концентрированной серной кислотой, добавляя ее по 0,5 — 0,8 мл так, как описано ниже.
Градуировочные растворы, не очищенные серной кислотой, хранят не более 2 мес. в холодильнике. Градуировочные растворы, очищенные серной кислотой, хранению не подлежат.
При использовании в качестве эталонного эфира 2,4-Д, полученного после этерификации 2,4-Д, внесенной в образцы почвы, аналогичной исследуемой, стандартное отклонение среднего значения определения не превышает 25%.
Хранение проб почвы. Пробы почвы, содержащие 2,4-Д и ее производные, хранят в воздушно-сухом состоянии в упаковке, не содержащей пластмассы и полимерных материалов, не более 3 мес. В местах хранения полевых проб закладывают почвенные пробы сравнения (ПС почвы) с известным количеством аминной соли 2,4-Д или 2,4-Д. Коэффициент учета условий хранения проб (КУ) находят по формуле:
КУ = С / С , 1 2
где:
С — содержание 2,4-Д или ее производного в ПС почвы в день закладки 1 полевых проб;
С — содержание 2,4-Д или ее производного в ПС почвы в день начала 2 анализа полевой пробы.
Ход анализа. Экстракция образцов почвы. Навеску воздушно-сухой почвы (20 г) помещают в коническую колбу на 250 мл, приливают 30 мл 1 н раствора серной кислоты. Затем вносят 1 мл ацетона, тщательно перемешивают, закрывают колбу и оставляют на 1 ч. В течение этого времени ее 2 — 3 раза энергично встряхивают вручную (1 — 2 мин). Затем добавляют 60 мл этилового эфира и устанавливают на аппарате для встряхивания на 30 мин., после чего содержимое переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют <*> 3 мин. при 2000 об./мин. Жидкую часть сливают в делительную воронку на 250 мл, а остаток из центрифужной пробирки переносят в исходную колбу с помощью 10 мл 1 н раствора серной кислоты и 1 мл ацетона, энергично встряхивают вручную (1 — 2 мин.), добавляют 20 мл эфира и встряхивают на аппарате 15 мин. Содержимое колб переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют <*> (см. ранее) 3 мин. при частоте оборотов 2000 об./мин. Жидкую часть сливают в делительную воронку к первой порции, остаток почвы удаляют.
<*> При отсутствии центрифуги раствор можно профильтровать, поместив фильтр в химическую воронку; во время фильтрования воронку прикрывают фольгой для уменьшения испарения эфира.
Содержимое делительной воронки осторожно встряхивают 1 — 2 мин., содержимому дают отстояться 10 — 15 мин., водный слой отделяют и отбрасывают.
Очистка экстрактов. К эфирному экстракту в делительной воронке добавляют 25 мл 1 н раствора гидроксида натрия и содержимое энергично встряхивают 1 — 2 мин. Эфирный слой отделяют и отбрасывают, а к водно-щелочному добавляют 20 мл хлороформа и энергично встряхивают в течение 1 — 2 мин., нижний хлороформный слой удаляют. К очищенному экстракту добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, встряхивают, оставляют на 10 — 15 мин., затем добавляют 30 мл эфира, энергично встряхивают 1 — 2 мин. и оставляют до разделения слоев. Водный слой сливают в стаканчик или колбу. Неразрушившуюся эмульсию оставляют в делительной воронке. Эфирный слой сливают через верх воронки, фильтруя через сульфат натрия (10 — 15 г), помещенный в химическую воронку с подложкой из обезжиренной ваты. Водный слой снова переносят в делительную воронку и экстрагируют 20 мл эфира, также отделяя эфирный слой и фильтруя его через ту же порцию сульфата натрия.
Этерификация. Осушенный эфирный экстракт концентрируют на ротационном испарителе до 2 — 3 мл. Этот остаток с помощью пипетки переносят в пробирку, колбу смывают 1 — 2 мл эфира и присоединяют к эфирному экстракту в пробирке. С помощью пипетки с грушей эфир в пробирке отдувают досуха, к сухому остатку добавляют сначала 1 мл спирта (этилового или бутилового), а затем 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку с реакционной смесью закрывают и помещают на кипящую водяную баню так, чтобы в кипящей воде находилась 1/2 часть пробирки, и нагревают при температуре около 100 °C в течение 20 мин. Затем содержимое пробирок доводят до комнатной температуры, во все пробирки добавляют по 4 мл гексана и энергично их встряхивают. Отделять гексановый слой можно или в делительной воронке на 25 — 30 мл, или с помощью микропипетки на 5 мл, или просто слить гексановый экстракт через край пробирки, оставляя нижний слой, который затем снова встряхивают с новой порцией гексана (4 мл). К объединенным гексановым экстрактам (8 — 9 мл) приливают по 5 мл 10-процентного раствора сульфата натрия и энергично встряхивают. Гексановый слой в делительной воронке отделяют от водного, сливают его в пробирку на 10 мл, фильтруя его через безводный сульфат натрия (3 — 5 г), помещенный в химическую воронку на подложку из обезжиренной ваты. Аликвоту 4 мкл из объема гексанового экстракта 3 — 5 мл вводят в хроматограф. В случае появления на хроматограмме пиков, время удерживания которых близко или совпадает с временем удерживания этилового или бутилового эфиров 2,4-Д (последнее — в случае приготовления градуировочных растворов), гексановый экстракт эфиров очищают серной кислотой. Для этого к гексановому экстракту, помещенному в делительную воронку, приливают 1 — 2 мл концентрированной серной кислоты и осторожно встряхивают. Через 10 — 15 мин. слой кислоты отделяют, гексановый экстракт сливают в пробирку. Аликвоту 4 мкл из объема гексанового экстракта 3 — 5 мл вводят в хроматограф.
Этерификацию различными спиртами проводят двумя способами: либо экстракт делят на две части и каждую часть этерифицируют этиловым или бутиловым спиртом, либо этерифицируют экстракты, полученные из двух параллельных навесок почвы. В любом случае соответствующий спирт добавляют к сухому остатку после удаления из экстракта растворителя.
Если проведена очистка гексанового экстракта эфира 2,4-Д (этилового или бутилового), полученного из исследуемой полевой пробы, очистке должен быть подвергнут и соответствующий градуировочный раствор.
Условия хроматографирования. Хроматограф ЛХМ-80 или аналогичный прибор с ДЭЗ. Температура, °C: колонки — 180 — 190, испарителя — 200 — 225, детектора — 230 — 250. Скорость потока газа-носителя (азота) через колонку 60 мл/мин. Скорость протяжки ленты самописца 600 мм/ч. Стеклянная колонка длиной 1 м, диаметром 3 мм заполнена хроматоном N-AW-DMCS (0,125 — 0,160 мм) с неподвижной фазой SE-30 (5%). Линейность детектирования 0,1 — 3,0 нг (0,0001 — 0,003 мкг). Время удерживания этилового эфира 2,4-Д — 1,6 — 2,2 мин.; бутилового эфира 2,4-Д — 3,8 — 4,2 мин. В качестве альтернативной фазы используют фазу XE-60 (5%). Однако эта фаза неоптимальна, так как нижний предел обнаружения составляет 0,2 — 0,3 нг. Эта фаза используется для качественного доказательства идентичности пиков.
Бутиловый эфир 2,4-Д, используемый в качестве гербицида и находящийся в пробе почвы, не переходит в эфирный, а затем в гексановый экстракты в процессе обработки пробы почвы.
Обработка результатов анализа. При наличии линейного диапазона детектирования (пропорциональной зависимости изменения высоты пика от изменения концентрации раствора) количественное определение 2,4-Д проводят методом соотношения со стандартом (градуировочным раствором) по высоте пика по формуле; при отсутствии линейности детектирования, т.е. пропорциональности, — с помощью графика зависимости концентрация — высота пика или метода соотношения со стандартом, учитывая поправочный множитель, определяемый ежедневно:
CH V (1,4)
пр
где:
X — содержание пестицида, мг/кг, мкг/г;
C — концентрация градуировочного раствора 2,4-Д, мкг/мл;
H и H - высота пика соответственно на хроматограмме градуировочного ст пр
раствора и почвенного экстракта из исследуемой пробы, мм;
V — объем гексанового экстракта эфира 2,4-Д, из которого взята аликвота для хроматографирования, мл;
P — масса навески почвы в воздушно-сухом состоянии, г (в нашем случае — 20 г);
1,4 — поправочный множитель (коэффициент пересчета), учитывающий потери
эфира 2,4-Д в случае очистки гексанового экстракта эфира 2,4-Д из почвенного экстракта серной кислотой без таковой очистки градуировочного
раствора.
Использование в расчетной формуле C (мкг/мл) правомочно в том случае, когда аликвоты градуировочного раствора и почвенного экстракта одинаковы (в нашем случае они равны 4 мкл).
Требования безопасности. Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые при работе в химических лабораториях с легковоспламеняющимися и горючими жидкостями (диэтиловый эфир и ацетон; гексан, этиловый и бутиловый спирты), агрессивными веществами (кислоты, щелочи), сжатым газом (баллон с азотом) и электрооборудованием (хроматограф, центрифуга, встряхивающее устройство, весы, электроплитка, ротационный испаритель).