Методические указания по определению гетерофоса, этафоса и их метаболитов в биологическом материале, молоке, яйцах методом газожидкостной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 08.06.1987 № 4339-87)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, МОЛОКЕ, ЯЙЦАХ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

---

<*> Разработаны: М.В. Письменной, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС) [1]; В.Р. Хаитовым, Г.Л. Холмухамедовой, А.Д. Сайфутдиновой (УзНИВИ) [2].

Краткая характеристика препаратов. Характеристики гетерофоса, этафоса приведены в Унифицированной методике.

Характеристика метаболитов этафоса и гетерофоса приведена в таблице 28.

Химическое название	Структурная формула
O-Этил-O-фенилфосфат	C H O O
	2 5 \
	P -OH
	C H O 6 5
O-Этил-S-пропилфосфат	C H O O
	2 5 \
	P -SC H / 3 7 HO
O-Этил-O-фенил-S-	C H O O
метилтиофосфат	2 5 \
	P -SCH / 3 C H O 6 5
O-Этил-O-фенилтиофосфат	C H O O
	2 5 \
	P -SH
	C H O 6 5
O-Этил-0,2,4-дихлор-	C H O O
фенилтиофосфат	2 5 \
	P -SH
	2,4Cl C H O 2 6 3
O-Метил-O-фенил-S-	CH O O
пропилтиофосфат	3 \
	P -SC H / 3 7 C H O 6 5
O-Этил-O-метил-S-	C H O O
пропилтиофосфат	2 5 \
	P -SC H / 3 7 CH O 3
O,O-Диметил-S-пропил-	O
тиофосфат
	(CH O) P -SC H 3 2 3 7
O-Этил-O-метилтиофосфат	C H O O
	2 5 \
	P -SH
	CH O 3
O,O-Диметилтиофосфат	O
	(CH O) P -SH 3 2

Принцип метода. Методика основана на определении S-пропильных ФОП (гетерофоса, этафоса и десяти их метаболитов) методом ГЖХ. Указанные соединения извлекают из субстратов смесью ацетона и 0,1 н HCl (9:1), гетерофос из молока и яиц извлекают смесью ацетона с этанолом (3:1). Экстракты очищают перераспределением в системе жидкость — жидкость.

Определение методом ГЖХ проводят на хроматографе, снабженном ТИД и ДПР. Используют неподвижные фазы SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS и 3% OV-101 на инертоне-супер. Для разделения пестицидов и их метаболитов определение проводят в изотермическом режиме при двух температурах — 190 и 127 °C.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 29.

Вещество	Исследуемый объект	Нижний предел обнаружения, мг/кг	Среднее значение определения, %	Относительное стандартное отклонение	Доверительный интервал среднего при p = 0,95, n = 5, +/- %
Гетерофос -«- -»-	Молоко Яйца Биологические субстраты	0,002 0,002 0,001 — 0,01 <**>	70 65 79	6,7 6,3 8,3	8,3 7,8 10,3
Этафос	То же	0,005 — 0,05	83	12,2	15,1
Метаболиты
O-Этил-O-фенилфосфат	-«-»	0,001 — 0,01	74	13,5	16,8
O-Этил-S-пропилтиофосфат	-«-»	0,005 — 0,05	79	13,6	16,9
O-Этил-O-фенил-Sметилтиофосфат	-«-»	0,005 — 0,05	81	8,1	10,1
O-Этил-O-фенилтиофосфат	-«-»	0,05 — 0,5	70	3,8	4,7
O-Этил-0-2,4-дихлорфенилтиофосфат	-«-»	0,01 — 0,1	74	11,1	13,7
O-Метил-O-фенил-Sпропилтиофосфат	-«-»	0,01 — 0,1	78	4,3	5,3
O-Этил-O-метил-Sпропилтиофосфат	-«-»	0,01 — 0,1	84	10	12,4
O,O-Диметил-Sпропилтиофосфат	-«-»	0,005 — 0,05	80	5,5	6,8
O-Этил-O-метилтиофосфат	-«-»	0,05 — 0,5	81	10,9	13,5
O,O-Диметилтиофосфат	-«-»	0,05 — 0,5	78	13,8	17,1

---

<*> Расчет проведен суммарно для различных органов (печень, почки, мозг и др.).

<**> Приведены нижние пределы обнаружения в исследуемых объектах в зависимости от взятой навески (2 — 20 г).

Избирательность метода. Определению могут мешать ФОП, имеющие близкие времена удерживания.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. Хлороводородная кислота ч., 0,1 н водный раствор. н-Гексан ч., х.ч. Спирт этиловый, ректиф. Сульфат натрия безводный свежеприготовленный. Вода дистиллированная.

    Неподвижная  фаза  -  5%  SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,16 -
0,20  мм),  3%  OV-101  на  инертоне-супер  (0,16 - 0,20 мм). Азот
особой  чистоты,  содержание O  не более 0,003%. Водород. Основные

                          2

стандартные  растворы  гетерофоса,  этафоса  и  их  метаболитов  в
н-гексане  по  1000  мкг/мл.  Хранят в холодильнике 6 мес. Рабочие

стандартные растворы гетерофоса, этафоса и метаболитов в н-гексане по 10 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение двух недель. Готовят серию стандартных растворов.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД и ДЭЗ марки «Цвет», «Газохром» и др. Микроизмельчитель тканей РТ-2 или мясорубка. Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1М. Микрошприцы на 10 мкл (МШ-10). Колбы: конические со шлифом и пробками вместимостью 100, 250 и 500 мл; круглодонные со шлифом для отгонки растворителей; мерные вместимостью 50 и 100 мл. Делительные воронки на 50, 100 и 250 мл. Воронки химические. Пробирки мерные со шлифом вместимостью 5 и 10 мл. Пипетки на 1, 5 и 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл.

Подготовка к определению. Для проведения клинических исследований на содержание гетерофоса и этафоса отбирают 100 мл суточной мочи, 2 мл крови.

Подготовка хроматографической колонки для ГЖХ. Колонку заполняют общепринятым в хроматографии способом, кондиционируют 48 ч при температуре на 20 °C выше рабочей температуры колонки.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Исследуемые органы и ткани (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг, мясо) измельчают в микроизмельчителе тканей или мясорубке. Отбирают 2 — 20 г средней пробы (для пищевых продуктов навеска 20 г), заливают в зависимости от взятой навески 15 — 250 мл смеси ацетона с 0,1 н хлороводородной кислотой (9:1) и оставляют на 1 ч, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой и встряхивая. Затем растворитель сливают в делительную воронку, фильтруя через вату. Заливают пробу новой порцией смеси и экстрагируют еще 30 мин. Экстракты объединяют. Пробу промывают смесью дважды порциями по 5 — 10 мл и смывы присоединяют к экстракту. В делительную воронку приливают 50 мл дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 50 мл н-гексана. Осторожно встряхивают в течение 5 мин. Отделяют верхний н-гексановый слой, сливая его через безводный сульфат натрия (7 — 10 г), насыпанный на фильтр, вложенный в воронку. Из нижнего водного слоя экстрагируют ФОП н-гексаном еще два раза порциями по 40 мл, объединяя экстракты с первым. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 40 — 45 °C примерно до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 — 0,4 мл) н-гексана. Доводят объем в пробирке н-гексаном точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

К 2 — 5 мл цельной крови, собранной в стаканы вместимостью 50 — 100 мл, прибавляют при непрерывном перемешивании стеклянной палочкой безводный сульфат натрия до образования сухой массы (20 г). Затем приливают 30 — 40 мл диэтилового эфира и 10 мин. перемешивают пробу с эфиром. Сливают эфир в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще раз. Эфирные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 20 — 25 °C до объема 1 — 2 мл. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре. К сухому остатку в колбе прибавляют 1 мл н-гексана и аликвоту хроматографируют.

Пробу мочи (20 мл) переносят в делительную воронку, разбавляют 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют 20 мл диэтилового эфира. Осторожно встряхивают 5 мин. и дают отстояться. Отделяют верхний эфирный слой, сливая его через безводный сульфат натрия. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают так же, как при экстракции из крови.

Из 10 г (мл) средней пробы молока, яиц, органов и тканей гетерофос извлекают 50 мл смеси ацетона с этанолом (3:1). Экстрагируют при встряхивании в течение 20 мин., после чего экстракты помещают в морозильную камеру холодильника на 1 ч. Пробы фильтруют через бумажный фильтр в колбы для отгонки либо в фарфоровые чашки, промывают посуду и фильтр 20 мл экстрагирующей смеси. Фильтрат концентрируют под вакуумом на ротационном испарителе (температура бани 40 °C) или упаривают в фарфоровых чашках на водяной бане при температуре 40 °C в слабом токе теплого воздуха до объема 1 — 2 мл. Остатки фильтруют через бумажный фильтр в делительные воронки. Колбы для отгонки или фарфоровые чашки тщательно ополаскивают 10 мл смеси этанола с водой (1:3), фильтруют в те же делительные воронки, добавляют 25 мл дистиллированной воды и встряхивают 0,5 — 1 мин. Из водно-спиртового раствора гетерофос трижды экстрагируют гексаном порциями по 30 мл в течение 2 — 3 мин. при встряхивании. Объединенный гексановый экстракт сушат безводным сульфатом натрия, помещают в колбы для отгонки или в фарфоровые чашки и концентрируют до объема 0,5 мл. Оставшийся растворитель отгоняют досуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилового спирта и аликвотную часть (2 — 3 мкл) хроматографируют.

    Условия  хроматографирования. Хроматограф марки "Цвет" с ТИД и
ДПР.  Колонка  стеклянная  спиральная длиной 1 м с диаметром 3 мм,
заполненная  хроматоном N-AW-HMDS (0,16 - 0,20 мм) с 5% SE-30 либо
инертоном-супер  N  (0,16  -  0,20  мм) с 3% OV-101. Рабочая шкала

                                  -10

электрометра при работе с ТИД 2 x 10 А, при работе с ДПР 20 x -12 10 A. Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/ч. При работе на ТИД расход газа-носителя (азота) 22 мл/мин., водорода — 14 — 17 мл/мин., воздуха — 400 мл/мин. При работе на ДПР расход газа-носителя (азота) 60 мл/мин., расход на продувку детектора 150 мл/мин. Температура (°C): испарителя — 210, детектора — 230, колонки — 190 и 127.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных условиях определения методом ГЖХ приведены в таблице 30.

№ п/п	Исследуемое соединение	Температура колонки, °C	Время удерживания		Относительное время удерживания	Концентрация рабочего раствора	Нижний предел обнаружения, нг
			ТИД	ДПР		<*>, мкг/мл
							ТИД	ДПР
Фаза — 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS, температура испарителя 210 °C
1	Гетерофос -«-»	190 127	3 мин. 36 с 25 мин.	- -	1 1	0,2 2,0	0,1 1,0	- -
2	Этафос Метаболиты	190	10 мин. 36 с	4 мин. 30 с	2,95	5,0 (0,1) <**>	1,2	0,1
1	O-Этил-Oфенилфосфат	190	1 мин. 30 с	-	0,42	1,0	0,2	-
2	O-Этил-Sпропилфосфат То же	190 127	54 с 6 мин. 15 с	- -	0,25 -	0,5 -	0,1 -	- -
3	O-Этил-O-фенил-Sметилтиофосфат	190	2 мин. 12 с	-	0,62	0,5	0,1	-
4	O-Этил-Oфенилтиофосфат	190	2 мин. 48 с	-	0,80	3,0	1,0	-
5	O-Этил-0,2,4- дихлорфенилтиофосфат	190	5 мин. 18 с	3 мин. 24 с	1,46	5,0 (1) <**>	1,2	0,2
6	O-метил-O-фенил- S-пропилтиофосфат	190 190	1 мин. 54 с 3 мин.	-	0,53 0,85	1,0	0,2	-
7	O-Этил-O-метил- S-пропилтиофосфат	127	4 мин. 42 с	-	0,19	0,5	0,2	-
8	O,O-Диметил- S-пропилтиофосфат	127	3 мин. 30 с	-	0,14	0,5	0,1	-
9	O-Этил-Oметилтиофосфат	127	2 мин. 12 с	-	0,09	2,0	2,0	-
10	O,O-Диметилтиофосфат	127	1 мин. 42 с		0,07	2,0	1,0	-
Фаза — 3% OV-101 на инертоне-супер, температура испарителя 225 °C
1	Гетерофос	190	2 мин. 42 с	-	-	0,1	0,02	-

---

<*> Для удобства работы можно приготовить смеси, в которых концентрация каждого соединения соответствует его концентрации, указанной в таблице для рабочих растворов. Смесь I: гетерофос, метаболиты № 1, 2, 3, 4, 6. Смесь II: гетерофос, метаболит № 5. Смесь III: метаболиты № 7, 8, 9, 10.

<**> В скобках указана концентрация раствора при работе с ДПР.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 — 5 мкл рабочих стандартных растворов. Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из пяти определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 — 5 мкл) конечного экстракта пробы получаются слишком большие пики или происходит «зашкаливание», пробу разбавляют н-гексаном. Для определения гетерофоса и всех его метаболитов каждую пробу следует анализировать при двух температурах колонки (190 и 127 °C), используя соответствующие стандарты.

Содержание пестицида или его метаболитов в пробе (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

                              AV H VK
                                2 1

X = -------, H V P 2 1

где:

A — количество пестицида или метаболита в стандартном растворе, введенном в хроматограф, мкг/мл;

V — объем стандартного раствора, введенного в хроматограф, 2 мкл;

H — высота пика стандартного раствора, введенного в 2 хроматограф, мм;

H — высота пика исследуемого раствора, мм; 1

V — объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл; 1

V — объем анализируемого экстракта, мл;

P — навеска или объем анализируемой пробы, г (мл);

K — поправочный коэффициент, составляющий для мяса, молока и яиц 1,2; 1,4; 1,5 соответственно.

Требования безопасности. Соблюдают общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами.

---