Временные методические указания по определению ацетала в воде, почве, картофеле, зерне и зеленой массе кукурузы и сои методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 21.11.1985 № 4029-85)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
21 ноября 1985 г. № 4029-85
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АЦЕТАЛА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, КАРТОФЕЛЕ, ЗЕРНЕ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ КУКУРУЗЫ И СОИ МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Срок действия Временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.
Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.
1. Характеристика анализируемого вещества
Название по номенклатуре СЭВ, МОС: ацетал.
Химическое название д.в.: 2-хлор-N-этоксиметил-2-метил-6-этилацетанилид.
CH
/ 3 CH OC H
─── / 2 2 5
// \\-N
\ ___ / \
─── COCH Cl
\ 2
C H
2 5
Эмпирическая формула: C H O NCl. 14 20 2
Синонимы: ацетохлор, невирекс — 60ES.
Физические и химические свойства:
Жидкость темно-желтого цвета с температурой кипения 125 °С при 40 Па. Растворим в органических растворах. В воде практически нерастворим. ЛД
50
(орально) 1160 мг/кг.
Применятся в качестве предвсходового гербицида на посевах сои, кукурузы и посадках картофеля.
2. Методика определения ацетала в воде, почве, картофеле, зерне и зеленой массе кукурузы и сои газожидкостной и тонкослойной хроматографией
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на экстракции пестицида из анализируемых проб органическим растворителем, очистке экстрактов почвы — водно-ацетоновой коагуляцией и переэкстракцией гексаном; зерна и зеленой массы кукурузы и сои — переэкстракцией из гексана ацетонитрилом, колоночной хроматографией экстрактов и определении газожидкостной хроматографией с применением детектора по захвату электронов или тонкослойной хроматографией (пластинки «Силуфол», подвижная фаза: четыреххлористый углерод — ацетонитрил в соотношении 10:1; проявитель 0,25% спиртовой раствор дифениламина, УФ-облучение).
2.1.2 Метрологическая характеристика методов приведена в табл. 1.
ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
| Метрологические характеристики | Значения метрологических характеристик | |||||||||
| ГЖХ | ТСХ | |||||||||
| вода | почва | картофель | зерно | зеленая масса | вода | почва | картофель | зерно | зеленая масса | |
| Диапазон | 0,002 - | 0,005 - | 0,005 - | 0,008 - | 0,004 - | 0,004 - | 0,02 - | 0,02 - | 0,04 - | 0,02 - |
| определяемых концентраций, мг/кг (мг/л) | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 2 | 2 | 2 | 0,8 | 0,4 |
| Предел обнаружения, мкг | 0,0002 | 0,0002 | 0,0002 | 0,0002 | 0,0002 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Предел обнаружения в пробах, мг/кг (мг/л) | 0,001 | 0,005 | 0,005 | 0,008 | 0,004 | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,04 | 0,02 |
| Среднее значение определения, % | 90,4 | 88 | 92,7 | 80 | 78,6 | 86 | 84 | 87,2 | 70,5 | 72 |
| Число параллельных определений | 6 | 10 | 9 | 6 | 9 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| Стандартное отклонение | 2,8 | 3,1 | 2,05 | 4,52 | 3,6 | 2,9 | 4,3 | 5,45 | 4,1 | 5,9 |
| Доверительный | 90,4 | 88 +/- | 92,7 | 80 +/- | 78,6 | 86 +/- | 84 +/- | 87,2 | 70,5 | 72 +/- |
| интервал среднего при | +/- 3,2 | 2,2 | +/- 1,6 | 4,74 | +/- 2,8 | 3 | 4,5 | +/- 5,7 | +/- 4,3 | 6,19 |
| Р = 0,95 и n = 1 | ||||||||||
2.1.3 Избирательность метода
Определению ацетала на мешают пестициды типа анилидов бензолкарбоновых кислот, ХОП, симм. триазины.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетал, содержание основного вещества не менее 96%.
Ацетонитрил, ч, ТУ 6-09-35-34-82.
Бензол, чда, ГОСТ 5955-81.
Толуол, чда, ГОСТ 5789-78.
Спирт этиловый технический, ГОСТ 18300-72.
Четыреххлористый углерод, ГОСТ 20288-81.
Дифениламин, чда, ГОСТ 5825-81.
Фосфорно-молибденовая кислота, хч, ТУ 6-09-3540-78.
Натрий сернокислый безводный, чда, ГОСТ 4166-81.
Силикагель марки КСК, зернение 0,25 — 0,50 мм, ГОСТ 3956-76.
Пластина «Силуфол» без люминофора 150 х 150 см производства ЧССР.
Алюминия оксид L 40/250 нейтральный для хроматографии производства ЧССР.
Хроматон N-AW-ДMCS (фр. 0,20 — 0,25 мм) с 5% силикона SE-30.
Азот особой чистоты газообразный, ГОСТ 9293-74, в баллоне с редуктором.
Фильтры бумажные беззольные «синяя лента», ТУ 6-09-1678-77.
2.3. Приборы, аппаратура и посуда
Хроматограф «Газохром 1106Э» или любой аналогичный прибор с детектором по захвату электронов.
Колонка стеклянная размером 150 х 0,3 см.
Колонки стеклянные размером 30 х 0,8 см.
Испаритель ротационный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74.
Аппарат для встряхивания АВУ-1 или аналогичный, ТУ 64-1-1081-73.
Микрошприц емкостью 10 мкг, ТУ 2-833-106.
Колбы грушевидные для отгонки растворителя, ГОСТ 10394-72.
Колбы мерные, цилиндры, мензурки, ГОСТ 1770-74.
Пипетки различной емкости, ГОСТ 20292-74.
Воронки химические, ГОСТ 8613-75, диаметром 56 мм.
Воронки делительные, ГОСТ 8613-75, емкость 100, 250 и 500 мл.
Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-80.
Колбы конические плоскодонные различной емкости, ГОСТ 1770-74.
Стаканы химические, ТУ 25-11-944-84.
Камера хроматографическая стеклянная, ГОСТ 10565-75.
Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.
Микропипетка или стеклянный капилляр.
Источник УФ-света ВИО-1, ТУ 3-3-1304-75.
2.4. Подготовка к определению
2.4.1 Приготовление стандартного раствора ацетала
Стандартный раствор ацетала с концентрацией 1 мг/мл готовят в мерной колбе емкостью 100 мл растворением навески 0,1 г в 100 мл толуола. Раствор устойчив в течение 10 дней.
2.4.2 Приготовление градуировочных растворов и построение калибровочного графика
В семь пробирок вносят 1, 2, 4, 5, 10, 15 и 20 мкл стандартного раствора ацетала и приливают по 10 мл толуола. Хроматографируют по 2 мкл каждого из полученных растворов, что соответствует 0,0001; 0,0002; 0,0004; 0,0005; 0,001; 0,0015 и 0,002 мкг ацетала. Хроматографирование каждого раствора проводят трижды и строят график зависимости средних высот пиков в мм от количества ацетала в мкг.
2.4.3 Подготовка хроматографической колонки для ГЖХ
Хроматографическую колонку размером 150 х 0,3 см заполняют хроматоном N-AW-ДMCS с нанесенной на него в количестве 5% неподвижной жидкой фазой SE-30, устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют в токе газа-носителя (скорость 30 — 50 мл/мин.) при температуре 250 °С в течение 40 ч и 300 °С — в течение 6 ч.
2.4.4 Подготовка абсорбционной колонки с сорбентом № 1 для очистки экстрактов при определении методом ГЖХ
Колонку размером 30 х 0,8 см заполняют на высоту 5 см нейтральным оксидом алюминия и промывают 5 мл ацетона, затем 10 мл гексана.
2.4.5 Подготовка адсорбционной колонки с сорбентом № 2 для очистки экстракта при определении методом ТСХ
Колонку размером 30 х 0,8 см заполняют на высоту 2 см нейтральным оксидом алюминия, затем на высоту 5 см — силикагелем КСК и промывают, как описано в п. 2.4.4.
2.4.6 Приготовление подвижной фазы
В хроматографической камере за 30 мин. до хроматографирования смешивают четыреххлористый углерод и ацетонитрил в соотношении 10:1.
2.4.5 Приготовление проявляющего реактива
0,25% раствора дифениламина готовят растворением 0,25 г в 100 мл этилового спирта. Раствор устойчив в течение недели.
2.4.6 Приготовление стандартной шкалы для тонкослойной хроматографии
На пластине «Силуфол» на расстоянии 15 мм от края намечают линию старта, на которую наносят в виде отдельных пятен на расстоянии 15 мм друг от друга 1, 2, 5, 10 и 20 мкл стандартного раствора ацетала, что соответствует 1, 2, 5, 10 и 20 мкг вещества.
2.5. Отбор проб
Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979, № 2051-79.
2.6. Проведение определения
2.6.1 Экстракция и очистка экстрактов
Вода. 10 — 250 мл средней пробы воды помещают в делительную воронку и ацетал экстрагируют двумя порциями гексана по 50 мл. Гексановые экстракты последовательно один за другим пропускают через безводный сернокислый натрий (20 г), помещенный на бумажный фильтр в химическую воронку. Растворитель удаляют до 1 — 2 капель в остатке (ротационный испаритель, ток воздуха). Остаток растворяют в 10 мл ацетона и аликвоту хроматографируют.
Почва. 10 — 50 г средней воздушно-сухой пробы почвы помещают в коническую колбу с притертой пробкой и экстрагируют дважды смесью ацетона (25 мл) и бензола (25 мл), встряхивая каждый раз в течение 30 мин. Почву отфильтровывают под вакуумом, объединенный экстракт пропускают через безводный сернокислый натрий (20 г), растворители отгоняют на ротационном испарителе до объема 0,5 — 1 мл, затем досуха — в токе воздуха.
Остаток растворяют в смеси 5 мл ацетона и 25 мл дистиллированной воды, встряхивая в течение 3 — 5 мин. Выпавшие хлопья отфильтровывают через бумажный фильтр, помещенный в коническую воронку, и ацетал дважды экстрагируют из фильтрата гексаном порциями по 50 мл. Гексановый экстракт пропускают через безводный сернокислый натрий (20 г), гексан отгоняют до объема 5 мл. Аликвоту полученного раствора хроматографируют.
Картофель. Навеску пробы (10 — 50 г) измельчают, помещают в коническую колбу с притертой пробкой и экстрагируют гексаном (50 мл) при встряхивании в течение 30 мин. Гексановый экстракт сливают в делительную воронку. Пробу картофеля дважды промывают свежими порциями гексана (по 30 мл). Объединенные гексановые вытяжки промывают дважды дистиллированной водой (по 30 мл) и сушат, пропуская через слой безводного сернокислого натрия (20 г). Гексан отгоняют на ротационном испарителе, затем отдувают в токе воздуха до 1 — 2 капель в остатке. Остаток растворяют в 5 мл ацетона и аликвоту полученного раствора хроматографируют.
Зеленая масса. 10 — 50 г пробы измельчают ножницами или ножом, помещают в коническую колбу с притертой пробкой, заливают 50 мл ацетона, экстрагируют при встряхивании в течение 30 мин. и отфильтровывают под вакуумом. Пробу экстрагируют повторно свежей порцией ацетона (50 мл). Экстракты объединяют, приливают 100 мл гексана, тщательно встряхивают с 20 г хлористого натрия, выделившийся водный слой отделяют и экстрагируют его 50 мл гексана. Органические слои объединяют, смешивают в делительной воронке и выделившееся небольшое количество воды сливают. Органический экстракт пропускают через слой безводного сернокислого натрия (40 г) в химической воронке и концентрируют до отсутствия запаха растворителей (ротационный растворитель, ток воздуха). Маслянистый остаток растворяют в 20 мл гексана и встряхивают в течение 1 мин. с 5 мл 40% водной суспензии фосфорно-молибденовой кислоты. Водный слой отделяют, гексановый — экстрагируют 10 мл дистиллированной воды, пропускают через слой безводного сернокислого натрия (20 г), после чего сернокислый натрий промывают 10 мл гексана. Из гексанового раствора ацетал дважды экстрагируют ацетонитрилом порциями 30 и 20 мл. Ацетонитрильный (нижний) слой пропускают через бумажный фильтр и концентрируют (ротационный растворитель, ток воздуха) до 1 — 2 капель в остатке.
Остаток переносят количественно тремя порциями гексана по 1 — 2 мл в колонку с сорбентом № 1 и элюируют 50 мл гексана (элюат отбрасывают) и 10 мл смеси гексан — ацетон в соотношении 10:1. Второй элюат концентрируют до объема 2 мл и аликвоту раствора хроматографируют.
Для тонкослойной хроматографии остаток после отгонки ацетонитрила очищают на колонке с сорбентом № 2 при тех же условиях элюирования, что и на колонке с сорбентом № 1.
Зерно кукурузы и сои. 25 г зерна измельчают на кофемолке, помещают в коническую колбу с притертой пробкой и дважды экстрагируют ацетоном порциями 50 и 25 мл при встряхивании по 30 мин. Экстракты фильтруют под вакуумом. К фильтрату приливают 100 мл гексана, раствор пропускают через безводный сернокислый натрий (20 г) и концентрируют (ротационный растворитель, ток воздуха) до отсутствия запаха растворителей.
Остаток (масло) растворяют в 30 мл гексана, ацетал экстрагируют ацетонитрилом и экстракт очищают на колонках, как описано для зеленой массы (ГЖХ и ТСХ).
2.6.2 Хроматографирование
2.6.2.1 Газожидкостная хроматография
Аликвоту очищенных экстрактов хроматографируют при следующих условиях: -11
рабочая шкала электрометра 9 х 10 а;
скорость протяжки картограммы 600 мм/час;
колонка стеклянная длиной 150 см, внутренним диаметром 3 мм, заполненная хроматоном N-AW-ДMCS (фр. 0,20 — 0,25 мм) с 5% силикона SE-30;
температура (°С) термостата колонок 200, испарителя — 225, детектора — 230;
расход газа-носителя в мл/мин.: через колонку 40 +/- 2, продувочную камеру детектора 60 +/- 2;
линейность детектирования от 0,0002 до 0,002 мкг;
объем, вводимый в испаритель, 2 — 4 мкг;
минимально детектируемое количество 0,0001 мкг;
абсолютное время удерживания 2,25 мин.;
альтернативная колонка: длина 150 см, внутренний диаметр 3 мм, заполненная хроматоном N-AW-ДMCS с 5% силикона ХЕ-60;
абсолютное время удержания при тех же условиях 4,4 мин.
Хроматографирование проводят трижды, измеряют высоту пиков, соответствующих ацеталу, вычисляя среднее значение. По среднему значению высоты пика и калибровочному графику находят количество ацетала в аликвоте.
2.6.2.2 Тонкослойная хроматография
Очищенные экстракты проб концентрируют до 1 — 2 капель растворителя, стенки колбы обмывают 0,5 — 1 мл гексана, гексан отдувают в слабом токе воздуха до объема 0,3 мл и полученный раствор наносят на пластинку «Силуфол» радом со стандартной шкалой.
Пластинку помещают в хроматографическую камеру с подвижной фазой, развивают на высоту 10 см, после чего вынимают из камеры, подсушивают на воздухе, опрыскивают проявляющим реактивом и, не подсушивая, помещают под источник УФ-света. После пятиминутной экспозиции пластинку вторично обрабатывают проявляющимся реактивом и снова помещают под источник УФ-света. Ацетал проявляется в виде серо-зеленых пятен на светлом фоне с R = 0,6 +/- 0,1.
f
Для количественного определения измеряют с помощью прозрачной миллиметровой бумаги площади пятен проб и близких им по интенсивности окраски пятна стандартной шкалы.
2.7. Обработка результатов анализа
Содержание ацетала в объекте (Х) в мг/кг (мг/л) вычисляют по формулам:
100 х А х V
2
Х = ------------ (для метода ГЖХ); V х Р х R 1
100 х В х S
пр
Х = ------------- (для метода ТСХ), S х Р х R ст
где:
А — количество ацетала в хроматографируемом объеме пробы, найденное по калибровочному графику;
В — количество ацетала в стандартном пятне, мкг;
Р — количество анализируемой пробы, г (мл);
R — степень определения, найденная предварительно, %;
S , S - площади пятен пробы и стандартного раствора соответственно, пр ст
кв. мм.
3. Требования безопасности
Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях, а также Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР № 2455-81 от 20.10.1981.
4. Разработчики
Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт гербицидов и регуляторов роста растений (ВНИИТИГ), г. Уфа.
Методические указания апробированы в институтах ВНИИХСЗР (т. Новикова К.Ф., Алдомина Т.В.) и институте физиологии растений АН УССР (т. Кофман И.Ш.).