Методические указания по определению лепидоцида на обработанных им растениях иммунофлюоресцентным методом
(утв. Минздравом СССР 22.05.1985 № 3891-85)
22 мая 1985 г. № 3891-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЛЕПИДОЦИДА НА ОБРАБОТАННЫХ ИМ РАСТЕНИЯХ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ
Краткая характеристика препарата. Лепидоцид - бактериальный инсектицидный препарат для борьбы с листогрызущими насекомыми. Действующим началом препарата служат споры и продукты жизнедеятельности бактерий Bacillus thuringiensis Var. kurstaki.
Он практически не токсичен для теплокровных животных: при введении в желудок ЛД для белых мышей превышает 15 г/кг, для белых крыс — 50 9,7 +/- 1,9 г/кг. Споры в организме теплокровных не прорастают и не вызывают инфекционного заболевания. Препарат представляет собой аморфный порошок кремового цвета со слабым специфическим запахом. В воде образует нестойкую суспензию.
Принцип метода. В основу определения остаточных количеств лепидоцида на растениях положены реакция взаимодействия антигена из спор микроорганизма с меченными флюоресцеином антителами и выявление спор в люминесцентном микроскопе по специфическому свечению. Использован непрямой иммунофлюоресцентный метод.
Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения: одна спора в 50 полях зрения, что соответствует (при титре 11 3 лепидоцида 10 спор/г) 0,01 мкг препарата на 1 г пробы, или 10
спор на 1 г пробы. Ошибка метода 15%.
Избирательность метода. Метод специфичен при условии использования иммунных сывороток против спор микроорганизма, активных в разведениях 1:160 — 1:640 и выше.
Реактивы и материалы. Этанол х.ч. Хлорид натрия, 0,85-процентный раствор. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сухая люминесцентная ослиная сыворотка против глобулинов кролика производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва. Специфическая иммунная сыворотка кролика против спор.
Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп марки МБИ-15 или другой аналогичный. Объект-микрометр. Центрифуга с
-1
частотой вращения 12 мин. . Термостат на 37 °C. Аппарат для встряхивания. Колбы. Пробирки бактериологические. Чашки Петри.
Предметные стекла. Микропипетки.
Подготовка к анализу. Приготовление специфических сывороток против спор Bacillus thuringiensis Var. kurstaki. Для получения специфической иммунной сыворотки проводят иммунизацию кроликов однократной инъекцией в область подколенного лимфатического узла
суспензии спор чистой культуры, прогретой в течение 1 ч на кипящей 9
водяной бане, в дозе 10 микробных клеток на животное. Через месяц кроликов реиммунизируют второй однократной инъекцией антигена из спор в область подколенного лимфатического узла в той же дозе. Спустя месяц после реиммунизации проверяют титр сыворотки в непрямой реакции иммунофлюоресценции. При титре не менее 1:160
получают сыворотку в нужном количестве и используют для проведения анализа. Сыворотки консервируют мертиолатом в соотношении 1:10000 или подвергают лиофильному высушиванию.
Определение титра специфической иммунной сыворотки. Из чистой культуры или из товарной формы препарата готовят взвесь спор в
7
физиологическом растворе в концентрации 10 спор в 1 мл (из препарата готовят суспензию в разведении 1:1000).
На обезжиренные сухие предметные стекла наносят по капле взвеси и готовят из нее мазки, равномерно распределяя каплю. После подсушивания на воздухе мазки фиксируют этанолом в течение 30 мин., обрабатывают иммунной сывороткой в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. Далее препараты обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против глобулинов кролика, как описано ниже, просматривают в люминесцентном микроскопе и оценивают реакцию по интенсивности свечения оболочки спор.
Для контроля иммунологической специфичности готовят три контрольных препарата: мазок обрабатывают физиологическим раствором вместо иммунной кроличьей сыворотки; нормальной кроличьей сывороткой; только люминесцирующей антивидовой сывороткой.
За титр сыворотки принимают ее максимальное разведение, при котором еще отмечается четкое, «полыхающее» зеленое свечение оболочки спор. В контрольных мазках свечение оболочки спор отсутствует. Для анализа используют сыворотки, имеющие титр не менее 1:160. Рабочим разведением служит разведение, равное 1/2 титра, т.е. 1:80.
Отбор проб. Пробы отбирают в стерильные бумажные пакеты, сохраняют в прохладном месте при температуре не выше 5 °C и анализируют не позднее 5 — 6 дней.
Ход анализа. Для анализа 1 г листьев измельчают с соблюдением правил асептики, добавляют 15 — 20 мл стерильного физиологического
раствора и встряхивают в колбе на шуттель-аппарате в течение 20 мин. Смыв фильтруют через два слоя стерильной марли и ваты и
-1
центрифугируют 20 мин. при частоте вращения 12 тыс. мин. . Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 0,01 мл физиологического раствора. На предметные стекла наносят 0,01 мл суспензии и равномерно распределяют ее на площади в 1 кв. см. Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этанолом 30 мин. Затем наносят иммунную сыворотку против спор Bacillus thuringiensis Var. kurstaki в рабочем разведении и помещают во влажную камеру на 20 мин. при температуре 37 °C. Влажную камеру создают путем помещения в чашку Петри фильтра, смоченного
физиологическим раствором.
По истечении времени инкубации препараты промывают 1 — 2 мин. проточной водой, высушивают на воздухе, а затем обрабатывают ослиной сывороткой против глобулинов кролика в ее рабочем разведении и оставляют в контакте с ней в течение 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Затем препараты промывают водой 1 — 2 мин., высушивают на воздухе и просматривают в люминесцентном микроскопе с иммерсионным объективом 90 x 1,25 и окуляром 4x, используя нефлюоресцирующее иммерсионное масло.
Одновременно готовят контрольные препараты из взвеси лепидоцида 1:1000 на физиологическом растворе и из проб, взятых на необработанных участках, которые обрабатывают по той же схеме.
Для анализа плодов (например, яблок) исследования проводят следующим образом: целый плод взвешивают, заливают определенным объемом стерильного физиологического раствора, достаточного для полного смачивания. Смыв проводят путем встряхивания сосуда с пробой на шуттель-аппарате в течение 20 мин. Смыв фильтруют, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость, ресуспендируют осадок в 0,1 мл физиологического раствора, готовят препарат на предметном стекле и обрабатывают его, как указано выше.
Обработка результатов анализа. С помощью микрометра измеряют площадь поля зрения микроскопа при выбранном для работы увеличении. При использовании объектива 90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм.
На каждом мазке под иммерсией просматривают 50 полей зрения, в которых подсчитывают все споры, имеющие яркое, «полыхающее» зеленое свечение. Вычисляют среднее значение количества спор в одном поле зрения. Число спор в 1 кг пробы вычисляют по формуле:
1000aSV
a — число спор в одном поле зрения;
S — площадь мазка на предметном стекле, по условиям методики 100 кв. мм;
S — площадь одного поля зрения. При использовании объектива 1 90 x 1,25 и окуляра 4x она равна 0,02 кв. мм;
V — разведение, равно 0,1, т.к. осадок ресуспендируют в 0,1 мл;
V — объем суспензии, нанесенной на стекло. По условиям 1 методики он равен 0,01 мл;
1000 — коэффициент для пересчета граммов в кг.
С учетом значений известных величин формула упрощается:
8
100 x 0,1 x 1000 x a 10 x a
X = -------------------- = -------. 0,01 x 0,02 x M 2 x M
Требования безопасности. Соблюдаются общие меры безопасности при работе с химическими реактивами и рекомендуемые для работы с условно-патогенными микроорганизмами: предупреждение загрязнения проб и соблюдение правил личной гигиены.