Методические указания по идентификации гамма-ГХЦГ, его изомеров (альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ) и метаболитов (полихлорированных фенолов) в биологических жидкостях (крови), органах, тканях и субклеточных фракциях печени теплокровных животных методом тонкослойной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 03.01.1985 № 3194-85)

3 января 1985 г. № 3194-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ \gamma -ГХЦГ, ЕГО ИЗОМЕРОВ ( \alpha -, \beta — И \delta -ГХЦГ) И МЕТАБОЛИТОВ (ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ) В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (КРОВИ), ОРГАНАХ, ТКАНЯХ И СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ПЕЧЕНИ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

---

<*> Разработаны В.Ф. Демченко, Е.И. Давидюк, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).

Краткая характеристика препаратов приведена в таблице 9.

Таблица 9

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ

Пестицид	Молекулярная масса	Температура, °C		Давление паров при 20 °C, Па
		плавления	кипения
1,2,3,4,5,6-	291	112,8		4,0
Гексахлорциклогексан, гамма-изомер (линдан, гамма-ГХЦГ)
1,2,3,4,5,6-	291	157,5 — 158,5		2,67
Гексахлорциклогексан, альфа-изомер ГХЦГ
1,2,3,4,5,6-	291	309		6,67
Гексахлорциклогексан, бета-изомер ГХЦГ
1,2,3,4,5,6-	291	138 — 139		2,67
Гексахлорциклогексан, дельта-изомер ГХЦГ
4-Хлорфенол (4-ХФ)	128,5	49,9	217	-
2,4-Дихлорфенол (2,4-ДХФ)	163	45	210	-
2,4,5-Трихлорфенол	197,5	-	-	-
(2,4,5-ТХФ)
2,4,6-Трихлорфенол	197,5	60	246	-
(2,4,6-ТХФ)
2,3,4,6-Тетрахлорфенол	221,5	-	-	-
(2,3,4,6-ТеХФ)
2,3,4,5,6-Пентахлорфенол	226	191	310	0,01
(ПХФ)
Гексахлорбензол (ГХБ)	284,8	231	322	-

Принцип метода. Методика основана на тонкослойном хроматографическом определении \gamma -гексахлорциклогексана, его \alpha -, \beta — и \delta -изомеров и метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале теплокровных.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 10. Пределы обнаружения изомеров и метаболитов гексахлорциклогексана указаны в таблице 11.

Таблица 10

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В БИОСРЕДАХ

Пестицид	Анализируемый объект	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, +/- %	Относительное стандартное отклонение, %	Доверительный интервал, +/- %
ГХБ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Митохондрии Ядра Постмикросомальная фракция	44,00 59,40 53,40 63,00 93,00 53,50 83,33 90,00 85,00	5,47 16,79 14,52 7,42 15,65 19,64 10,79 7,07 11,18	0,12 0,28 0,27 0,12 0,17 0,37 0,13 0,08 0,13	6,78 20,81 17,99 9,20 19,39 24,34 26,84 17,59 27,81
альфа-	Кровь	50,00	0	0	0
ГХЦГ	Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	59,03 27,77 79,37 55,56 41,67 86,67 86,67 66,67 70,00	6,01 11,82 12,62 11,82 0 15,99 24,04 12,47 10,00	0,10 0,42 0,17 0,21 0 0,18 0,28 0,19 0,14	14,95 29,40 31,39 29,40 0 39,77 59,79 31,02 24,87
гамма-	Кровь	50,00	0	0	0
ГХЦГ	Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	86,81 27,77 62,50 69,45 41,67 86,67 90,00 70,00 80,00	6,01 11,82 0 12,02 0 5,76 0 10,00 20,00	0,07 0,42 0 0,17 0 0,07 0 0,14 0,25	14,95 29,40 0 29,90 0 14,33 0 24,87 49,75
бета-ГХЦГ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	80,00 83,34 31,25 79,87 76,39 34,39 96,67 96,67 70,00 80,00	0 0 10,01 6,94 12,02 12,04 5,76 5,57 10,00 20,00	0 0 0,32 0,09 0,16 0,35 0,06 0,06 0,14 0,25	0 0 24,90 17,26 29,90 29,95 14,33 13,85 24,87 49,75
дельта-	Кровь	56,67	5,77	0,10	17,61
ГХЦГ	Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	86,81 41,67 55,56 48,61 52,09 100,00 93,33 66,67 80,00	6,01 0 12,03 12,02 10,41 0 13,03 12,47 0	0,07 0 0,22 0,25 0,20 0 0,14 0,19 0	14,95 0 29,92 29,90 25,89 0 32,41 31,02 0
ПХФ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	36,67 26,48 21,08 41,19 51,28 49,52 16,00 80,00 32,00 53,33	5,76 9,01 2,83 5,35 10,00 5,12 7,07 20,00 8,00 24,04	0,16 0,35 0,07 0,13 0,20 0,10 0,44 0,25 0,25 0,28	17,61 14,43 2,93 5,61 24,87 6,35 17,56 49,75 19,90 59,79
2,3,4,6-	Кровь	41,67	2,88	0,07	8,80
ТеХФ	Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	71,43 61,09 79,89 85,00 86,00 36,67 60,00 17,33 80,00	0 9,08 13,06 18,71 21,91 5,76 20,00 4,62 34,64	0 0,15 0,16 0,22 0,25 0,16 0,33 0,27 0,43	0 22,58 13,71 23,19 27,15 14,33 49,75 11,49 86,16
2,4,5-ТХФ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	40,00 78,17 32,78 71,90 62,22 56,07 40,00 86,67 16,00 86,67	0 11,11 10,46 7,45 7,97 7,92 0 12,47 4,00 12,47	0 0,14 0,32 0,10 0,13 0,14 0 0,14 0,25 0,14	0 27,63 16,64 9,23 19,82 12,60 0 31,02 9,95 31,02
2,4-ДХФ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Ядра Митохондрии Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	28,33 38,00 44,00 36,00 30,00 40,00 33,33 57,33 17,33 66,67	2,82 7,42 11,18 5,48 0 10,00 12,47 24,72 4,62 24,04	0,10 0,20 0,25 0,15 0 0,25 0,37 0,43 0,27 0,36	8,61 9,20 13,85 6,78 0 12,39 31,02 61,48 11,49 59,79
4-ХФ	Кровь Почки Печень Сердце Мозг Жир Субклеточные фракции печени	37,50 30,00 20,00 37,50 40,00 35,00 44,00	5,00 5,77 10,00 17,09 8,19 5,77 12,00	0,13 0,19 0,50 0,46 0,20 0,16 0,27	7,96 9,18 24,87 27,19 13,03 9,18 29,85

Таблица 11

ЕГО ИЗОМЕРОВ И МЕТАБОЛИТОВ В БИОСУБСТРАТАХ

Пестицид	Анализируемый объект		Пестицид	Анализируемый объект
	кровь, субклеточные фракции печени, мг/л	органы, ткани, мг/кг		кровь, субклеточные фракции печени, мг/л	органы, ткани, мг/кг
ГХБ альфа-ГХЦГ гамма-ГХЦГ бета-ГХЦГ дельта-ГХЦГ ПХФ	0,02 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01	0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,05	2,3,4,6-ТеХФ 2,4,6-ТХФ 2,4,5-ТХФ 2,4-ДХФ 4-ХФ	0,01 0,01 0,01 0,02 0,02	0,05 0,05 0,05 0,1 0,1

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии ГХБ, ГХПК, ГПХ, 2,4'- и 4,4'-ДДТ, ДДД, ДДЭ и некоторых других ХОП.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. н-Гексан ч. Спирт этиловый ректиф. 2-Феноксиэтанол ч. Аммиак водный 25-процентный ч. Пероксид водорода ч. Сульфат натрия безводный ч. (прокаленный). Хлорид натрия х.ч. Нитрат серебра х.ч.

Проявляющие реагенты. № 1: к раствору 0,5 г нитрата серебра в 5 мл дистиллированной воды добавляют 7 — 10 мл 25-процентного водного аммиака. Полученную смесь разбавляют ацетоном до 100 мл и перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

№ 2: к раствору 0,1 г нитрата серебра в 1 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола, 190 мл ацетона, 1 — 2 капли пероксида водорода, тщательно перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

Стандартные растворы препаратов в н-гексане с концентрацией 100 и 10 мкг/мл хранят в холодильнике в посуде с пришлифованными пробками.

    Приборы  и  посуда.  Аппарат  для  встряхивания. Баня водяная.
Испаритель   ротационный  ИР-1М.  Микроизмельчитель  тканей  РТ-2.
Облучатель    ртутно-кварцевый    настольный   ОКН-11.   Установка
компрессорная.  Центрифуга лабораторная клиническая ОПН-3. Воронки
делительные   и   конические.  Камеры  хроматографические.  Колбы:
конические,    грушевидные    на   шлифе,   мерные.   Микропипетки
вместимостью  0,1 мл. Микрошприцы на 10 мкл МШ-10. Пипетки мерные.
Пробирки  мерные  на  шлифе.  Пульверизаторы  стеклянные. Цилиндры
мерные.  Пластинки  хроматографические  стандартные  "Силуфол" или
"Кизельгель 60" F    размером 20 x 20 см.

             254

Отбор и хранение проб. Пробы отбирают в лабораторных условиях и сразу же помещают в испарительную камеру холодильника (хранят на льду не дольше 5 сут.).

Ход анализа. Экстракция. Существуют два способа экстракции препарата из проб крови.

1. Цельную кровь (1 — 5 мл) помещают в мерную пробирку на шлифе, приливают 3 — 5 мл н-гексана, перемешивают и далее экстрагируют на аппарате для встряхивания со средней интенсивностью в течение 5 — 7 мин.

После разделения слоев гексановый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью пипетки, соединенной с резиновой грушей, и фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенного в коническую воронку с подложкой из обезжиренной ваты. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Если образуется устойчивая эмульсия и фазы разделить трудно, в пробирку вносят несколько капель этанола или 0,1 — 0,2 г (на кончике скальпеля) хлорида натрия.

2. Пробу крови (1 — 5 мл) тщательно растирают с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Помещают в плоскодонную колбу на шлифе и экстрагируют н-гексаном, взятым в 1,5-кратном по отношению к гомогенату объеме. Экстракт осторожно декантируют, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия.

Пробу субклеточной фракции экстрагируют н-гексаном (см. способ 1 для крови). При образовании устойчивой эмульсии следует провести центрифугирование смеси при 3000 — 5000 об./мин. в течение 3 — 5 мин.

Гексановый экстракт отделяют и фильтруют через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Навеску органов и тканей (печени, почек, сердца и др.) тщательно измельчают ножницами, затем помещают в тефлоновую пробирку, заливают н-гексаном (5 мл растворителя на 1 г пробы) и гомогенизируют на микроизмельчителе тканей при 3000 — 5000 об./мин. в течение 5 мин. Экстракт декантируют через слой безводного сульфата натрия в приемную колбу. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Концентрирование экстрактов проводят в вакууме на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35 — 38 °C, затем в токе азота особой чистоты до объема 0,1 — 0,2 мл.

Хроматографирование в тонком слое сорбента. Аликвотную часть (0,1 мл) экстракта с помощью микропипетки (микрошприца) наносят на хроматографическую пластинку «Силуфол» или «Кизельгель 60» F . 254

Рядом  с пробой наносят различные количества стандартных растворов
изомеров  ГХЦГ, хлорированных фенолов (по 0,2; 1; 2; 5 мкг каждого

компонента).

    Пластинку   помещают   в   камеру   для   хроматографирования,
содержащую   смесь   н-гексана   с   ацетоном  в  соотношении  4:1
("Силуфол") или 6:1 ("Кизельгель 60" F   ). Время насыщения камеры

                                  254

30 мин.

После хроматографирования (длина пробега растворителя 15 — 17 см) пластинку проветривают в горизонтальном положении, а затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов с помощью пульверизатора, подключенного к воздушному компрессору.

Зоны локализации \gamma -, \alpha -, \beta — и \delta -ГХЦГ, пентахлорфенола, 2,3,4,6-тетрахлорфенола, 2,4,6- и 2,4,5-трихлорфенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфенола обнаруживаются

на  хроматограммах  после  облучения  УФ-светом в виде бурых пятен
(величины R  приведены в таблице 12).

       f

Таблица 12

ВЕЛИЧИНЫ R ИЗОМЕРОВ ГЕКСАХЛОРЦИКЛОГЕКСАНА F И НЕКОТОРЫХ ХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ НА ПЛАСТИНКАХ «СИЛУФОЛ» И «КИЗЕЛЬГЕЛЬ 60» F 254

Пестицид	«Кизельгель 60» F , 254 подвижная фаза гексан — ацетон (6:1)	«Силуфол», подвижная фаза гексан — ацетон (4:1)
ГХБ альфа-ГХЦГ	0,96 0,87	- 0,98
гамма-ГХЦГ	0,79	0,81
бета-ГХЦГ	0,73	0,77
дельта-ГХЦГ	0,64	0,74
2,3,4,5,6-Пентахлорфенол	0,18	0,69
2,3,4,6-Тетрахлорфенол	0,39	0,71
2,4,6-Трихлорфенол	0,57	0,73
2,4,5-Трихлорфенол	0,43	0,68
2,4-Дихлорфенол	0,42	0,65
4-Хлорфенол	0,34	0,60

Количественную оценку содержания изомеров ГХЦГ и полихлорированных фенолов в пробе проводят визуально или денситометрически на приборе типа «Оптон».

Оставшуюся часть экстракта при необходимости также подвергают хроматографированию после экспресс-очистки концентрированной серной кислотой.

К экстракту, количественно перенесенному в центрифужную пробирку, прибавляют 2 — 3 капли концентрированной серной кислоты, после чего содержимое встряхивают. После разделения фаз (через 5 — 7 мин.) экстракт наносят с помощью микропипетки на хроматографическую пластинку и далее поступают так же, как описано выше. В этом случае обнаруживаются все перечисленные компоненты, кроме 4-хлорфенола.

Обработка результатов анализа. Содержание \gamma -ГХЦГ, его изомеров и метаболитов в анализируемом объекте (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

                             AV
                               2

X = K ---, V P 1

где:

K — поправочный коэффициент, приведенный в таблице 13;

A — содержание препарата, обнаруженное в аликвоте экстракта, взятой для хроматографирования, мкг;

V — объем аликвоты экстракта, нанесенной на 1 хроматографическую пластину, мл;

V — конечный объем экстракта, мл; 2

P — масса (объем) пробы, г (мл).

Таблица 13

ЕГО ИЗОМЕРОВ И МЕТАБОЛИТОВ В БИОСУБСТРАТАХ

Объект исследования	ГХБ	альфа- ГХЦГ	гамма- ГХЦГ	бета- ГХЦГ	дельта- ГХЦГ	ПХФ	2,3,4,6- ТеХФ	2,4,6- ТХФ	2,4,5- ТХФ	2,4- ДХФ	4-ХФ <*>
Кровь	2,3	2,0	2,0	1,7	1,8	2,7	2,4	2,7	2,5	3,5	2,7
Почки	1,7	1,7	1,2	1,2	1,2	3,9	1,4	1,4	1,3	2,6	3,3
Печень	1,9	3,6	3,6	3,2	2,4	4,7	1,6	1,2	3,0	2,3	5,0
Сердце	1,6	1,3	1,6	1,3	1,8	2,4	1,1	1,2	1,4	2,8	2,7
Мозг	1,1	1,8	1,4	1,3	2,0	1,9	1,2	1,2	1,6	3,3	2,5
Жир	1,9	2,4	2,4	2,9	1,9	2,0	1,8	1,2	1,8	2,5	2,8
Ядра	1,1	1,2	1,2	1,0	1,0	6,0	2,7	2,7	2,5	3,0	2,3
Митохондрии	1,2	1,2	1,1	1,0	1,1	1,3	1,7	1,7	1,2	1,7	2,3
Микросомальная фракция Постмикросомальная фракция	- 1,2	1,5 1,4	1,4 1,3	1,4 1,3	1,5 1,3	3,1 1,9	2,9 1,7	2,7 1,2	6,0 1,2	5,7 1,5	2,3 2,3

---

---