Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Методика определения Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье

(утв. Минздравом СССР 29.12.1984 № 3184-84)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ

Оборудование и материалы

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78.

2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлабприбор»).

3. Кофемолка ЭКМ-ЗУ.

4. Хроматограф газовый серии «Цвет-100» с детектором постоянной скорости рекомбинации (ДЭЗ); колонка стеклянная 1 м x 0,4 см с жидкой фазой OV-1 или OV-101 на Хроматоне N-супер («Лахема», ЧССР); в качестве самописца — регистрирующий потенциометр КСП-4 модификации 41.130.90.909 или 41.140.90.910 с диапазоном измерений 1 мВ; газ — носитель и продувочный газ — азот особой чистоты.

5. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41.

6. Магнитная мешалка любого типа.

7. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл, микрошприц МШ-1 или «Газохром-101» на 1 мкл.

8. Камеры для ТСХ с притертыми крышками (например, стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 завода «Дружная горка»).

9. Пластины для ТСХ «Силуфол» размером 20 x 20 см (ЧССР).

10. Воронки делительные ВД-2-250 по ГОСТ 8613-75.

11. Колбы плоскодонные конические на 250 мл с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

12. Колбы круглодонные на 250 мл с НШ 29, тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10394-72.

13. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72.

14. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

15. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Т-2 токсин кристаллический, номер по каталогу Т 4887, фирма «Сигма», США (по поводу получения стандарта Т-2 токсина обращаться в Институт питания АМН СССР).

18. Ацетонитрил ч. по ТУ 6-09-3534-74.

19. Ацетон ч.д.а. по ГОСТ 2603-79.

20. Бензол ч.д.а. по ГОСТ 5955-75.

21. Гексан ч. по ТУ 6-09-3375-78.

22. Метанол ч.д.а. по ГОСТ 6995-77.

23. Изопропиловый спирт (пропанол-2) х.ч. по ТУ 6-09-402-75.

24. Кислота серная ч.д.а. по ГОСТ 4204-77.

25. Калий хлористый ч.д.а. по ГОСТ 4234-77.

26. Натрий сернокислый безводный ч.д.а. по ГОСТ 4166-76.

27. Натрий углекислый ч.д.а. по ГОСТ 83-79, свежепрокаленный.

28. Трифторуксусный ангидрид ч. по ТУ 6-09-4135-75.

1. Экстракция

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12430-66 «Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе». Отобранную пробу измельчают в течение 1 — 2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 20 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 10 мл 4% раствора хлористого калия и 90 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата (аликвота соответствует 14 г исходного образца).

2. Очистка экстракта

2.1. Жидкость — жидкостная экстракция

В делительную воронку на 250 или 500 мл переносят 70 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана (или гептана). После встряхивания и разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с 40 мл гексана, каждый раз отбирая верхний гексановый слой. Ацетонитрильный слой разбавляют 17 мл дистиллированной воды и экстрагируют 50 и 25 мл бензола. Верхние бензольные слои отделяют и сушат безводным сернокислым натрием (10 — 15 г) в течение 0,5 часа. Раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл в НШ 29. Сернокислый натрий промывают 10 мл бензола и отфильтровывают бензол в ту же круглодонную колбу. Упаривают бензольный раствор на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 — 50 °C досуха. Остаток растворяют в 200 — 300 мкл бензола и очищают с помощью препаративной ТСХ (раствор A).

2.2. Очистка с помощью препаративной ТСХ

Пластинку «Силуфол» (20 x 20 см) размечают. В правом и левом нижних углах пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят по 5 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле (по 500 нг Т-2 токсина). Параллельно нижнему краю пластинки на расстоянии 1,5 см от нижнего края равномерно наносят с помощью шприца на 10 мкл раствор A в виде прямой линии шириной не более 3 мм. После нанесения всего раствора A в круглодонную колбу добавляют еще 100 — 150 мкл бензола и наносят бензольную промывку на ту же прямую линию. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан — изопропиловый спирт (7:2). Развивают пластинку до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 1,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры и высушивают. Разрезают пластинку по линиям А и Б. Узкие полоски пластинки с нанесенным раствором Т-2 токсина опрыскивают 20% раствором серной кислоты в метаноле. Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 105 °C в течение 1 — 3 минут и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Пятна Т-2 токсина (бело-голубая флуоресценция, Rf 0,6 — 0,7) обводят тонкой карандашной линией. Затем узкие полоски прикладывают к пластинке с нанесенным экстрактом и отмечают на этой пластинке зону, соответствующую хроматографической подвижности стандарта Т-2 токсина. Ширина зоны должна быть примерно на 7 мм (с каждой стороны) больше протяженности пятна стандарта Т-2 токсина в направлении развития хроматограммы; зону отмечают в виде 2 карандашных линий, параллельных нижнему краю пластинки. Силикагель из отмеченной зоны соскабливают с помощью скальпеля или шпателя в пробирку на 5 мл, приливают 4 мл смеси бензол — ацетон (1:1) и встряхивают. Суспензию силикагеля фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу на 50 мл с НШ 14,5. Силикагель повторно (2 x 4 мл) промывают смесью бензол — ацетон (1:1). Объединенные бензол — ацетоновые экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток переносят 200 мкл бензола в пробирку на 5 мл с НШ 14,5 (раствор B).

3. Обнаружение, идентификация и определение содержания Т-2 токсина

3.1. Приготовление стандартного раствора Т-2 токсина

Навеску 10 мг кристаллического Т-2 токсина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки бензолом. Концентрация Т-2 токсина в стандартном растворе составляет 100 нг/мкл или 100 мкг/мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше +5 °C. Срок годности стандартного раствора — до 2 лет.

3.2. Получение ТФА производных

а) Получение ТФА производного стандарта Т-2 токсина

В мерную пробирку на 5 мл в НШ 14,5 добавляют 50 мкл стандартного раствора Т-2 токсина в бензоле, добавляют 250 мкл бензола, 30 — 50 мг свежепрокаленного углекислого натрия и 50 мкл трифторуксусного ангидрида. Пробирку плотно закрывают стеклянной притертой пробкой и перемешивают при 20 — 25 °C в течение 0,5 часа на магнитной мешалке (в пробирку предварительно помещают «гвоздик» для перемешивания — кусочек металлической канцелярской скрепки длиной 3 — 4 мм, запаянный в стеклянный капилляр). Содержимое пробирки разбавляют бензолом до 1 мл и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую пробирку на 5 мл с НШ 14,5, углекислый натрий на фильтре промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают досуха в слабой струе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 200 мкл бензола и анализируют с помощью ГЖХ.

б) Получение ТФА производных экстракта

К 300 мкл бензольного раствора очищенного экстракта (раствор B) добавляют углекислый натрий и трифторуксусный ангидрид и проводят получение ТФА производных аналогично п. 3.2.а.

3.3. ГЖХ анализ ТФА производных

Условия ГЖХ анализа: температура колонки — 200°, температура испарителя

• 235°, температура термостата детектора — 270°, скорость газа-носителя — 90 — 100 мл/мин., скорость продувочного газа — 190 — 200 мл/мин., шкала -12

чувствительности - 2 x 10    А (на блок ИМТ).
    В  газовый  хроматограф  с помощью микрошприца на 1 мкл последовательно
вносят  0,2  и  0,5  мкл  (соответствуют  5 и 12,5 нг Т-2 токсина) раствора

ТФА — производного стандарта Т-2 токсина в 200 мкл бензола (п. 3.2.а). В каждом случае регистрируют время удерживания (в данных условиях порядка 5 — 6 минут) и определяют площадь пика ТФА производного Т-2 токсина (S ). ст

Площадь  пика  определяют умножением высоты пика на ширину пика на половине
его  высоты.  Затем в газовый хроматограф вносят 0,5 - 1,0 мкл раствора ТФА

производного экстракта (п. 3.2.б). При наличии пика, соответствующего по

времени  удерживания  ТФА  производному  Т-2  токсина,  определяют  площадь
(S   ).

обр

Содержание Т-2 токсина в исходном образце определяют по формуле:

                       V  x V  x S    x m
                        1    3    обр    ст

C = --------------------, (мкг/кг),

                        V  x V  x S   x M
                         2    4    ст

где:

S — площадь пика ТФА производного Т-2 токсина в экстракте, в кв. мм; обр

S — площадь пика ТФА производного стандарта Т-2 токсина, в кв. мм; ст

m — масса стандарта Т-2 токсина, внесенная в хроматограф, в нг ст (5 или 12,5 нг);

M — масса исходного образца, в г (20 г);

V — объем экстрагирующего растворителя, в мл (100 мл); 1

V — объем фильтрата, взятый для анализа, в мл (70 мл); 2

V — объем бензольного раствора ТФА производного экстракта, в мкл 3 (200 мкл);

V — объем бензольного раствора ТФА производного экстракта, внесенный в 4 хроматограф, в мкл.

---