Оценка токсичности товаров бытовой химии. Экспресс-метод оценки токсичности моющих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота. Методические рекомендации
(утв. Минздравом России 27.12.2001 № 29ФЦ/4746)
27 декабря 2001 г. № 29ФЦ/4746
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ТОВАРОВ БЫТОВОЙ ХИМИИ. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ МОЮЩИХ СРЕДСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪЕКТА СПЕРМЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Разработаны Федеральным центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Российской Федерации, НИИ Медицины труда РАМН, ОАО «Научно-исследовательский центр бытовой химии», Центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора в городе Москве, Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники Министерства здравоохранения Российской Федерации, Акционерным обществом «БМК-Инвест».
1. Область применения
Методические рекомендации содержат описание метода оценки токсичности моющих средств с применением кратковременной суспензионной культуры подвижных клеток (сперматозоидов быка) и определяют порядок проведения испытаний следующих видов товаров бытовой химии (ТБХ): синтетические моющие средства и средства, используемые для обработки посуды и другого инвентаря и оборудования, имеющего контакт с пищевыми продуктами.
Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки токсичности серийно выпускаемых моющих средств.
Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.
Методические рекомендации предназначены для учреждений и организаций, занимающихся токсикологической оценкой ТБХ и осуществлением санитарного надзора за их производством и применением.
2. Сущность метода
Сущность методики состоит в исследовании острой токсичности вытяжки из испытываемых ТБХ с применением клеточного тест-объекта. В качестве тест-объекта используется сперма крупного рогатого скота, замороженная в парах жидкого азота. Гранулы замороженной бычьей спермы получают на станциях искусственного осеменения и хранят в сосудах Дьюара, наполненных жидким азотом. В основе метода лежит исследование изменения зависимости двигательной активности сперматозоидов от времени под воздействием химических соединений, содержащихся в вытяжке из исследуемых образцов. Показатель подвижности m = f(t) определен как:
m — показатель подвижности клеток;
Cn — концентрация подвижных клеток;
V — средний модуль скорости клеток.
Оценка показателя подвижности осуществляется путем подсчета подвижных сперматозоидов автоматически через определенные промежутки времени. Вычисляется суммарная двигательная активность S в каждом капилляре.
3. Оборудование, химическая посуда и реактивы
3.1. Стенд для испытаний моющих средств на токсичность — анализатор токсичности, комплект кювет.
3.2 Химическое оборудование:
- пробирки с притертыми пробками объемом 3 — 5 мл — 10 шт.;
- дозаторы пипеточные на объемы 0,5 мл, 0,2 мл и 0,1 мл;
- мерные колбы с притертыми пробками объемом 250 мл — 2 шт.
3.3 Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг.
3.4 Пинцет анатомический длиной 250 мм.
3.5. Сосуд Дьюара типа СДС объемом не менее 25 л и диаметром горла не менее 50 мм — 2 шт.
3.6 Глюкоза, ч., ГОСТ 6038.
3.7 Цитрат натрия трехзамещенный, ч., ГОСТ 22280.
3.8 Сперма быка, замороженная в жидком азоте, ГОСТ 26030.
3.9. Фильтры бумажные обеззоленные «красная», «синяя лента». ТУ-6-09-1678-86.
4. Приготовление рабочих растворов
4.1. Испытуемый образец в количестве 0,1 г помещается в мерную колбу объемом 250 мл и доводится до метки дистиллированной водой, что соответствует разведению испытуемого образца 1:2500. Это разведение является стандартным для исследования моющих средств. Колба закрывается притертой пробкой. В другую колбу в качестве контроля помещается 250 мл дистиллированной воды и закрывается притертой пробкой. Обе колбы (контроль и опыт) ставят в термостат на сутки при температуре 37 °C, затем охлаждают на лабораторном столе до комнатной температуры.
4.2. Фильтрование. После охлаждения опытный раствор подвергают фильтрованию через бумажный фильтр с целью удаления взвешенных частиц. Фильтрованию подвергают также и контрольную воду.
4.3. Подготовка фильтров. В качестве фильтра используются бумажные фильтры («красная» или «синяя лента») диаметром 90 мм. Бумажные фильтры должны быть заранее промыты и просушены. Для этого предварительно до начала эксперимента 10 бумажных фильтров опускают в большой стакан, заполненный 1 л дистиллированной воды. Стакан накрывают стеклянной пластинкой и ставят в термостат на 24 часа при температуре 37 °C. Затем дистиллированную воду выливают, а стакан с мокрыми фильтрами ставят обратно в термостат с целью высушивания фильтров до постоянной массы. Достижение постоянной массы контролируют взвешиванием каждого фильтра на аналитических весах.
4.4. Приготовление изотонических растворов. Полученные фильтраты (опыт и контроль) доводят до изотонии, добавляя в них сухие реактивы цитрата натрия и глюкозы. На 10 мл фильтрата добавляется 0,1 г цитрата натрия и 0,4 г глюкозы.
5. Проведение испытаний
5.1. Определение суммарной двигательной активности S сперматозоидов проводится в изотонических фильтратах рабочих растворов при постоянной температуре 40 °C. Поддержание температуры осуществляется автоматическим устройством термостатирования.
5.2. Контрольный и опытный изотонические растворы готовят не менее чем за час до начала эксперимента, а затем по 0,4 мл разливают в пробирки с притертыми пробками и ставят в термостат при температуре 40 °C.
5.3. Оттаивают замороженную сперму в разбавителе. Состав разбавителя: глюкоза — 4 г, цитрат натрия — 1 г, дистиллированная вода — 100 мл. В чистую сухую пробирку наливают разбавитель, согласно паспорту на сперму быка, и ставят в термостат при температуре 40 °C. Анатомическим пинцетом, охлажденным до температуры жидкого азота, извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и опускают в нагретый разбавитель.
Примечание. Подготовка разбавителя. При использовании непаспортизованной партии гранул замороженной спермы нужно предварительно за несколько дней до испытаний выбрать оптимальный объем разбавителя для приготовления раствора спермы. Для этого в пробирки разлить разный объем разбавителя ~ 0,4 — 0,8 мл. Поместить в термостат при температуре 40 °C, дать нагреться и в каждую пробирку поместить по одной грануле замороженной спермы. Сразу после размораживания гранул из каждой пробирки берут по 0,1 мл маточного раствора спермы и переносят в пробирки с изотоническим раствором, объем изотонического раствора в каждой пробирке — 0,4 мл. Заполняют капилляры. Проводят эксперимент. Получают зависимость: концентрация сперматозоидов — время подвижности и выбирают оптимальный объем разбавителя, при котором время подвижности сперматозоидов составляет ~ 2,5 — 3 ч.
5.4. В каждую пробирку и с контрольной средой, и с опытным раствором (экстрактом) моющих средств приливают по 0,1 мл раствора спермы и тщательно перемешивают. Каждый раствор переносят в капилляры (4 — 5 на один образец) и устанавливают в каретку прибора. Проводят измерения согласно инструкции.
5.5. Математическая обработка результатов измерений. Вычисляется суммарная двигательная активность S в каждом капилляре.
S = SUM m , j i
m — значение показателя подвижности в j-том капилляре; i
j — порядковый номер капилляра.
Для контрольной и опытной выборок капилляров вычисляют среднее арифметическое значение показателя подвижности и его среднеквадратическое отклонение, затем для каждой выборки вычисляют коэффициент вариации C:
X — среднее арифметическое значение.
В случае получения значения коэффициента вариации более 25% хотя бы для одной из выборок эксперимент повторяют, начиная с п. 5.1. Если значения коэффициента вариации для каждой из выборок меньше или равно 25%, то результаты считаются пригодными для статистической обработки. Вычисляют величину индекса токсичности Is:
о к Is = (S / S ) x 100%, ср ср о к где S и S - средние арифметические значения величины суммарной ср ср
двигательной активности сперматозоидов опытной и контрольной выборок.
6. Оценка результатов испытаний
Оценка результатов испытаний осуществляется путем сравнения полученного значения индекса токсичности для исследованного образца и допустимого интервала индекса токсичности. Индекс токсичности в интервале от 70 — 120% свидетельствует о том, что моющее средство не оказывает общетоксического и/или кожно-раздражающего действия при соблюдении условий применения согласно инструкции.
Во всех остальных случаях результаты указывают на несоответствие гигиеническим требованиям к моющим средствам.