Методические указания по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей

(утв. Минздравом СССР 21.01.1980 № 28-1/6)

Утверждаю Начальник Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР В. П. Сергиев 21 января 1980 г. № 28-1/6

Согласовано Начальник Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР А. Д. Третьяков 9 января 1980 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ

БРУЦЕЛЛЕЗ — зоонозная инфекция, при которой основными источниками инфекции для людей являются больные бруцеллезом сельскохозяйственные животные.

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВОЗБУДИТЕЛЕ БРУЦЕЛЛЕЗА

Бруцеллы относятся к классу Schizomycetes, порядку Eubacteriales, семейству Brucellaceae, роду Brucella.

По международной классификации род Brucella состоит из шести самостоятельных видов: melitensis (козье-овечий), abortus (коровий), suis (свиной), neotomae (кустарниковых крыс), ovis (баранов), canis (собачий). Виды подразделяются на биотипы.

Бруцеллы представляют собой очень мелкие микроорганизмы шаровидной, овоидной или палочковидной формы. Размер бруцелл кокковых форм — 0,3 — 0,6 мкм, палочковидных — 0,6 — 1,5 мкм. Бруцеллы жгутиков не имеют. Способностью к спорообразованию не обладают. При определенных условиях (воздействие специфическим бактериофагом, выращивание на средах с добавлением 10% иммунной сыворотки и т.п.) образуют капсулу; грамотрицательны; характеризуются замедленным ростом на питательных средах; некоторые штаммы требуют для роста добавления 5 — 10% CO2, особенно при первоначальном выделении. Оптимальная температура для роста бруцелл 37 °C, оптимальный pH — 6,8 — 7,2.

Бруцеллы, как и другие бактерии, могут находиться в нормальном состоянии (S-формы), так и в той или иной степени изменения, в состоянии диссоциации. Значительным фактором, способствующим изменчивости бруцелл, являются антибиотики. Обладая мутагенным действием, антибиотики приводят к образованию L-форм бруцелл. Бруцеллы обладают определенной степенью биохимической активности. Они выделяют каталазу, уреазу, гиалуронидазу, пероксидазу, амилазу, липазу, фосфатазу, цитохромоксидазу, d- и l-аспарагиназу и некоторые другие ферменты аминокислотного и углеводного обмена.

Бруцеллы относятся к патогенным микроорганизмам. Разные виды бруцелл обладают разной вирулентностью. Наиболее вирулентна для человека Br. melitensis, которая нередко вызывает эпидемические вспышки заболеваний, протекающих, в основном, в тяжелой форме. Br. abortus и Br. suis вызывают, как правило, спорадические случаи клинически выраженных заболеваний. Что касается Br. ovis, Br. neotomae и Br. canis, то известны только единичные случаи заболевания, вызванные Br. canis.

Бруцеллы обладают высокой инвазивностью и могут проникать через неповрежденные слизистые покровы. Относятся к внутриклеточным паразитам, живут и размножаются внутри клеток ретикулоэндотелиальной системы, но могут также находиться и внеклеточно. Обладают выраженными антигенными свойствами. У бруцелл всех видов обнаружены явления бактериофагии. Широко распространен фаг в культурах бруцелл, в организме больных людей и животных, некоторых объектах внешней среды. Наибольшей стойкостью и активностью обладает фаг «Тб» (Тбилиси, раса 3), отличающийся избирательной чувствительностью к бруцеллезам вида abortus. Этот фаг является референтным.

Бруцеллы малоустойчивы к высокой температуре. В жидких культурах при +60 °C они погибают через 30 минут, при +80 °C — +85 °C — через 5 минут, при кипячении — моментально. Обладают большой устойчивостью к воздействию низких температур. На бруцеллы губительно действует прямой солнечный свет, но даже при интенсивной инсоляции повышенная влажность благоприятствует сохранению возбудителя в почве, на воде и др. и удлиняет срок его жизнеспособности. Возбудитель бруцеллеза в чистой культуре весьма чувствителен к различным дезинфицирующим веществам: 2% р-р карболовой кислоты, 3% р-р креолина и лизола, 0,2% — 1% р-р хлорной извести, 0,01%, р-р хлорамина, 0,1% р-р сулемы убивают их в течение нескольких минут.

II. ЭПИЗООТОЛОГИЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

Бруцеллезом болеют в основном сельскохозяйственные животные — овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, верблюды, северные олени. Причем, каждый вид животных обычно поражается определенным видом возбудителя. Однако бруцеллы вида melitensis и abortus могут мигрировать и на других животных. Эта особенность бруцелл имеет большое эпидемиологическое значение в случаях миграции наиболее опасного для человека вида melitensis на крупный рогатый скот.

Микроб проникает в организм животного через слизистые оболочки пищеварительного тракта, половых и дыхательных путей, конъюнктиву, а также через кожные покровы в случае нарушения их целостности.

Клиническое течение бруцеллеза у животных характеризуется полиморфизмом, основным признаком является аборт. Аборты имеют решающее значение в эпизоотологии и эпидемиологии бруцеллеза, т.к. сопровождаются массивным и длительным выделением бруцелл с абортированным плодом, плацентой, выделениями из матки и влагалища, при метритах и других поражениях половых и родовых органов. Больные животные могут выделять бруцеллы с молоком и мочой. Таким образом, выделение большого количества бруцелл при абортах и родах больных животных, а также с молоком, является основным фактором распространения инфекции в хозяйстве, а нередко и заражения людей.

Помимо абортов бруцеллез у животных может сопровождаться поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой сферы (эндометриты, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит), молочных желез (мастит).

Бруцеллез у животных может протекать в скрытой форме и обнаруживаться лишь при специальном исследовании. Распространять возбудителя инфекции могут и животные, не имеющие клинических проявлений бруцеллеза, но положительно реагирующие при обследовании на бруцеллез.

Отдельные животные остаются носителями бруцелл и выделяют их в течение 5 лет и более.

III. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ БРУЦЕЛЛЕЗА

Основными источниками инфекции для людей при бруцеллезе являются овцы, козы, крупный рогатый скот и свиньи. Отмечаются случаи заражения людей бруцеллезом от северных оленей. В редких случаях источниками заражения могут быть лошади, верблюды, яки и некоторые дикие животные.

Роль человека в передаче бруцеллезной инфекции эпидемиологического значения не имеет.

Пути заражения человека бруцеллезом разнообразны. Заражение происходит преимущественно контактным (с животным, сырьем и т.п.) или алиментарным путем. Преобладание того или иного пути определяется степенью контакта с больными животными, сырьем животного происхождения, обсемененным бруцеллами, и употреблением необеззараженных молока и других пищевых продуктов животного происхождения.

Возможны случаи заражения людей при работе с вирулентными культурами бруцелл. Здесь имеют место как контактный, так и аэрогенный пути заражения.

В животноводческих хозяйствах и на предприятиях, перерабатывающих сырье и продукты животного происхождения, ведущее место занимает контактный путь заражения — в результате контакта с животными в процессе ухода, осмотра, доения, стрижки и т.д., соприкосновения с патологическими выделениями, плодом, его оболочками, мочой, испражнениями и пр., в процессе убоя, разделки туши, контакта с шерстью и другими продуктами и сырьем.

В бытовых условиях отмечается алиментарный путь заражения в результате употребления сырого молока и молочных продуктов (невыдержанных сыров — брынзы и т.д.), плохо проваренного мяса и мясных продуктов, полученных от больных животных. В процессе ухода за животными индивидуальных хозяйств имеет место и контактный путь заражения.

Эпидемиологическое значение пищевых продуктов и сырья животного происхождения определяется массивностью обсеменения, видом бруцелл, их вирулентностью, длительностью их сохранения. Так, в молоке бруцеллы сохраняются до 10 и более дней, брынзе — до 45 дней, во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш — более 1 месяца, в шерсти — до 3 месяцев.

Наиболее опасны молоко и молочные продукты из молока от больных овец и коз.

Источники, пути и факторы передачи бруцеллеза определяют профессиональный характер заболевания бруцеллезом для соответствующих контингентов населения. Это животноводы, лица, временно привлекаемые к уходу за животными, рабочие предприятий, перерабатывающих продукты и сырье животноводства. Наибольшей опасности заражения подвергаются лица, обслуживающие мелкий рогатый скот.

Различие в заболеваемости по полу зависит от занятости мужчин и женщин в животноводстве.

Болеют бруцеллезом лица в любом возрасте.

Сезонность в заболеваемости людей бруцеллезом главным образом выражена при заражении от больных бруцеллезом овец и определяется массовым участием животноводов и лиц, временно привлекаемых к уходу за животными в период окота, когда происходит выделение из организма больного животного во внешнюю среду больших доз возбудителя. В связи с этим для заболеваемости людей козье-овечьим бруцеллезом характерна весенне-летняя сезонность.

Сезонность при заражении бруцеллезом от крупного рогатого скота выражена слабее, что объясняется длительным периодом лактации и заражением в основном через молоко и молочные продукты.

IV. МЕРОПРИЯТИЯ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА СРЕДИ ЛЮДЕЙ

Мероприятия по предупреждению заболеваний бруцеллезом людей следует проводить согласно конкретным комплексным планам работы по борьбе и профилактике бруцеллеза в союзной (автономной) республике, области (крае), районе и в каждом отдельном хозяйстве, предприятии. Планы составляются с участием всех заинтересованных министерств, ведомств, организаций и утверждаются в установленном порядке. Для координации действий медицинской и ветеринарной служб в целях снижения заболеваемости бруцеллезом людей и животных необходимо в полной мере использовать междуведомственные комиссии (республиканские, областные, краевые, районные).

При проведении медико-санитарных мероприятий по профилактике бруцеллеза необходимо исходить из следующих положений:

• основными источниками заражения людей бруцеллезом являются больные сельскохозяйственные животные — мелкий рогатый скот, крупный рогатый скот, свиньи и др.;
• бруцеллы могут длительное время сохраняться в продуктах и сырье животного происхождения, на объектах внешней среды, однако малоустойчивы к воздействиям дезинфицирующих средств и высоких температур;
• заболевания людей возникают при нарушении противобруцеллезного режима <*> в животноводческих и индивидуальных хозяйствах, несоблюдении мер личной профилактики на предприятиях и т.п., а также при нарушениях в работе с вирулентными культурами бруцелл в лабораториях.

---

<*> Противобруцеллезный режим — это режим, при котором обеспечивается проведение всех мероприятий по недопущению заражения людей бруцеллезом от больных животных, инфицированного сырья и продуктов животноводства: сюда входят как общие мероприятия по коллективной защите людей, так и индивидуальные меры защиты.

Медико-санитарные мероприятия по профилактике бруцеллеза включают:

1. Защиту людей от инфицирования.

2. Вакцинопрофилактику лиц, профессионально подвергающихся угрозе заражения бруцеллезом козье-овечьего вида.

3. Профилактические осмотры профессиональных контингентов с целью выявления заболевших бруцеллезом.

Контроль в порядке государственного санитарного надзора за организацией и проведением противобруцеллезных мероприятий и соблюдением противобруцеллезного режима в животноводческих и индивидуальных хозяйствах, на предприятиях, перерабатывающих продукты и сырье животного происхождения, в лабораториях, работающих с вирулентными культурами, осуществляют санитарно-эпидемиологические станции.

Одним из основных методов осуществления надзора является проведение плановых обследований объектов.

Плановые обследования по соблюдению противобруцеллезного режима в животноводческих хозяйствах, на отгонных пастбищах, убойных пунктах, пунктах стрижки овец, мясокомбинатах, молококомбинатах и других предприятиях, где возможен контакт людей с больными бруцеллезом животными и инфицированными продуктами и сырьем целесообразно проводить эпидемиологам совместно с санитарными врачами, курирующими данные объекты, и с представителями ветеринарной службы, районных (местных) комитетов профсоюзов. Частота плановых обследований зависит от эпизоотической ситуации в населенных пунктах, хозяйствах, но не реже двух раз в год с обязательной проверкой выполнения предложений, независимо от обследований по эпидпоказаниям.

Результаты обследования следует доводить до сведения администрации хозяйств, колхозов, совхозов, предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства, районных (местных) комитетов профсоюзов работников сельского хозяйства, мясомолочной промышленности и др.

Большое значение в обеспечении противобруцеллезного режима имеет осуществление предупредительного санитарного надзора за проектированием, строительством, реконструкцией и капитальным ремонтом животноводческих объектов и предприятий по переработке сырья и продуктов животного происхождения. При этом необходимо строго контролировать соответствие строящегося или реконструируемого объекта с проектом. Особое внимание уделять созданию условий труда животноводов и рабочих перерабатывающих предприятий: строительству и оборудованию бытовых помещений, душевых, туалетных комнат, обеспечению их горячим водоснабжением, созданию условий для соблюдения личной гигиены. Предупредительный надзор осуществляется также при отводе земельного участка под строительство животноводческих ферм, убойных пунктов, пунктов заготовок и др., при определении трасс перегона скота.

Защита людей от инфицирования

Защита людей от инфицирования осуществляется как проведением широких общесанитарных мер, так и использованием средств индивидуальной защиты и включает в себя:

• обеспечение должного санитарно-гигиенического состояния хозяйств и предприятий, соблюдение дезинфекционного режима;
• соблюдение правил убоя животных из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу, с последующей дезинфекцией оборудования, помещений и обеззараживания отходов, дезинфекцией транспорта, которым перевозились больные животные;
• соблюдение установленных правил обработки и использования продуктов убоя и молока от животных из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу;
• соблюдение правил работы с животными в животноводческих хозяйствах; обеспечение персонала, в том числе лиц временно привлекаемых к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, и правильное использование ими средств личной гигиены и индивидуальной защиты (халаты, резиновые перчатки, нарукавники, клеенчатые фартуки, специальная обувь и т.п.);
• наличие и правильная эксплуатация бытовых помещений, комнат для отдыха, мест приема пищи, душевых и пр.;
• обеспечение горячей водой, моющими средствами, дезинфицирующими средствами;
• организация в хозяйствах и на предприятиях централизованной дезинфекции, стирки и чистки спецодежды по мере ее загрязнения, немедленной замены пришедшей в негодность;
• обязательный инструктаж работников животноводства (включая временно привлекаемых) и предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства по правилам гигиены, использованию средств индивидуальной защиты, соблюдению противобруцеллезного режима; аналогичный инструктаж должны проходить (в виде бесед) индивидуальные владельцы сельскохозяйственных животных;
• допуск к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, только после прохождения инструктажа и проведения в установленном порядке профилактических противобруцеллезных прививок.

При организации и проведении медико-санитарных мер по защите людей от инфицирования, органам и учреждениям здравоохранения необходимо руководствоваться директивными документами, приказами и распоряжениями вышестоящих органов здравоохранения, действующими инструктивно-методическими материалами, включая утвержденные Минздравом СССР (или согласованные) совместно с другими министерствами и ведомствами.

Проведение ветеринарных мероприятий и контроль за организацией и проведением руководителями и специалистами хозяйств и перерабатывающих предприятий мероприятий, направленных на профилактику и ликвидацию бруцеллеза животных, осуществляют органы и учреждения государственной ветеринарной сети в соответствии с Ветеринарным уставом Союза ССР, утвержденным постановлением Совета Министров СССР от 22 декабря 1967 г. № 1142, и инструктивными документами, издаваемыми Министерством сельского хозяйства СССР по данным вопросам.

Профилактическая вакцинация людей против бруцеллеза

Показанием к вакцинации людей является угроза заражения возбудителем козье-овечьего вида в процессе трудовой деятельности.

При проведении прививок остается обязательным организация и проведение всех мероприятий по охране труда работающих от заражения бруцеллезом (обеспечение санитарной и специальной одеждой и обувью, создание условий для соблюдения личной гигиены, наличие дезинфицирующих моющих средств и пр.).

Прививки проводятся в хозяйствах (фермах), неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу, на предприятиях, куда поступает мелкий рогатый скот, сырье и продукты от него из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу козье-овечьего вида.

В районах и хозяйствах, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу, иммунизация персонала хозяйств, содержащих другие виды животных (крупный рогатый скот и др.), проводится только при бактериологическом подтверждении факта миграции Br. melitensis на эти виды животных.

В районах, свободных от бруцеллеза козье-овечьего вида, иммунизация персонала хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота и других видов животных, не проводится. Это касается и персонала перерабатывающих предприятий, где перерабатывается сырье и продукты животного происхождения из районов, неблагополучных по бруцеллезу других видов животных.

Прививки постоянным и временным работникам животноводства проводятся до полной ликвидации в хозяйствах бруцеллеза козье-овечьего вида. Прививки постоянному и временному персоналу предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства проводятся до полной ликвидации козье-овечьего бруцеллеза в хозяйствах, откуда поступает скот, сырье и продукты животноводства.

Для иммунизации людей против бруцеллеза используется сухая живая вакцина, приготовленная из вакцинного штамма коровьего вида (abortus 19-BA).

Вакцина выпускается в стеклянных запаянных ампулах, к которым прилагается наставление по ее применению. Срок годности вакцины равен 12 месяцам со дня контроля (вакцина переконтролю не подлежит). Сохранение исходных свойств вакцины ко времени проведения прививок зависит от условий ее хранения и транспортировки. Вакцина должна храниться в темном помещении при температуре не выше +10 °C (возможно также хранение при температуре ниже 0 °C при отсутствии резких колебаний температуры). Хранение и транспортировка вакцины при температуре выше +10 °C недопустимы, так как это снижает ее иммунологическую эффективность. В те лечебно-профилактические и санитарно-эпидемиологические учреждения, где отсутствуют условия для хранения вакцины, вакцина должна выдаваться непосредственно перед проведением прививок. Забракованную или неиспользованную по истечении срока годности вакцину уничтожают кипячением или дезинфицирующими средствами (лизол 3%, карболовая кислота 5%, хлорамин 2%).

Эпидемиологическая эффективность прививок зависит от правильного определения показаний к их проведению, полноты отбора подлежащих иммунизации профессиональных групп, в том числе временного персонала, соблюдения сроков вакцинации и ревакцинации, методики проведения прививок, иммунологических свойств вакцины и соблюдения необходимых условий хранения ее.

Для правильного составления плана прививок территориальная санитарно-эпидемиологическая станция выявляет объекты, где возможно инфицирование людей козье-овечьим бруцеллезом (на основе эпидемиологических данных и сведений от ветеринарных органов о зараженности животных бруцеллезом) — животноводческие хозяйства, предприятия по переработке сырья и продуктов животноводства, их производственные особенности, число постоянных работников, а также примерное количество лиц, временно привлекаемых на сезонные работы. Перечень объектов направляют руководителям лечебно-профилактических учреждений по принадлежности.

Руководители лечпрофучреждений (поликлиник, медсанчастей, врачебных амбулаторий, предприятий, участковых больниц, сельских врачебных амбулаторий) составляют планы профилактических прививок по своим объектам, исключая лиц с постоянными противопоказаниями, и направляют их в территориальные санэпидстанции, которые обобщают эти планы, с учетом необходимого числа временных работников.

Планы прививок согласуются с ведомственными организациями, в подчинении которых находятся животноводческие хозяйства и предприятия, и утверждаются областными (краевыми) отделами здравоохранения, министерствами здравоохранения автономных и союзных республик.

Потребность в вакцине исчисляется из расчета 2 дозы на одну прививку. Для проведения прививок среди небольших разобщенных групп животноводов при отгонном ведении животноводства общее количество вакцины планируется из расчета 3 — 4 дозы на одну прививку.

Руководство и контроль за проведением прививок возлагаются на санитарно-эпидемиологические станции. Они контролируют правильность определения контингентов, подлежащих прививкам, соблюдением сроков иммунизации, режим хранения вакцины и технику проведения прививок.

Прививки проводит медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений. В случае необходимости (прививки в отдаленных или высокогорных отгонных пастбищах) областные (краевые) отделы здравоохранения выделяют специальные бригады медицинских работников, возглавляемые врачами, или усиливают участки с большим контингентом прививаемых дополнительно врачебным и средним медицинским персоналом.

Медицинские работники, назначенные для проведения прививок, должны быть проинструктированы о порядке предварительного индивидуального отбора лиц, подлежащих прививкам, правилах хранения и разведения вакцины, технике вакцинации, о порядке регистрации прививаемых в журнале учета прививок. О проведенном инструктаже выдается справка.

Плановым прививкам (вакцинация, ревакцинация) подлежат контингенты, которые по роду своей деятельности подвергаются риску заражения бруцеллезом козье-овечьего вида, в том числе:

• постоянные работники животноводческих хозяйств (ферм), неблагополучных по бруцеллезу овец или коз, а также лица, занятые по приему, перевозке и перегону мелкого рогатого скота, неблагополучного по бруцеллезу;
• работники, обслуживающие крупный рогатый скот в хозяйствах (фермах), где бактериологически установлена миграция возбудителя козье-овечьего бруцеллеза;
• работники мясокомбинатов, убойных пунктов и других предприятий по обработке сырья и продуктов животноводства, в которые поступают сельскохозяйственные животные или сырье животного происхождения из хозяйств, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу;
• работники сыроваренных заводов, где приготовляется брынза и другие сыры из свежего молока, поступающего из хозяйств, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу;
• временные работники (старше 18 лет) животноводческих хозяйств (ферм), неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу, привлекаемые к сезонным работам (окот, купка, стрижка овец и др.); временные работники (старше 18 лет) предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства, привлекаемые на период массового убоя скота или переработки сырья животного происхождения, поступающих из хозяйств, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу;
• студенты (старше 18 лет) учебных заведений министерств сельского хозяйства и мясомолочной промышленности, направляемые на практику или в помощь в животноводческие хозяйства, неблагополучные по козье-овечьему бруцеллезу, и на предприятия по переработке сырья и продуктов животноводства, поступающих из хозяйств, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу;
• медицинский, ветеринарный и другой персонал, работающий с живыми культурами бруцелл или зараженным материалом, с больными бруцеллезом животными.

Сроки плановых прививок определяются наиболее опасным периодом для заражения и зависят от времени, необходимого для формирования иммунитета (к концу месяца со дня прививки). Иммунитет сохраняет наивысшую напряженность в течение 5 — 6 месяцев.

В связи с этим при определении сроков прививок в животноводческих хозяйствах нужно строго руководствоваться данными о времени окота, дифференцируя прививки в зависимости от особенностей ведения каждого хозяйства: ранний окот, плановый, внеплановый, длительность и пр.

Постоянный персонал животноводческих хозяйств (чабаны, ветеринарные работники, зоотехники, стригали и др.), а также работники, привлекаемые на временную работу в овцеводческие хозяйства на период массовых сезонных работ (окот, стрижка, купка овец и др.), прививаются за 1 — 2 месяца до начала работ.

Постоянные работники мясокомбинатов и убойных пунктов прививаются за 1 — 2 месяца до начала массового убоя животных, поступающих из районов, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу. Рабочие, привлекаемые на временную работу на мясокомбинатах к периоду массового убоя, прививаются не менее чем за 1 месяц до начала работы.

Работники сыроваренных заводов прививаются за 1 — 2 месяца до начала поступления на переработку овечьего молока из хозяйств, неблагополучных по козье-овечьему бруцеллезу.

Внеплановые прививки проводятся по мере поступления на работу в животноводческие хозяйства (фермы), на мясокомбинаты и предприятия, перерабатывающие сырье от сельскохозяйственных животных, при угрозе заражения козье-овечьим бруцеллезом, а также поступающим на работу, связанную с живыми культурами бруцелл или зараженным материалом, с больными животными.

Лица, вновь поступающие на работу, связанную с возможностью заражения, прививаются не менее чем за 1 — 2 месяца до начала работы.

Прививки не проводятся лицам моложе 18 лет <*>, а также имеющим противопоказания по состоянию здоровья: больным с декомпенсированным пороком сердца, острыми и хроническими заболеваниями почек, печени, лимфатических узлов, больным туберкулезом, острыми и хроническими заболеваниями различной этиологии, лицам, находящимся в периоде реконвалесценции после перенесенного инфекционного заболевания, больным с клиническими проявлениями бруцеллеза, лицам с положительными серологическими или аллергическими реакциями на бруцеллез при учете этих реакций на протяжении последних 2-х лет. Прививки не проводятся женщинам в период беременности и грудного вскармливания.

---

<*> Лица в возрасте до 18 лет к работам, связанным с риском заражения бруцеллезом, не допускаются.

Перед прививками проводится медицинское обследование всех лиц, подлежащих вакцинации (ревакцинации) с обязательным серологическим и аллергическим обследованием на бруцеллез. Аллергическое обследование (постановка аллергической пробы Бюрне) проводится с учетом аллергологического анамнеза после взятия крови для серологического исследования. В день постановки пробы Бюрне каждый обследуемый осматривается врачом с обязательной термометрией. Постановка пробы проводится подготовленной медсестрой в присутствии врача. Учет аллергической реакции проводится через 24 и 48 часов. При отрицательном результате реакцию учитывают и через 72 часа.

Вакцинация проводится лицам с отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез.

В день проведения прививок каждый вакцинируемый осматривается врачом с обязательной термометрией. Прививки проводит подготовленная медсестра в присутствии врача.

Ревакцинация проводится через 10 — 12 месяцев после вакцинации лицам с отрицательными серологическими и аллергическими реакциями на бруцеллез.

Местная и общая реакция на введение вакцины незначительны или отсутствуют. Выраженная местная или общая реакции на введение вакцины чаще наблюдаются у лиц, переболевших бруцеллезом.

После вакцинации и ревакцинации появляются положительные серологические и аллергические реакции, которые сохраняются длительное время (особенно аллергическая реакция). При необходимости отдифференцировать реакции в результате прививок от реакций у заболевшего, следует иметь в виду, что серологические реакции после прививок не дают роста в динамике, как это имеет место при заболевании бруцеллезом, как в начале заболевания, так и в период обострения, а также то, что реакции на введение вакцины, как правило, ниже диагностических титров. Отдифференцировать серологические реакции после прививок от реакций у длительно болеющих бруцеллезом в стадии ремиссии в настоящее время не представляется возможным.

Диспансерные профилактические осмотры профессиональных контингентов

С целью своевременного выявления заболевших бруцеллезом людей обязательным диспансерным профилактическим осмотрам при поступлении на работу и не реже одного раза в год подлежат контингенты, подвергающиеся риску заражения бруцеллезом:

• постоянные и временные работники животноводческих, звероводческих хозяйств (ферм), неблагополучных по бруцеллезу любого вида скота, занятые обслуживанием животных, первичной обработкой и транспортировкой сырья и продуктов животноводства из этих хозяйств;
• постоянные и временные работники предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства, поступающих из районов и хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу любого вида;
• медицинский, ветеринарный, зоотехнический и другой персонал, работающий с живыми культурами бруцелл или зараженным материалом, с больными и подозрительными в заражении бруцеллезом животными.

Работники животноводческих хозяйств (ферм), благополучных по бруцеллезу, и предприятий, перерабатывающих сырье и продукты животноводства из районов, благополучных по бруцеллезу, также подлежат профилактическим диспансерным обследованиям один раз в год.

Руководство диспансеризацией угрожаемых контингентов осуществляют краевые, областные и районные отделы здравоохранения (главные врачи районов). Рай(гор) СЭС определяют контингенты, подлежащие периодическим медицинским осмотрам на бруцеллез, составляют перечень объектов с числом работающих в них, оценивают значение неблагоприятных производственных факторов.

Администрация отобранных объектов представляет руководителям лечпрофучреждений по принадлежности медицинского обслуживания утвержденные поименные списки работающих, подлежащих периодическим медицинским осмотрам на бруцеллез.

На основании полученных поименных списков главные врачи лечпрофучреждений составляют календарный план проведения осмотров и утверждают его.

Основным специалистом, проводящим периодические медицинские осмотры, является участковый терапевт (территориальный или цеховой). Одновременно с осмотром терапевтом проводится лабораторное обследование на бруцеллез. Взятие крови для реакций Райта или Хеддльсона осуществляют работники лечпрофучреждений (территориальные или цеховые). Исследование крови осуществляют работники бактериологических лабораторий рай(гор) СЭС и предприятий.

Лица, положительно реагирующие при обследовании на бруцеллез, длительно лихорадящие больные и больные с клиническими проявлениями, характерными для бруцеллезной инфекции (поражение опорно-двигательного аппарата, нервной системы, нарушение слуха, зрения, воспалительные заболевания мочеполовой системы), подлежат углубленному медицинскому осмотру с привлечением специалистов по профилю клинических проявлений (инфекционисты, невропатологи, окулисты, отолярингологи, гинекологи, урологи и др.). Лица с диагностическими титрами серологических реакций подлежат тщательному обследованию в динамике врачом-инфекционистом.

Главные врачи рай(гор) СЭС совместно с главными врачами лечпрофучреждений ежегодно обобщают результаты периодических медицинских осмотров на бруцеллез с указанием следующих данных:

• количество лиц, подлежащих периодическому медицинскому осмотру на бруцеллез;
• количество осмотренных;
• количество выявленных больных бруцеллезом, в том числе взятых на диспансерное наблюдение;
• количество выявленных положительно реагирующих при обследовании на бруцеллез, в том числе с диагностическими титрами серологических реакций;
• число лиц с диагностическими титрами серологических реакций, взятых на диспансерное наблюдение;
• количество лиц, переведенных на другую работу;
• количество лиц, переведенных на инвалидность в связи с перенесенным бруцеллезом;
• количество лиц, подлежащих лечению, в том числе направленных на лечение (стационарное, амбулаторное);
• количество лиц, направленных в санатории, дома отдыха, санатории-профилактории, бальнеолечебницы.

Профилактические медицинские осмотры животноводов следует проводить через 1 — 2 месяца после окончания массового окота и отела сельскохозяйственных животных (обычно II квартал), работников предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства — через 1 — 2 месяца после завершения массового убоя бруцеллезного скота (но окончить проведение осмотра необходимо не позднее III квартала).

Лица, временно привлекаемые к уходу за животными и к переработке сырья и продуктов животноводства, обследуются через 1 — 2 месяца после сезонных работ. Контроль за полнотой охвата этих контингентов осуществляет санитарно-эпидемиологическая служба.

Лица, подлежащие вакцинации, дополнительно подвергаются врачебному осмотру при проведении прививок.

Во время проведения периодических медицинских осмотров и лабораторного обследования широко проводится санитарно-просветительная работа среди обследуемых контингентов.

V. ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ

Организация и проведение эпидемиологического обследования

Эпидемиологическое обследование начинают в ближайшие часы после получения экстренного извещения (учетная форма № 58) из лечебно-профилактического учреждения, а также сведений от ветеринарной службы, от специалистов или руководителей хозяйств, от владельцев сельскохозяйственных животных о случае выявления в хозяйстве больного бруцеллезом животного или об острой вспышке бруцеллеза среди животных.

В случае, если медицинский работник лечебно-профилактического учреждения при выявлении больного бруцеллезом (на амбулаторном приеме или при диспансерных профилактических осмотрах профессиональных групп) установит возможный профессиональный характер заболевания, он обязан независимо от подачи экстренного извещения об инфекционном заболевании (учетная форма № 58) направить в территориальную СЭС «Извещение об остром профессиональном отравлении или профессиональном заболевании» (учетная форма № 163).

Эпидемиологическое обследование случаев заболеваний людей бруцеллезом и выявление источника инфекции необходимо проводить с обязательным участием ветеринарных специалистов учреждений государственной ветеринарии. При этом дается официальное письменное заключение на бланке ветеринарного учреждения о результатах проверки животных на бруцеллез.

Целью эпидобследования случаев заболевания людей бруцеллезом является выявление совместно со специалистами ветеринарной службы источника инфекции, путей заражения, выявление всех лиц, имевших возможность заразиться в тех же условиях, т.е. контактных с источником инфекции, и проведение комплексных мероприятий по предупреждению дальнейшего заражения людей бруцеллезом в данном очаге, а также возможно более раннее установление медицинского наблюдения за лицами, работавшими в очаге бруцеллеза.

Эпидемиологическое обследование случаев обострений бруцеллеза у больных, уже состоящих на учете, целесообразно для выявления возможного повторного инфицирования и проведения соответствующих мероприятий. Проводя эпидемиологическое обследование эпидемиолог должен установить контакт больного с животным:

а) в результате профессиональной деятельности (работники животноводства, предприятий по переработке животного сырья, ветеринарные работники и т.д.);

б) при участии в сезонных работах с животными (окотная кампания, массовый убой животных и т.д.);

в) при наличии животных в личном пользовании;

г) случайный контакт с животными, с сырьем и продуктами животного происхождения (в командировке, в отпуске и т.д.).

В случае отсутствия контакта с животными, собираются сведения об употреблении сырого молока, молочных и других продуктов животноводства (контакт с шерстью, шкурами др.), порядок их приобретения — на колхозных рынках, у частных или случайных лиц и т.д., о работе больного в медицинских, ветеринарных или других лабораториях с зараженным материалом, с живыми культурами бруцелл.

Важные сведения о путях заражения, источнике инфекции может дать опрос самого больного, сотрудников, представителей администрации и т.д.

Для выявления источника инфекции эпидемиолог должен ознакомиться по материалам санитарно-эпидемиологической станции с заболеваемостью бруцеллезом в районе и по месту работы и жительства больного. Решающим в выявлении источника инфекции являются — анализ эпизоотического состояния обследуемого района по бруцеллезу животных по данным ветеринарных органов и результаты эпизоотологического обследования хозяйства и ветеринарного обследования животных, подозреваемых в качестве источника инфекции (проводится ветеринарными работниками).

Для выявления путей заражения важное значение имеет тщательное обследование животноводческих хозяйств (овцетоварных, молокотоварных ферм, отгонных пастбищ, пунктов стрижки овец и др.), индивидуальных хозяйств, предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства (мясокомбинаты, молококомбинаты, убойные пункты, сыроваренные заводы и др.).

Обследование проводит врач-эпидемиолог с привлечением санитарного врача, курирующего обследуемый объект, при участии ветеринарного специалиста; к обследованию должны быть также привлечены представители МК профсоюзов. Обследование целесообразно проводить в присутствии администрации хозяйства или предприятия. При обследовании в первую очередь необходимо обратить внимание на соблюдение противобруцеллезного режима, обследовать условия труда работников, для чего следует:

• ознакомиться с санитарно-гигиеническим состоянием объекта, при этом обратить внимание на благоустройство территории, водоснабжение, наличие горячей воды, дезинфицирующих и моющих средств, наличие и оборудование бытовых помещений для работников, их состояние и содержание, оборудование скотомогильников, ям Беккари или трупосжигательных печей, наличие уборочного инвентаря, в том числе для уборки абортированных и мертворожденных плодов и последов и т.п.;
• выяснить, имеются ли средства индивидуальной защиты персонала, в том числе санитарная и специальная одежда и обувь, рукавицы, резиновые фартуки, перчатки и др., их количество, пригодность для использования, порядок хранения, смены, централизация стирки, чистки; наличие аптечек, умывальников, дезинфицирующих средств, мыла и пр.;
• в целях выявления алиментарных путей заражения проверить соблюдение режима пастеризации молока, условий хранения и обработки молочной посуды и фильтрующего материала; установить порядок реализации молока и молочных продуктов; провести ветеринарное обследование животных, от которых получено молоко, а также других животных хозяйства; по возможности следует лабораторно исследовать подозреваемые молочные продукты;
• выявить порядок первичной обработки и транспортировки сырья и продуктов животноводства из обследуемого хозяйства;
• проверить организацию и проведение профилактических прививок персоналу обследуемого хозяйства или предприятия (время проведения прививок, правильность и полнота отбора контингентов, кем проводятся прививки, условия хранения вакцины и др.).

В случае заболевания бруцеллезом работников ветеринарных, медицинских лабораторий, сотрудников научно-исследовательских учреждений, где ведутся работы с заразным материалом, с живыми культурами бруцелл, серьезное внимание необходимо уделить обследованию лабораторий по соблюдению режима работы с заразным материалом.

При выявлении лиц, имевших возможность заразиться в данном очаге, необходимо организовать и проконтролировать проведение клинико-иммунологического обследования постоянного и временного персонала обследуемой фермы, пастбища, на перерабатывающем предприятии — цеха, участка, пункта убоя скота и др., а также членов семьи заболевшего, если заражение произошло от животных в индивидуальном хозяйстве. В случае если эти лица проживают в другом населенном пункте (в основном это касается временно привлекаемых к уходу за животными), о них необходимо сообщить в СЭС по месту жительства для организации их медицинского обследования.

Выявленные больные подлежат госпитализации и лечению.

Так как одной из основных причин возникновения заболевания бруцеллезом среди постоянных и временных работников животноводства и предприятий по переработке сырья и продуктов животноводства, работников медицинских, ветеринарных или других лабораторий является нарушение администрацией хозяйств, предприятий и лабораторий противобруцеллезного режима и режима работы с зараженным материалом, важное значение приобретает выявление и оформление в установленном порядке профессиональной заболеваемости.

Данные эпидемиологического обследования случая заболевания человека бруцеллезом заносятся в карту эпидемиологического обследования утвержденной Минздравом СССР формы. Если эпидемиологическое обследование проводится в связи с выявлением больного бруцеллезом животного или по сигналу об острой вспышке бруцеллеза среди животных (обследование по эпизоотическим показаниям), результаты проверки противобруцеллезного режима, состояния профилактики заражения бруцеллезом работающих, организация медицинского обследования лиц, контактных с источником инфекции, а также проверка противоэпизоотических мероприятий оформляются актом совместно со специалистами районной (городской) ветеринарной службы (карта эпидемиологического обследования не заполняется). Составляется план-задание по данному хозяйству (предприятию) с обязательной проверкой выполнения в последующем.

В случае выявления грубых нарушений противобруцеллезного режима в животноводческих хозяйствах и на перерабатывающих предприятиях, повлекших за собой случаи заболеваний людей бруцеллезом (в том числе детей и подростков), на виновных оформляются материалы для привлечения их к административной или уголовной ответственности.

VI. САНИТАРНОЕ ПРОСВЕЩЕНИЕ

В системе мероприятий по борьбе с бруцеллезом среди людей большое значение имеет правильно организованная и целенаправленная работа по санитарному просвещению.

Популяризация знаний об источниках инфекции, о возможных путях передачи от больного животного человеку и, главное, о мерах общественной и личной профилактики является необходимым условием активного участия населения в профилактике бруцеллеза в стране.

Основными задачами санитарного просвещения по профилактике бруцеллеза являются следующие:

1. Создать у определенных групп населения четкое представление о том, что бруцеллез — зоонозная инфекция, при которой источником заболевания являются больные сельскохозяйственные животные. Рассказать о распространении болезни среди сельскохозяйственных животных, о путях заражения бруцеллезом и о степени опасности для человека. Обратить особое внимание на профессиональный характер заболевания.

2. Познакомить с основными мерами профилактики бруцеллеза, особо подчеркнув:

• своевременность выявления заболевших животных, необходимость их изоляции и проведения санитарных, специальных ветеринарных, дезинфекционных и других мероприятий;
• значение мероприятий по охране благополучных хозяйств от заноса инфекции;
• необходимость соблюдения мер личной гигиены, с учетом особенностей труда и быта;
• существующее положение о недопущении детей и подростков к уходу за больными животными как в общественных, так и в индивидуальных хозяйствах;
• необходимость термической обработки пищевых продуктов и другого сырья животного происхождения;
• значение прививок против бруцеллеза.

3. Показать успехи советского здравоохранения в борьбе с бруцеллезом, подчеркнуть, что профилактика этого заболевания включает комплекс хозяйственных, санитарных, ветеринарных и медицинских мероприятий.

В зависимости от особенностей групп населения, среди которых проводится санитарное просвещение, а именно их профессии, степени контакта с различными видами животных и получаемым от них сырьем и т.д., следует акцентировать внимание на тех или иных вопросах.

Работникам животноводства следует наиболее широко освещать эпизоотологические сведения, показать наносимый бруцеллезом экономический ущерб, подчеркнуть, что от работников животноводства зависит выявление первых случаев абортов. Насколько срочно и тщательно будут проведены мероприятия, зависит успех оздоровления стада, всего хозяйства. Животноводов следует познакомить с правилами, предусматривающими обязательное обеспечение спецодеждой, а также всем необходимым для выполнения мер личной профилактики.

Для населения местностей, где в индивидуальных хозяйствах разводят коз, овец, важно подчеркнуть значение экстренных санитарных и ветеринарных мер при появлении признаков заболевания животных бруцеллезом, отметить, что нарушение и несоблюдение их приводит к рассеиванию инфекции и заражению как людей, так и общественных животных, обратить внимание на защиту детей и подростков от заболевания бруцеллезом.

Работникам предприятий, перерабатывающих сырье и продукты животного происхождения, наиболее подробно следует осветить меры личной профилактики.

В беседах с населением не следует детально останавливаться на клинике бруцеллеза, достаточно отметить лишь основные симптомы, подчеркнув, что диагностировать это заболевание может только врач на основании клинического и лабораторного обследования. Важно указать, что методы лабораторной диагностики бруцеллеза необходимы для подтверждения диагноза. О самих методах лабораторной диагностики нет надобности говорить подробно, однако целесообразно дать оценку положительным результатам реакций (особенно аллергических) у практически здоровых людей. В таких случаях человек не нуждается в медицинской помощи, так как положительные реакции еще не являются показателями заболевания бруцеллезом.

При освещении вопросов личной профилактики нужно обратить внимание на необходимость тщательного выполнения санитарных правил даже для тех, кто переболел бруцеллезом или вакцинирован, так как организм и в этих случаях не может справиться с заболеванием при проникновении слишком больших количеств бруцелл.

Следует подчеркнуть возможность заражения бруцеллезом детей, если они принимают участие в уходе за больными животными.

Освещая вопрос лечения бруцеллеза, необходимо убедительно показать, что бруцеллез излечим. Здесь целесообразно подчеркнуть важность выполнения всех назначений врача. Особенно это касается антибиотиков, неправильное применение которых может вызвать устойчивость бруцелл к ним. В таких случаях дальнейшее лечение не дает хорошего эффекта.

Пропаганда научных знаний среди населения будет эффективнее, если использовать конкретные случаи из практики, иллюстрирующие те или иные положения эпидемиологии бруцеллеза, привести примеры успешной борьбы с бруцеллезом на территории многих республик, областей, районов нашей страны.

Методы и формы санпросветработы с различными группами населения

• Для групп с профессиональным риском заражения.

1. Вводный санитарный инструктаж:

а) рабочих, поступающих на предприятия, обрабатывающие сырье животного происхождения (мясокомбинаты, молокозаводы, кожевенные предприятия и др.),

б) животноводов молочно-товарных ферм и животноводческих комплексов,

в) работников овце-товарных ферм и отгонного животноводства.

2. Курсовое гигиеническое обучение (1 раз в 2 года по 6-часовой программе) по вопросам профилактики зоонозных инфекций, куда должны входить вопросы профилактики не только бруцеллеза, но и сибирской язвы, лептоспироза, туберкулеза, Ку-лихорадки и др.

Для тех же профессиональных групп.

• Для непрофессиональных групп сельского или городского населения:

1. Индивидуальная работа с населением при проведении эпидемиологического обследования.

2. Лекции и беседы с населением, проводимые по эпидпоказаниям.

3. Использование массовых каналов пропаганды: местной печати, радио, демонстрация санитарно-просветительных фильмов.

4. Использование наглядных санитарно-просветительных материалов: плакатов, выставок, научно-популярной литературы (памяток, буклетов и др. по вопросам профилактики бруцеллеза, в том числе на национальных языках).

VII. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Для лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей применяются следующие методы: бактериологический, серологический и внутрикожная аллергическая проба.

Вся работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов внешней среды, в строгом соответствии с «Инструкцией о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I — II групп», утвержденной МЗ СССР 29 июня 1978 года.

Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами, как в условиях стационара, так и при массовых обследованиях на бруцеллез. Рекомендуется применять следующие серологические методы: реакции агглютинации — пластинчатую (Хеддльсона), объемную (Райта); антиглобулиновую пробу Кумбса, реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА).

1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Характерной особенностью рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5 — 10 дней, а иногда через 20 — 30 дней после засева. При этом первые генерации культур Br. abortus и Br. ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислоты (5 — 10%). Биотипы Br. abortus 5, 6 и 7 могут расти в обычных аэробных условиях.

Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя + сыворотка и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi — агар, среда «Д», печеночные и мясопептонные агары и бульоны (pH сред — 6,8; 7,2).

Рецепты приготовления сред даны в приложении.

Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды.

Для проверки агара из 2-х суточной культуры Br. melitensis или Br. abortus готовят суспензию бруцелл в концентрации 200 мк в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича). Посев проводят на 4 чашки по 0,1 мл (20 мк) суспензии. Агар признается пригодным, если через 5 суток пребывания в термостате при 37° в среднем вырастает не менее 18 колоний на чашку.

Исследование крови

Посевы крови рекомендуется делать во время лихорадочного состояния больного, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур.

Однако не исключена возможность получения гемокультуры и при нормальной температуре. Кровь для посева следует брать до лечения антибиотиками. Посевы крови рекомендуется проводить во флаконы (желательно прямоугольные) емкостью 100 — 200 мл, в которые наливают по 30 — 50 мл агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы агар застыл на одной из сторон флакона. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25 — 30 мл предварительно простерилизованного бульона и выдерживают в термостате при 37° в течение 2 — 3-х суток <*>. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании углекислоты (5 — 10%), а другой в обычных условиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду. При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4 — 6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрилитете) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-культур бруцелл (состав питательной среды см. приложение).

---

<*> Агар с бульоном может быть использован не позднее 5 — 7 дней.

Способ посева бактериологического материала для выделения L-культур идентичен с методом выделения бактериальных Гемокультур.

Посевы выдерживаются в термостате не менее 35 — 40 дней.

Исследование другого материала

Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинно-мозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т.д. Посевы проводят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры к среде следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000.

Для выделения бруцелл из материалов, загрязненных посторонней микрофлорой и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале, используются морские свинки (весом 300 — 350 гр) или белые мыши (весом 17 — 18 гр) — биологическая проба. Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.

Вскрытие белых мышей производится через 20 — 25 дней, а морских свинок — через 30 — 35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует брать кровь из сердца для исследования сыворотки по реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут целиком лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для засева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов (по возможности больше) берут «уколом» стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25 — 30 см, диаметром 4 — 5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 час в дезраствор (5% раствор карболовой кислоты), затем автоклавируют, после чего тщательно промывают и стерилизуют для последующего употребления. Посевы выдерживают при 37 °C в термостате 20 — 25 дней. Просмотр посевов на пробирках с агаром и бульоном производят каждые 3 — 4 дня, из помутневших бульонов делают высевы на пробирки со скошенным агаром.

Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при наличии положительной реакции Райта у животных в титре не менее 1:20.

Идентификация бруцелл

Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле.

Морфология колоний. Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком), с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют.

Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3 — 4 мм и больше, могут быть очень мелкие — точечные колонии 0,1 — 0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).

Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу МБС-1 или обычный микроскоп с объективом наименьшего увеличения.

Микроскопия окрашенных препаратов. При окраске по Граму бруцеллы грамотрицательны (окрашиваются в красный цвет). Окрашивание препаратов по способу Козловского: препараты, фиксированные на пламени горелки или спиртовки, окрашивают 0,5% водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5% водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40 — 50 секунд. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина, а остальные бактерии окрашиваются в зеленый цвет.

Проба со специфической сывороткой. Для предварительной, быстрой идентификации ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю специфической агглютинирующей сыворотки, разведенной 1:25 0,5% карболизированным физиологическим раствором, в которой эмульгируется одна петля исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 минуты) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных — суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной сыворотки или физиологическом растворе.

Люминесцентная микроскопия (см. раздел 4 «Индикация бруцелл в воде, пищевых продуктах»).

Идентификация L-форм бруцелл

Для определения принадлежности выделенных L-культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, а также способность к росту на специальной питательной среде с пенициллином.

Характер роста и морфология L-форм бруцелл. L-колонии бруцелл могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. Колонии от 2 до 3 мм имеют золотистый цвет, слизистую консистенцию, часто врастают в агар. При просмотре через бинокулярную лупу МБС-1 L-колонии имеют вид «яичницы» — плотный центр и ажурные светлые края.

Микроскопия нативных препаратов. Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и из них готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют одну петлю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.

По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться как внутри крупных клеток, так и лежать свободными зернистыми массами. В препарате могут находиться клетки от 0,2 до 0,5 мкм гетероморфные или близкие по морфологии к нормальным клеткам бруцелл.

Проба со специфической сывороткой

L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл.

Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной антисывороткой в разведении 1:25.

Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. Поэтому рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве физиологического раствора и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной сыворотки или физиологического раствора в качестве контроля.

Скорость специфической реакции агглютинации L-культур может быть несколько замедленной. Характер агглютината при положительной реакции обычен.

Метод дифференциации бруцелл

После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).

Проба с раствором трипафлавина (на стекле). На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро (1 — 2 минуты) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

Реакция термоагглютинации. 2 — 3 мл одномиллиардной взвеси двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане при 90° в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1 час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия бруцелл недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной.

Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к CO₂, образование H₂S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться моноспецифическими сыворотками, отношение к фагу «Тб».

Дифференциация по образованию сероводорода. В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1 x 8 см. Полоски затем просушивают. Заготовленные впрок сухие полоски фильтровальной бумаги хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой не более 1 — 2 месяцев.

Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе (2 млрд. м. кл. в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную поверхность печеночного агара (pH — 6,8 — 7,2). Затем берут полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно висел над верхним краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживающей выхода из пробирки углекислоты. Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °C.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевом конца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.

Результаты учитывают через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете помутневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают.

Для Br. suis (биотип I) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12 — 20 мм, для Br. abortus (биотип I) — около 5 — 7 мм, Br. melitensis (биотип I), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение края свинцовой бумажки. У штаммов Br. neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5 — 8 мм. Культуры Br. ovis и Br. canis сероводорода не образуют.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок. Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды: агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин — 1:50000, тионин — 1:50000.

При отсутствии стандартных оттитрованных красок рабочие их дозы можно оттитровать с использованием эталонных штаммов бруцелл. Для этого испытуемые краски добавляют к среде в различных концентрациях. Концентрация красок в среде, с которой получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл (Br. melitensis 16M, Br. abortus 544, Br. suis 1330) и является рабочей дозой данной краски. Основные растворы фуксина и тионина готовят в концентрации 1:1000 (0,1 г краски, 20 мл 96° спирта и 80 мл дистиллированной воды). Флаконы с краской хранят в темном месте в течение 6 — 10 месяцев. Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45° — 50° агара стерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 — 25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Среды с красками должны храниться в холодильнике (+4 °C) и пригодны для работы в течение 10 — 15 дней. Обесцвеченные среды применять нельзя.

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича для бруцелл). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно засевать одновременно 4 — 6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4 — 6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37°. Учет полученных результатов проводят через трое суток инкубации.

Схема учета: интенсивный рост по всему штриху 4+,

интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+,

менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+,

очень слабый рост по ходу штриха, или отдельные колонии +.

Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками <*>. Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-х суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Тарасовича для бруцелл). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

---

<*> Готовит лаборатория бруцеллеза ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида Br. melitensis; б) контроль с эталонным штаммом Br. abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37° 18 — 20 часов, а затем в течение 2-х часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20, но не менее чем на 2+.

Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биотипов бруцелл, находящихся в R-форме для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере pH 8,2 — 8,4.

Определение чувствительности культур бруцелл к фагу. Бруцеллезный фаг «Тб» <*> избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящихся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод:

---

<*> Готовит лаборатория бруцеллеза ИЭМ им. И.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Питательная среда — 1,5%, мартеновский, агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25 — 30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.

Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета 1 млрд. микробных клеток в 1 мл, 0,4 — 0,5 мл из этой взвеси наливают на поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре 37°. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной капле фага в концентрации по 106 корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро наклоняют и капли фага стекают по дорожке. Места нанесения капель фага и путь стекания капли можно заранее расчертить карандашом на внешней стороне дна чашки.

Учет результатов. Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке) 4+, лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки в виде «сот» 3+. Резко ослабленный рост и небольшое количество бляшек 2+, очень слабый лизис +, и отсутствие лизиса — результат отрицательный.

Оценка результатов. За положительный результат следует принимать лизис культуры минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве контроля рекомендуется включать три референтных штамма Br. melitensis 16М, Br. abortus 544 и Br. suis 1330.

Дифференциальные свойства видов и биотипов рода Brucella см. таблицу.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ВИДОВ И БИОТИПОВ РОДА BRUCELLA

Вид	Биотип	Потребность в CO2		Продукция H2S		Рост на средах с красками		Агглютинация с моноспецифическими сыворотками			Лизис фагом «Тб» RTD	Основной хозяин
						тионин	основн. фуксин
								A	M	R
1	2	3		4		5	6	7	8	9	10	11
Br. abortus	1	+ (+) +		+		-	+	+	-	-	Л	крупный рогатый скот
	2	+		+		-	-	+	-	-	Л
	3 <**>	(+)		+		+	+	+	-	-	Л
	4	(+)		+		-	+ <***>	-	+	-	Л
	5	-		-		+	+	-	+	-	Л
	6 <**>	-		+ (-) +		+	+	+	-	-	Л
	7	-		(+)		+	+	+	+	-	Л
	9	(-)		+		+	+	-	+	-	Л
Br. suis	1	-		+		+	- <****>	-	-	-	ОЛ	свиньи
	2	-		-		+	-	+	-	-	ОЛ	свиньи зайцы
	3	-		-		+	+	+	-	-	ОЛ	свиньи
	4	-		-		+	(+)	+	+	-	ОЛ	олени
Br. melitensis	1	-		-		+	+	-	+	-	ОЛ	овцы, козы
	2	-		-		+	+	+	-	-	ОЛ
	3	-		-		+	+	+	+	-	ОЛ
Br. ovis	7	+		-		+		-	-	+	ОЛ	овцы
Br. canis		-		-		+	-	-	-	+	ОЛ	собаки
Br. neotomae		-		+		+		+	-	-	ОЛ или ЧЛ	пустын. древесн. крысы

---

<*> Концентрация — 1:50000; большинство штаммов положительные; (-) большинство штаммов отрицательные.

<**> Для более точной дифференциации Br. abortus биотип 3, биотип 6 используется тионин 1:25000 (биотип 3+; биотип 6-).

<***> Некоторые штаммы этого биотипа (биотип 4) ингибируется основным фуксином.

<****> Некоторые штаммы могут быть резистентны к основному фуксину, пиронину и сафранину О.

+

+ ингибируется при тионине 1:150000.

+

Л — полный лизис; ЧЛ — частичный лизис; ОЛ — отсутствие лизиса.

Br. abortus биотип 8 исключен из таблицы.

Таблица рекомендована Международным Комитетом по систематике бактерий, Подкомитетом по таксаномии Brucella 5 сентября 1978 г. XII Международный конгресс по микробиологии, Мюнхен.

2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

При бруцеллезе рекомендуется несколько методов, которые используются в зависимости от целей исследования.

При проведении эпидобследования населения в очагах рекомендуется: реакция агглютинации — пластинчатая (Хеддльсона) и объемная (Райта), реакция Кумбса, реакция пассивной гемагглютинации, кожная аллергическая проба.

При обследовании населения перед профилактической вакцинацией можно ограничиться пластинчатой реакцией агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробой.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза проводят бактериологические исследования, ставят реакцию агглютинации и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.

Для диагностики хронического бруцеллеза и при проведении диспансерного наблюдения за переболевшими бруцеллезом рекомендуется реакция Кумбса и аллергическая проба.

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменять друг друга. Это обуславливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (в первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического; серологические реакции в этот период оказываются положительными почти в 95% случаев. По мере удлинения срока заболевания процент положительных серологических реакций (реакция агглютинации, РПГА) начинает падать. В поздние периоды заболевания большую диагностическую ценность имеет реакция Кумбса и внутрикожная аллергическая проба.

При проведении обследования нужно учитывать, что если высокие титры антител почти всегда указывают на наличие инфекции, то антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется проводить повторные исследования с интервалом 1 — 2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Следует иметь в виду, что положительную реакцию агглютинации с бруцеллезным антигеном могут давать также сыворотки, содержащие антитела к холерному и туляремийному антигенам (например, при профилактической иммунизации против этих инфекций).

Пластинчатая реакция агглютинации (реакция Хеддльсона).

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстроте получения результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддльсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной примерно 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 — контроль сыворотки. К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном стеклянной палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут:

а) контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации;

б) контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена.

Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме:

а) полное просветление жидкости с крупными или мелкими хлопьями, т.е. 100% агглютинации (4+);

б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75% агглютинации (3+);

в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50% агглютинации (2+);

г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+);

д) равномерно мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема:

а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»;

б) агглютинация на 2+, 3+ во второй или третьей дозах (0,02 — 0,01 мл сыворотки) — результат «положительный»;

в) агглютинация в первой дозе — (0,04 мл сыворотки) — результат «сомнительный»;

г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА.

Реакция агглютинации (Райта)

Реакция агглютинации является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность реакция агглютинации представляет при острой и подострой форме бруцеллеза.

Схема постановки реакции следующая:

В пробирки разливают физиологический раствор: в первую — 2,4 мл, в остальные по 0,5 мл.

В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, перемешивают, переносят 0,5 мл смеси во вторую пробирку, перемешивают, переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси выливают, в результате получают в каждой пробирке по 0,5 мл следующих разведений 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. Из первой пробирки 0,5 мл переносят в чистую пробирку и добавляют туда 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки) в разведении 1:50), а 1,0 мл выливают.

Диагностикум разводят физиологическим раствором согласно прилагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки, кроме контроля. После добавления диагностикума разведение сыворотки соответственно удваивается, т.е. получается 1:50, 1:100 и т.д. Сыворотки с антигеном смешивают путем встряхивания и помещают в термостат (37°) на 18 — 20 часов. После инкубации пробирки выдерживают 1 — 2 часа при комнатной температуре и проводят учет реакции.

Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от степени осаждения агглютината и просветления жидкости.

Для приготовления стандарта мутности антиген, применяемый для постановки РА, еще раз разводят в два раза.

Дальнейшее разведение антигена физиологическим раствором производят по следующей схеме.

	Степень агглютинации
	+ + + +	+ + +	+ +	+	-
Антиген, развед. 1:2	0	0,25	0,5	0,75	1,0
Физраствор	1,0	0,75	0,5	0,25	0
% просветления	100	75	50	25	0

Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА и ставят в термостат одновременно с основной реакцией.

Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50% агглютинации — просветление, оцениваемое на 2+.

При применении стандартизированного диагностикума титры исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц антител (ме/мл). Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50, 100, 200 и т.д. ме/мл.

При диагностической оценке результатов реакции агглютинации рекомендуется следующая схема.

титр сыворотки 1:50 (50 ме/мл)		- результат сомнительный;
титр сыворотки 1:100 (100 ме/мл)		- результат положительный;
титр сыворотки 1:200 (200 ме/мл)
титр сыворотки 1:400 (400 ме/мл)		- результат резко положительный

Антиглобулиновая проба (реакция Кумбса)

В диагностике бруцеллеза у людей и животных, особенно при хроническом течении инфекции, когда реакция агглютинации может быть отрицательной или положительной в низких титрах, важное место следует отвести выявлению неполных антител. При постановке реакции Кумбса используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку против глобулина человека. (Например, антиглобулиновая сыворотка, применяемая для выявления резус антител или сыворотка для иммуноэлектрофореза против глобулина человека) <*>, (см. схему титрации). Реакцию Кумбса ставят следующим образом: В начале ставят реакцию агглютинации (Райта). После учета реакции агглютинации (через 20 часов) берут не менее трех пробирок первых разведений при отрицательном результате реакции агглютинации или не менее трех пробирок, начиная со слабо положительного результата (+, ++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут для осаждения антигена. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают с помощью пастеровской пипетки и отбрасывают, затем в каждую пробирку наливают по 1 мл физиологического раствора, тщательно встряхивают и снова центрифугируют, таким образом осадок промывают три раза. После последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре, пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 18 — 20 часов. Учет реакции Проводят так же, как при реакции агглютинации.

---

<*> Сыворотку выпускает ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Для контроля антиглобулиновой сыворотки необходимо наряду с испытуемыми сыворотками взять в опыт сыворотку, содержащую неполные антитела с известным титром.

Контроль антигена. Взвесь антигена в физиологическом растворе подвергается отмыванию центрифугированием, как в основной реакции, после чего добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете реакции в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение.

Схема титрования антиглобулиновой сыворотки для реакции Кумбса

Для титрования антиглобулиновой сыворотки (против глобулинов человека) необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре. Титрование антиглобулиновой сыворотки производят следующим образом. Вначале титруют положительную бруцеллезную сыворотку в реакции агглютинации (Райта). При этом делают несколько рядов разведений сыворотки (приблизительно — 8 рядов). (Схема 1).

После учета реакции агглютинации во всех рядах отбирают пробирки, в которых отсутствует агглютинация (в схеме № 1 — начиная с 1:400) и в каждой из них отмывают антиген согласно методике постановки реакции Кумбса. Затем (схема 2) делают несколько разведений титруемой антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд пробирок с оставшимся после отмывания антигеном. Объем жидкости в каждой пробирке должен быть равен 0,5 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°. Результаты учитывают так же, как реакцию агглютинации. За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее наибольшее разведение (в нашем примере 1:80 — 4 ряд), которое выявляет неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40).

Схема 1

РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

№ рядов	Разведения сыворотки, содержащей неполные антитела
	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400
1	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
2	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
3	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
4	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
5	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
6	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
7	4+	4+	2+	-	-	-	-	-
8	4+	4+	2+	-	-	-	-	-

Схема 2

Результаты реакции Кумбса

№ рядов	Разведение антиглобулиновой сыворотки	Разведения сыворотки, содержащей неполные антитела
		1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400
1	1:10	4+	4+	4+	4+	-
2	1:20	4+	4+	4+	4+	-
3	1:40	4+	4+	4+	4+	-
4	1:80	4+	4+	3+	2+	-
5	1:100	4+	3+	2+	-	-
6	1:150	4+	3+	-	-	-
7	1:200	3+	2+	-	-	-
8	1:250	-	-	-	-	-

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

РПГА является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РПГА необходимо иметь: а) бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум, б) контрольные (несенсибилизированные) эритроциты, в) нормальную сыворотку кролика, г) бруцеллезную сыворотку <*>.

---

<*> Эритроцитарный антигенный бруцеллезный диагностикум выпускает Одесский завод бакпрепаратов Минздрава СССР. В комплект входят все остальные ингредиенты для постановки РПГА.

Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная сыворотка кролика, инактивированная при 56 °C в течение 30 минут и разведенная физиологическим раствором 1:100.

Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1 мл сыворотки + 2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в течение 30 минут при 56 °C. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50% взвесью контрольных эритроцитов. К 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50% эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 2-х минут. Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4 °C), в этом случае исключается центрифугирование.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят физиологическим раствором (pH 7,0 — 7,2) согласно указанию на этикетке и получают 2,5%-ую взвесь, которая применяется в РПГА. Контрольные (несенсибилизированные) эритроциты также разводят согласно указанию на этикетке и применяют полученную 2,5%-ую взвесь для контроля сывороток.

Схема постановки РПГА

Реакцию ставят в прозрачных полистироловых пластинках с лунками. Каждую сыворотку исследуют не менее чем в 6 — 8 разведениях, начиная с 1:50. Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сыворотку кролика разливают во все лунки по 0,5 мл. Затем в первую лунку (контроль сыворотки) вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки, предварительно инактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5 мл выливают. Во вторую лунку также добавляют 0,5 мл испытуемой сыворотки (1:25), перемешивают, переносят 0,5 мл в третью лунку и титруют сыворотку до конца ряда, из последней лунки 0,5 мл выливают. Таким образом, получают ряд последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки, начиная с 1:50, в объеме 0,5 мл.

В первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по 0,05 мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со второй, с помощью микропипетки добавляют по 0,05 мл диагностикума. Пластины осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунок, следя, чтобы не было разбрызгивания жидкости, и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 часа.

При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:

а) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума, во вторую — 0,05 мл контрольных эритроцитов;

б) качество диагностикума проверяют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до 1:100000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума.

Реакция считается специфической, если в контролях исследуемых и контрольной сыворотки отсутствует гемагглютинация, а титр специфической сыворотки в реакции будет соответствовать титру, указанному на этикетке флакона эритроцитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

4+ — эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик.

3+ — эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-х крестовой реакции, размеры зонтика также меньше.

2+ — агглютинат небольшой, расположен в центре лунки.

1+ — вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат.

Отрицательная реакция — осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток на бруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 — реакция сомнительная, титр 1:100 и выше — реакция положительная. При записи результатов РПГА следует указывать титр сыворотки.

Примечание. В целях экономии диагностикума можно сначала добавить лишь в 2 — 3 первые лунки, а при получении положительного результата внести диагностикум во все остальные лунки, чтобы при повторном учете реакции через следующие 2 часа получить окончательный титр сыворотки.

Внутрикожная аллергическая проба (Бюрне)

Внутрикожная аллергическая проба основана на способности организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически отвечать местной реакцией (отек, болезненность) на внутрикожное введение бруцеллина. Бруцеллин представляет собой фильтрат трехнедельной бульонной культуры бруцелл.

Реакция специфична, но выявляется у больных позднее, чем антитела, и сохраняется очень долго, иногда годами, после исчезновения клинических симптомов. Необходимо иметь в виду, что аллергическая реакция может быть положительной в случаях бессимптомной инфекции, а также у привитых живой бруцеллезной вакциной и у лиц, длительно контактировавших со специфическим антигеном.

Техника постановки. Бруцеллин вводится внутрикожно в количестве 0,1 мл. Инъекция делается с соблюдением асептики на ладонной поверхности предплечья шприцем с тонкой иглой (техника, тождественная реакции Манту, Шика и Дика). Учет реакции производится через 24 — 48 часов после введения бруцеллина путем осмотра и ощупывания кожи.

В некоторых случаях аллергическая реакция становится положительной к 72 часам.

При положительной реакции на месте введения бруцеллина появляется красноватая или бледная болезненная отечность удлиненной или овальной формы. Отек может быть хорошо контурирован, с ясным возвышением над уровнем нормальной кожи. При слабо выраженной реакции отек распознается только при ощупывании (сравнить с аналогичным участком кожи на другой руке). Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за отрицательный результат. При учете реакции отмечается размер отека в сантиметрах (длина и ширина), степень болезненности через 24 и 48 часов. При отрицательном результате следует учитывать реакцию и через 72 часа.

Оценка реакции. Наличие выраженного отека кожи на месте введения бруцеллина считается положительной аллергической реакцией. Отсутствие болезненности и гиперемии при наличии отека не исключают положительный оценки пробы.

Реакция, появившаяся и исчезнувшая ранее шести часов после введения бруцеллина, считается неспецифической.

У людей, высокосенсибилизированных к бруцеллезному антигену, возможная общая реакция организма на введение бруцеллина с повышением температуры, ознобом, головной болью и недомоганием.

Оценка реакции: Слабо положительная — слабо выраженный отек не более 2 см в диаметре;

Положительный — отек размером от 2 до 6 см в диаметре;

Резко положительная — отек свыше 6 см, иногда сопровождающийся лимфаденитом и общей реакцией.

Индикация бруцелл в воде, пищевых продуктах и патологическом материале

Наиболее достоверным методом обнаружения возбудителя бруцеллеза в пищевых продуктах, воде, патологическом материале являются бактериологический и биологический методы, описанные выше. Для быстрого обнаружения возбудителя бруцеллеза в первичных посевах, пищевых продуктах, воде и патологическом материале рекомендуются следующие методы: микроскопия препаратов, прямой иммунофлуоресцентный метод и реакция нейтрализации антител (РНАт).

1. Микроскопия.

Мазки, приготовленные из первичных посевов, из центрифугата или фильтрата (при исследовании воды, молока) и препараты-отпечатки из патологического материала после фиксации окрашивают по Граму или Козловскому и просматривают в световом микроскопе.

2. Прямой иммунофлуоресцентный метод.

Для обнаружения бруцелл применяют флуоресцирующие бруцеллезные антитела.

а) Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии. При исследовании воды готовят мазки (не менее 3 — 4) из осадка после центрифугирования и с мембранных фильтров. Мазки фиксируют в метиловом спирте 10 — 15 минут.

Мазки, приготовленные из проб цельного молока, сливок и осадка после центрифугирования, обезжиривают эфиром в течение 20 минут и дополнительно фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Мазки, приготовленные из мясного экстракта или осадка, фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Из селезенки белых мышей, которым был введен исследуемый материал, готовят препараты-отпечатки, которые фиксируют 96° спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом 15 минут при комнатной температуре.

При исследовании материала от абортированных плодов, различных эксудатов и органов инфицированных животных и людей готовят препараты-отпечатки, прикладывая предметное стекло к поверхности свежего среза. Затем препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом при комнатной температуре 15 минут.

б) Обработка препаратов флуоресцирующими антителами.

На фиксированные мазки наносят каплю бруцеллезной сыворотки. <> Для гашения неспецифического свечения фона применяют бычий альбумин, меченый родамином <>, который придает клеткам и другим органическим частицам тусклое оранжево-красное свечение.

---

<*> Выпускает ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Перед обработкой препаратов бруцеллезную люминесцирующую сыворотку и альбумин разводят до удвоенного рабочего разведения, указанного на этикетке. (Например, если рабочее разведение равно 1:20, то разводят 1:10). После этого альбумин и сыворотку смешивают в равных объемах и наносят на исследуемый препарат, который помещают во влажную камеру (чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) на 15 — 20 минут, затем промывают проточной водопроводной водой в течение 10 минут и высушивают на воздухе. На препарат наносят каплю забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть забуференного физиологического раствора), покрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом.

в) Микроскопия препаратов.

Для микроскопии используется люминесцентный микроскоп МЛ-2 при силе тока 4,5А, объективы 90 и 100 и окуляры 5х или 7х (в зависимости от освещенности препарата). Светофильтры следует располагать следующим образом: (от источника света) СЭС-14-14, БС-8-2, ФЗ-1-2. Окулярный фильтр Т-2Н или Ж-18, вспомогательная линза — 1,6. При микроскопии препаратов следует пользоваться не флуоресцирующим маслом.

В положительных случаях, т.е. когда в исследуемом материале имеются бруцеллы, в микроскопе на темном или оранжево-красном фоне видны клетки с ярким зеленым свечением по периферии. Центральная часть клетки не светится. Конгломераты бруцеллезного антигена имеют также яркое зеленое свечение.

Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему.

Сверкающая флуоресценция зеленого цвета с четко выраженной формой клетки — четыре креста.

Яркая флуоресценция зеленого цвета — три креста.

Заметная, но слабо выраженная флуоресценция — два и один крест.

Положительным результатом считается флуоресценция, оцениваемая на четыре и три креста при наличии 2 — 3 клеток в каждом поле зрения препарата.

Реакция нейтрализации антител (РНАт)

РНАт является модификацией реакции пассивной гемагглютинации и основана на нейтрализации антител специфическим антигеном, находящимся в исследуемом материале. Тем самым специфическая сыворотка лишается способности агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном.

Реакция нейтрализации антител применяется для обнаружения бруцеллезного антигена в патологическом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды.

Подготовка исследуемого материала

Материал, подозрительный на зараженность бруцеллами, перед постановкой реакции следует обезвредить путем прогревания при 100 °C (в кипящей водяной бане) в течение 10 минут. Жидкости (вода, молоко) прогревают в нативном виде. После прогревания воду и молоко центрифугируют при 3000 об./мин. 2 часа и берут для исследования осадок. Кусочки органов, брынзу и другой материал предварительно измельчают и растирают в ступке с добавлением 9 объемов физиологического раствора, полученную суспензию прогревают. Прогретую суспензию фильтруют через 2 слоя марли или бумажный фильтр и исследуют фильтрат или же центрифугируют его и берут для реакции надосадочную жидкость и осадок.

Реакцию ставят в полистироловых пластинах с лунками, которые должны быть тщательно вымыты, т.к. реакция отличается высокой чувствительностью и присутствие даже следов антигена может исказить ее результаты. Для постановки РНАт нужны те же ингредиенты, что и для РПГА и, кроме того, взвесь убитых бруцелл в концентрации 5 x 108 микробных клеток в 1 мл и бруцеллезная сыворотка с высоким титром гемагглютинирующих антител.

Бруцеллезную сыворотку предварительно титруют в РПГА, определяя ее предельное разведение, дающее реакцию не менее чем 3+. Это разведение принимают за одну сывороточную гемагглютинирующую единицу. Для РНАт берут разведение сыворотки, соответствующее 4 единицам. Например, если 1 единица соответствует разведению 1:25600, то 4 единицы — 1:6400. Поскольку в РНАт бруцеллезная сыворотка берется в объеме 0,25 мл, ее следует разводить в удвоенном титре, т.е. 1:3200. Реакцию ставят в 4-х рядах лунок, первый ряд — опытный (8 — 10 лунок), остальные контрольные (6 лунок).

В первом (опытном) ряду титруют испытуемый материал. Во втором ряду (контроль I) контролируется возможность неспецифической реакции за счет тканевых антигенов или гетерогенных антител. В третьем ряду (контроль 2) контролируется специфичность РНАт с заведомо бруцеллезным антигеном. В четвертом ряду (контроль 3) проверяется активность бруцеллезной сыворотки.

Если одновременно исследуют несколько проб, то для каждой пробы ставят только 1-й контроль, а второй и третий контроли ставят для всей партии проб.

Схема постановки РНАт

В лунки первого, второго и третьего рядов вносят нормальную сыворотку кролика (разведенную 1:100) по 0,25 мл, а в четвертый ряд по 0,5 мл в каждую лунку, кроме первой лунки. Затем в 1-е лунки опытного и второго (контроль 1) рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и титруют. В третий (контроль 2) ряд вносят бруцеллезный антиген в объеме 0,25 мл и также титруют. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го (контроль 2) рядов добавляют по 0,25 мл положительной бруцеллезной сыворотки 4 сывороточных гемагглютинирующих единиц (например 1:3200).

Во все лунки второго (контроль 1) ряда добавляют 0,25 мл нормальной сыворотки кролика (1:100). В четвертом (контроль 3) ряду разводят бруцеллезную положительную сыворотку в объеме 0,5 мл, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контроль 2) рядах, и проверяют соответствие разведения сыворотки 4-м сывороточным единицам (например 1:6400). Пластины встряхивают и ставят в термостат при 37 °C на 2 часа. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5% взвеси бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 часа.

Учет реакции

При наличии бруцеллезного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» или маленького колечка — реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают эритроциты — реакция нейтрализации отрицательная.

За титр РНАт принимают последнее разведение исследуемого материала, которое вызывало полное подавление гемагглютинации. Результат РНАт считается положительным, если подавление гемагглютинации отмечается не менее чем в первых 2 — 3 лунках.

Приложение

РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Печеночные среды

а) Печеночный настой

Свежую говяжью печень освобождают от жира и пленок и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой (на 1 кг фарша — 1 л воды) и настаивают при температуре 25 — 30 °C в течение 3-х часов или при температуре 4 — 10 °C в течение 6 — 10 часов. Затем эту смесь перемешивают и варят в автоклаве текучим паром в течение 20 минут. Можно варить и в котле, постоянно помешивая. В процессе варки снимают накипь, вновь все перемешивают и доваривают примерно еще около двух часов. После варки настой фильтруют через тонкий ватно-марлевый фильтр.

Приготовленный таким образом печеночный настой разливают по бутылям и стерилизуют в течение 20 минут при 115 — 120 °C.

б) Печеночный бульон

К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды, 10 г сухого пептона и 5 г химически чистого хлористого натрия. Смесь кипятят, устанавливают pH 7,4, фильтруют через фильтровальную бумагу и стерилизуют 20 минут при 115 — 120 °C, pH бульона после стерилизации должен быть 7,1 — 7,2.

в) Печеночный агар

К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, pH среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1 — 2 л).

В дальнейшем среду автоклавируют при 115 °C в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой, и вновь устанавливают pH 7,1 — 7,2.

Среду разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют при 115 °C в течение 20 минут.

2. Мясопептонные среды

а) Мясная вода

Свежее говяжье мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой из расчета 500 г фарша на 1 л воды и выдерживают в течение 15 часов в прохладном месте.

В дальнейшем настой варят 30 — 40 минут, фильтруют через ватно-марлевый фильтр или через полотно.

Полученную мясную воду, в случае заготовления впрок, стерилизуют при 120 °C в течение 20 минут.

б) Мясо-пептонный бульон

К 1 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г химически чистого хлористого натрия.

Смесь подщелачивают до pH 7,4 и кипятят в течение 20 минут. После этого фильтруют через бумажный фильтр, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115 — 120 °C в течение 20 минут. pH среды после стерилизации должен быть 7,2.

в) Мясо-пептонный агар

К 1 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара.

Смесь подщелачивают до pH 7,8, варят до полного расплавления агара. Затем разливают в бутыли и стерилизуют при 110 °C в течение 15 — 20 минут.

После стерилизации среду отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой, затем разливают в необходимую посуду и вновь стерилизуют 15 — 20 минут при 110 °C. После стерилизации вновь устанавливается pH среды, который должен быть равен 7,2.

3. Сывороточно-декстрозный агар

Основой этой среды является питательный агар, который готовят следующим образом: к 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 165 мл мясной воды.

Все ингредиенты вводят в сосуд и подвергают обработке текучим паром в течение 1 часа. Устанавливают pH 7,8. Затем сосуд ставят в автоклав и подвергают одномоментному давлению 2 атмосферы при 121° для выпадения фосфатов. Среду фильтруют через бумажные фильтры, устанавливают pH 7,4, а затем разливают в мерную посуду и стерилизуют при температуре 116° С в течение 15 минут. Заготовленный таким образом питательный агар по мере надобности расплавляют в водяной бане или автоклаве и охлаждают до 50 °C. Затем к нему добавляют нормальную инактивированную (при 56 °C 30 минут) лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы, предварительно простерилизованный путем фильтрации через фильтр Зейтца, так, чтобы окончательная концентрация сыворотки была 5% и декстрозы — 1%.

4. Кровяной агар

Основой этой среды является питательный агар, применяемый при изготовлении сывороточно-декстрозный среды.

Для приготовления кровяного агара к основной среде добавляют 5% дефибринированной овечьей крови.

5. Картофельная среда

Крупный отборный картофель моют и очищают. На 1 кг картофеля добавляют 1 л дистиллированной воды и варят до готовности картофеля. Затем жидкость сливают, измеряют объем, доливают дистиллированной водой до 1 л и фильтруют через двойной марлевый фильтр. После этого добавляют следующие ингредиенты: пептон — 10 г, химически чистый хлористый натрий — 5 г, глицерин — 30 мл и промытый агар-агар — 30 г. Все помещают в кастрюлю и варят до полного расплавления агара: pH 7,2 устанавливают 10% раствором едкого натрия.

После этого стерилизуют в автоклаве при 110 °C в течение 30 минут, фильтруют, добавляют 10 г глюкозы и вновь стерилизуют при 116 °C 30 минут. После автоклавирования к среде добавляют 10% нормальной инактивированной стерильной лошадиной или овечьей сыворотки.

6. Среда «Д» (по методу ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР)

а) Бульон «Д»

К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 2,5 г порошка стандартного бульона «Д», прогревают и тщательно размешивают до полного его растворения. Затем бульон фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 120 °C в течение 20 минут (pH среды 7,1 — 7,2).

б) Агар «Д»

К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 5 г порошка стандартного агара «Д», прогревают при помешивании до полного растворения порошка, не допуская его подгорания, затем фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 120 °C в течение 20 минут (pH среды 7,2).

7. Среда-заменитель «Альбими»-агара

К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г химически чистого хлористого натрия и 20 г агар-агара. Устанавливают pH 7,3.

Затем все растворяют в автоклаве под текучим паром и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой и хорошо отжатый).

Затем добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г бисульфита натрия. Вновь определяют pH (7,2 — 7,3). Разливают в необходимую посуду (пробирки, флаконы и т.д.) и стерилизуют 40 минут под текучим паром, а потом при 110 °C в течение 20 минут.

Дрожжевая вода. 1 кг хлебных дрожжей и 1 л дистиллированной воды кипятят до растворения. Затем фильтруют через полотняный фильтр. Хранить нужно под хлороформом в темноте не более двух недель.

8. Среда для культивирования Br. ovis

Основой этой среды является печеночный или мясо-пептонный агар, к которому добавляют 1% декстрозы (глюкозы) и 2% глицерина. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 116 °C в течение 15 минут. Перед посевом к расплавленной и остуженной до 50 °C среде добавляют 20% нормальной сыворотки крупного рогатого скота или 10% аминопептида и 10% сыворотки.

9. Среда для выделения и культивирования L-культур бруцелл

Основой этой среды являются питательный агар, который готовится с использованием а) печеночного настоя или б) мясной воды.

Приготовление агара из расчета на 1 л среды:

а) 500 мл печеночного настоя,

500 мл водопроводной воды,

10 г сухого пептона,

б) 280 мл мясной воды,

280 мл водопроводной воды,

440 мл мартеновского пептона.

добавляют 5 г химически чистого хлористого натрия, 30 г агар-агара, промытого водопроводной водой, pH устанавливают 7,8.

Смесь кипятят до полного расплавления агара. Затем разливают в бутыли и стерилизуют при 115° в течение 15 — 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, смоченный теплой водой. После фильтрации добавляют 10 г глицерина и 10 г глюкозы, устанавливают pH 7,2 и вновь стерилизуют при 110° в течение 20 минут.

Заготовленный таким образом агар по мере надобности (перед посевом крови) расплавляют в водяной бане, охлаждают до 50° и к нему добавляют 25% нормальной лошадиной сыворотки (предварительно простерилизованной через фильтр Зейца), 25% печеночного или мясо-пептонного бульона (в соответствии с основой агара), содержащего 50 — 100 ед. пенициллина на 1 мл среды.

Посев крови в объеме не менее 5 мл, пунктатов костного мозга и лимфоузлов производят на питательную среду сразу же после застывания агара и добавления бульона (Метод предложен лабораторией бруцеллеза ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР).

---