Методические указания по определению пентадина в семенах и зеленой массе люпина, редиса методом газожидкостной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 12.05.1983 № 2792-83)
12 мая 1983 г. № 2792-83
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПЕНТАДИНА В СЕМЕНАХ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ ЛЮПИНА, РЕДИСА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны И.И. Пиленковой, А.Д. Фатьяновой (ВНИТИГ).
Краткая характеристика препарата. Пентадин - Na-соль 2,3,4,5,5-пентахлорпентадиеновой кислоты. Брутто-формула C O Cl Na. 5 2 5 Молекулярная масса 292,5. Белое кристаллическое вещество с температурой разложения 180 °C. Хорошо растворим в спирте, воде, ацетоне, плохо растворим в диэтиловом эфире, бензоле, хлороформе, четыреххлористом углероде. Пентадин применяют в качестве гербицида, десиканта в посевах
люпина, редиса и других культур.
2,3,4,5,5-Пентахлорпентадиеновая кислота (ПХПДК) представляет собой белое кристаллическое вещество с т. пл. 124 — 125 °C. Хорошо растворима в диэтиловом эфире, бензоле, хлороформе, плохо растворима в воде.
Принцип метода. Метод основан на экстракции пентадина из анализируемых проб смесью ацетона с водой (7:3), очистке экстракта путем попеременного перевода (Na-соли ПХПДК в ПХПДК и обратно), метилировании диазометаном ПХПДК и газохроматографическом определении метилового эфира ПХПДК на хроматографе с ДЭЗ. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.
Метрологическая характеристика метода. Диапазон определяемых концентраций 0,01 — 0,5 мг/кг. Предел обнаружения 0,2 нг, предел определения в растительном материале 0,01 мг/кг. Среднее значение определения стандартных количеств 82,5%. Стандартное отклонение 11,38%. Относительное стандартное отклонение 0,14. Доверительный интервал среднего (при p = 0,95 и n = 7) +/- 10,5%.
Избирательность метода. Определению не мешают пестициды ряда феноксиалканкарбоновых кислот (2,4-Д, 2,4-ДП и др.).
Реактивы и растворы. 2,3,4,5,5-Пентахлорпентадиеновая кислота с содержанием основного вещества не менее 98,5%. Ацетон х.ч. Гексан ч. Толуол ч.д.а. Эфир диэтиловый (медицинский для наркоза). Кислота хлороводородная х.ч. Гидроксид калия. Гидроксид натрия х.ч., 0,5 н водный раствор. Буферный раствор pH 6,86. Кислота фосфорно-молибденовая х.ч., 40-процентный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрозометилмочевина. Диазометан. Метиламин, 25-процентный водный раствор. Мочевина. Хроматон N-AW-HMDS (0,20 — 0,25 мм) с 5% метилсиликона SE-30 и 5% карбовакса 20 М. Азот особой чистоты газообразный в баллоне с редуктором.
Приборы и посуда. Хроматограф серии «Цвет» с ДПР или аналогичный прибор с ДЭЗ. Колонка стеклянная длиной 2 м с внутренним диаметром 3 мм. Испаритель ротационный ИР-1М. Аппарат для встряхивания. Микрошприц на 10 мкл. Воронка Бюхнера. Воронки: конусообразные диаметром 56 мм, делительные на 500 — 1000 мл. Стаканы химические на 100 мл. Колбы: для фильтрования под вакуумом; грушевидные на 100 мл для отгонки растворителя; колбы Эрленмейера со шлифом на 250 мл. Колбы мерные, цилиндры, мензурки. Пипетки различной вместимости. Пробирки градуированные со шлифом на 5 мл. Мельница лабораторная. Насос вакуумный.
Подготовка к определению. Получение нитрозометилмочевины. Во взвешенную круглодонную колбу на 1 л наливают 200 г 2-процентного водного раствора метиламина (либо в виде водного раствора, либо в виде хлоргидрата) и добавляют при охлаждении концентрированную хлороводородную кислоту до кислой реакции по метиловому красному, на что требуется около 155 мл кислоты. Затем доливают столько воды, чтобы общая масса достигла 500 г, и прибавляют 300 г мочевины, после чего раствор осторожно кипятят с обратным холодильником 2 ч 45 мин. и энергично — 15 мин. Раствор охлаждают до комнатной температуры, растворяют в нем 110 г 95-процентного раствора нитрита натрия и охлаждают до 0 °C.
В стакане вместимостью 3 л готовят смесь: 600 г льда и 100 г концентрированной серной кислоты при охлаждении стакана смесью льда с солью. Затем к содержимому стакана при перемешивании добавляют холодный раствор метилмочевины и нитрита натрия с такой скоростью, чтобы температура не поднималась выше 0 °C.
Нитрозометилмочевина всплывает на поверхность в виде кристаллической пены, которую немедленно отфильтровывают через воронку Бюхнера, хорошо отжимают. Кристаллы размешивают до образования пасты с 50 мл холодной воды, воду отфильтровывают, кристаллы отжимают и сушат в вакуум-эксикаторе до постоянной массы. Выход 105 — 115 г, 66 — 72% от теоретического. Полученный таким образом препарат можно хранить в холодильнике длительное время. При температуре выше 20 °C его не следует хранить более 1 ч. При температуре 30 °C он может неожиданно разложиться без взрыва, но с выделением паров.
Получение диазометана. В круглодонную колбу на 100 мл помещают 3 мл 50-процентного водного раствора едкого кали и 10 мл диэтилового эфира. Смесь охлаждают до 5 °C, после чего при взбалтывании прибавляют 1 г нитрозометилмочевины. Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен аллонжем с отводом, проходящим через резиновую пробку и погруженным в слой эфира на дне приемника. Приемник охлаждают смесью льда и соли. Реакционную колбу погружают в водяную баню, нагретую до 50 °C. Эфир в колбе доводят до кипения. Время от времени содержимое колбы перемешивают. Во избежание взрыва ни в коем случае не следует отгонять весь эфир!
Метилирование проб. К сухому остатку приливают небольшое количество раствора диазометана в диэтиловом эфире до прекращения обесцвечивания, затем растворитель полностью отгоняют на воздухе.
Приготовление стандартных и градуировочных растворов, построение градуировочного графика. Стандартный раствор ПХПДК с концентрацией 0,4 мг/мл готовят растворением навески 0,01 г в 50 мл толуола. Срок хранения в холодильнике — неделя. Для построения градуировочного графика готовят десять искусственных смесей: в градуированные пробирки помещают 1; 2; 3; 4; 5; 10; 15; 20; 25 и 30 мкл стандартного раствора ПХПДК, метилируют ПХПДК диазометаном, приливая его эфирный раствор до тех пор, пока не исчезнет желтая окраска, испаряют досуха содержимое пробирок и растворяют сухой остаток в каждой из пробирок в 2 мл толуола. Хроматографируют по 2 мкл полученных растворов. Измеряют высоты пиков, соответствующих метиловому эфиру ПХПДК, и строят график зависимости высоты (в мм) от количества ПХПДК (в нг).
Приготовление насадки и кондиционирование колонки. Взвешивают на технических весах стационарные жидкие фазы карбовакс 20 М и метилсиликон SE-30 в количестве 5% каждого от массы хроматона N-AW-HMDC, растворяют их в хлороформе, всыпают в раствор хроматон и тщательно перемешивают в течение 15 — 20 мин. Растворитель испаряют на водяной бане, насадку подсушивают в сушильном шкафу при 100 °C в течение 1 ч. Насадку засыпают в колонку, уплотняют, колонку устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют в токе азота при температуре 150 °C в течение 8 — 10 ч, не подключая к детектору.
Ход анализа. Измельченную пробу (10 — 20 г) заливают 35 мл ацетона и 15 мл воды и встряхивают в течение 1 ч. Растительные остатки отфильтровывают на воронке Бюхнера. После этого фильтрат переливают в делительную воронку, подщелачивают 0,5 н раствором едкого натра до pH 9 — 10 и трижды промывают гексаном порциями по 20 мл. Промывной гексан отбрасывают. Из водно-ацетонового экстракта на ротационном испарителе отгоняют ацетон. Оставшуюся водную часть экстракта для перевода Na-соли ПХПДК в ПХПДК подкисляют хлороводородной кислотой до pH 4 и приливают для осаждения белков 20 мл раствора фосфорно-молибденовой кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают. Из фильтрата ПХПДК извлекают хлороформом трижды порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз 5 — 7 мин. Хлороформный экстракт трижды промывают водой порциями по 20 — 30 мл. Водные вытяжки отбрасывают, а хлороформный экстракт экстрагируют буферным раствором с pH 6,86 (трижды порциями по 25 мл), встряхивая каждый раз 3 — 5 мин. Буферный экстракт, содержащий Na-соль ПХПДК, подкисляют для перевода соли в ПХПДК 2 мл хлороводородной кислоты и экстрагируют из него ПХПДК тремя порциями диэтилового эфира по 25 мл. Эфирный экстракт, содержащий ПХПДК, осушают, пропуская через слой безводного сульфата натрия (5 г), помещенный на фильтровальную бумагу в коническую воронку, эфир отгоняют на ротационном испарителе до объема 1 — 2 мл. Остаток переносят в градуированную пробирку и метилируют содержащуюся в нем ПХПДК диазометаном. Не прореагировавший диазометан и эфир отдувают досуха током воздуха, растворяют сухой остаток в 2 мл толуола. Полученный толуольный раствор хроматографируют.
Условия хроматографирования. Используют стеклянную спиральную колонку длиной 2 м с внутренним диаметром 3 мм, заполненную хроматоном N-AW-HMDC (фракция 0,20 — 0,25 мм) с 5% SE-30 и 5% карбовакса 20 М. Температура (°C): термостата колонок — 140, испарителя — 200, детектора — 200. Расход газа-носителя через колонку 80 мл/мин., через продувочную камеру — 140 мл/мин. Скорость протяжки картограммы 200 мм/с. Линейность детектирования от 0,0002 до 0,005 мкг. Объем экстракта, вводимый в испаритель, 2 — 3 мкл. Минимально детектируемое количество ПХПДК 0,0002 мкг. Абсолютное время удерживания метилового эфира ПХПДК 9 мин.
Хроматографирование экстракта проводят трижды, замеряют высоты пиков метилового эфира ПХПДК, вычисляют среднее значение высоты и по калибровочному графику находят количество ПХПДК в аликвоте экстракта.
Обработка результатов анализа. Содержание пентадина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
AV
2
где:
A — количество ПХПДК, найденное в аликвоте экстракта по калибровочному графику, нг;
V — объем аликвоты, вводимой в прибор, мкл; 1
P — навеска анализируемой пробы, г.
Требования безопасности. Следует соблюдать правила безопасности при работе в химических лабораториях с растворителями и взрывоопасными веществами.