Методические указания по определению картоцида (фитона) в картофеле, свекле, огурцах, томатах, яблоках, цитрусовых, луке, жоме, мелассе, сахаре, воде и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 06.08.1981 № 2431-81, 21.11.1985 № 4039-85)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КАРТОЦИДА (ФИТОНА) В КАРТОФЕЛЕ, СВЕКЛЕ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЯБЛОКАХ, ЦИТРУСОВЫХ, ЛУКЕ, ЖОМЕ, МЕЛАССЕ, САХАРЕ, ВОДЕ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

---

<*> Разработаны Т.В. Алдошиной, К.Ф. Новиковой, Ф.Г. Мельцер, Г.А. Летуновской, Э.В. Сазоновой (ВНИИХСЗР).

    Краткая   характеристика  препарата.  Картоцид  -  новый  отечественный
фунгицид,  рекомендуемый  для  борьбы с грибковыми заболеваниями картофеля,

томатов и других сельскохозяйственных культур. Действующее начало препарата

• трикапролактамо-медь       (II)-дихлоридмоногидрат.    Брутто-формула
  

C  H  Cl N O Cu.  Молекулярная масса 482,0. В чистом виде кристаллы желтого
 18 35  2 3 4
цвета,  т.  пл.  83  -  85  °C.  Хорошо  растворимы в воде. Растворимость в

органических растворителях при 20 °C, %: в ксилоле — 1,8, хлороформе — 4,4, ацетоне — 12,7, этиловом спирте — 21,5. Давление паров при 20 °C 0,04 Па. В лимонах МДУ 0,1 мг/кг. В сахарной свекле, цитрусовых (мякоть) содержание картоцида не допускается.

Принцип метода. Метод основан на извлечении картоцида из сельскохозяйственной продукции ацетоном, очистке экстракта перераспределением из ацетоновой среды в хлороформ, а затем на колонке с окисью алюминия с последующим определением образовавшегося капролактама методом ТСХ на пластинках «Силуфол». Из воды картоцид извлекают хлороформом и без очистки экстракта определяют методом ТСХ. В биологических объектах картоцид гидролизуют 0,1 н HCl до капролактама с последующим распределением его в хлороформ, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия и определением методом ТСХ.

    Метрологическая    характеристика    метода.   Предел   обнаружения   в
хроматографируемой  пробе  3 мкг. Предел определения в сельскохозяйственной
продукции  0,15  мг/кг, в воде 0,001 мг/л, в жоме  0,3 мг/кг  и  в  мелассе
0,6 мг/кг. Среднее значение  определения  стандартных  количеств  картоцида

_

c 80% при n = 15. Стандартное отклонение +/- 8,0%.  Доверительный  интервал
среднего  при  p = 0,95,  n = 5  для  всех объектов 80,0 +/- 10,3%.  Размах

варьирования для всех объектов 72,0 — 85,0%. Метрологическая характеристика метода дана в таблице 127.

Таблица 127

ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРТОЦИДА В БИООБЪЕКТАХ

Анализируемый объект	Нижний предел определения, мкг/г или мкг/мл	Среднее значение _ определения c при n = 15, %	Стандартное отклонение при n = 15, %	Доверительный интервал определения при n = 5, p = 0,95, %	Размах варьирования, %
Моча Кровь Почки Печень	5 5 1,5 0,7	87,3 76,7 56,0 56,0	+/- 8,0 +/- 8,2 +/- 5,5 +/- 5,6	87,3 +/- 9,9 76,7 +/- 10,2 55,0 +/- 6,8 55,0 +/- 7,0	80 — 100 70 — 90 50 — 60 50 — 60

Избирательность метода. Прочие пестициды определению не мешают, так как проявление на пластинке селективно лишь для картоцида.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Бензол х.ч. Метиловый спирт х.ч. Этиловый спирт х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Хлороводородная кислота, х.ч. 2 н и 0,1 н. Гидроксид натрия 1 н и 4 н. Хлорид железа ч.д.а. Гидроксиламин солянокислый ч.д.а. Проявляющие реагенты: № 1 (растворяют 21 г гидроксиламина солянокислого в 100 мл воды. Перед обработкой хроматограммы смешивают 20 мл полученного раствора с 5 мл 1 н NaOH); № 2 (к 85 мл воды добавляют 15 мл 2 н HCl и растворяют 10 г хлорида железа). Пластинка «Силуфол». Оксид алюминия нейтральный, II степени активности или отечественный для хроматографии. Стандартные растворы картоцида в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл (раствор 1) и 10 мкг/мл (раствор 2). Растворы 1 и 2 стабильны при хранении в холодильнике в течение 3 мес.

Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания. Камера для хроматографирования. Делительные воронки на 25; 100 и 1500 мл. Колбы: плоскодонные на 50 и 250 мл; круглодонные на 250 мл; мерные на 100 мл; конические на 25; 50 и 100 мл. Хроматографические колонки длиной 10 см, внутренним диаметром 2,5 см (колонка № 1) и 0,8 см (колонка № 2) с краном, стеклянная. Пробирки конические градуированные на 10 мл. Пипетки на 1; 5 и 10 мл с делениями. Пульверизаторы стеклянные. Цилиндры мерные на 100 и 250 мл. Пористый фильтр. Пипетки на 1 и 10 мл с делениями. Сушильный шкаф.

Подготовка к определению хроматографических камер. Хроматографические камеры за 1 ч до начала хроматографирования заполняют смесью подвижных растворителей хлороформ-метиловый спирт (25:2) и бензол-этиловый спирт (30:5) для насыщения камер парами подвижных растворителей. Объем подвижного растворителя должен по высоте находиться не ниже 0,7 — 1,0 см от уровня дна камеры. Хроматографическую колонку № 1 заполняют 3,5 г оксида алюминия в 20 мл хлороформа. Избыток хлороформа сливают с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя на уровне 1 — 2 мм над поверхностью сорбента. Хроматографическую колонку № 2 заполняют 2 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа при анализе мочи и крови и 9 г оксида алюминия в 40 мл при анализе печени и почек. Избыток хлороформа сливают с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя на уровне 1 — 2 мм над поверхностью сорбента.

Подготовка проб к анализу. Для анализа картофеля, огурцов, яблок, цитрусовых, лука, свеклы из средней пробы подготавливают три параллельные навески массой 20 г. Картофель, огурцы, свеклу, цитрусовые, яблоки измельчают ножом на кубики с размером граней около 0,5 см. Томаты и лук измельчают на маленькие дольки. Сахар анализируют в виде песка или молотого сахара и отбирают три параллельные навески массой 20 г, жом анализируют в естественном виде, отбирая навески массой 10 г. Каждую отобранную пробу крови (2 мл) или мочи (2 мл) помещают в отдельную пробирку и анализируют всю отобранную пробу. Навеску почек берут 5 — 10 г, печени 10 — 15 г.

    Ход анализа.  Экстракция  и  очистка экстракта.  Навеску  анализируемой
пробы картофеля,  огурцов,  томатов, яблок, цитрусовых, свеклы, лука, жома,
сахара  помещают в плоскодонную  колбу на 500 мл,  заливают 40 мл ацетона и
экстрагируют  картоцид с помощью механического встряхивания колбы в течение
30 мин. Экстракт пропускают  через  бумажный фильтр в круглодонную колбу на
250 мл, содержащую 0,5 мл воды. Экстракцию овощей и фруктов проводят  еще 2
раза тем же количеством растворителя.  Из объединенного экстракта с помощью
ротационного  вакуумного  испарителя   отгоняют   ацетон.   Водный  остаток
переносят в делительную воронку на 100 мл.  Колбы ополаскивают 2 раза водой
общим  объемом  5 мл,  в  случае жома и сахара - 20 - 25 мл. Водный раствор

дважды промывают 10 мл гексана. Гексановый слой отбрасывают. Из водной фазы

картоцид  трижды  экстрагируют  хлороформом   порциями  по  10  мл.   После
разделения слоев хлороформный слой  переносят в коническую колбу на 100 мл,
сушат над безводным  сульфатом натрия  (7 - 10 г), фильтруют в круглодонную
колбу на 50 мл.  Из  круглодонной  колбы с помощью  ротационного вакуумного
испарителя  отгоняют  растворитель  до объема 1 мл.  Остаток  переносят  на
хроматографическую  колонку  1,  заполненную  оксидом  алюминия II  степени

активности в хлороформе, при закрытом кране колонки, открывают кран колонки

и  дают  раствору  впитаться в сорбент.  Колбу  дважды обмывают хлороформом
порциями  по  2 мл  и  полученный раствор каждый раз переносят на колонку и
элюируют  картоцид  с  колонки  30 мл  хлороформа со скоростью 30 кап./мин.
Элюат  собирают  в  коническую  пробирку.  Общий объем  элюата  25 - 30 мл.
В пробирку  помещают  стеклянный  капилляр с заплавленным верхним  концом и

удаляют растворитель на горячей водяной бане до объема ~ 0,05 мл. Остаток с

помощью того же капилляра,  но с отломленным  заплавленным концом переносят
на хроматографическую  пластинку.  Параллельно на пластинку  наносят  серию
стандартов  с  содержанием  картоцида 3 - 15 мкг. Хроматограмму развивают в
системе   хлороформ-метанол   (25:2)   или   бензол-этанол  (30:5).   После
развития  хроматограммы   пластинку   сушат,   а  затем   обрабатывают   из

пульверизатора проявляющим раствором № 1. Влажную хроматограмму выдерживают

в сушильном шкафу при 120 °C  в  течение 15 - 20 мин., а затем обрабатывают
раствором N 2.  Картоцид в виде  капролактама  проявляется на пластинках  в
виде  темно-коричневых  пятен  на  желтом фоне с R   0,40 +/- 0,05 в первой

                                              f

системе и 0,28 +/- 0,03 во второй. Пятна стабильны в течение 5 — 7 мин.

Навеску мелассы 5 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды и трижды экстрагируют в делительной воронке на 500 мл хлороформом порциями по 100 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (25 г), затем фильтруют в круглодонную колбу, содержащую 0,5 мл 0,1 н HCl, и полностью отгоняют растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя. Влажный остаток количественно переносят из колбы в делительную воронку на 100 мл 25 мл 0,1 н HCl и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (5 г). Далее поступают, как описано для другой сельскохозяйственной продукции.

Из 1 л воды картоцид извлекают 4-кратной экстракцией хлороформом порциями по 100 мл, в делительной воронке — по 1,5 л. В воду предварительно добавляют около 15 г NaCl. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и порциями фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл. Из колбы с помощью ротационного вакуумного испарителя отгоняют растворитель до объема 1 — 2 мл. Последнюю порцию хлороформа отгоняют до объема 0,1 мл. Остаток количественно с помощью стеклянного капилляра переносят на хроматографическую пластинку, далее поступают так, как описано для анализа растительных проб.

    Образец крови  или мочи  переносят в делительную  воронку  вместимостью
25 мл,  пробирку  обмывают  1 - 2 мл  0,1 н  соляной  кислоты  и полученный
раствор  также  переносят  в  делительную  воронку.  Содержимое делительной
воронки  доводят  до  10  мл   0,1  н   хлороводородной   кислотой,   смесь
перемешивают несколько секунд и трижды экстрагируют полученный  капролактам
хлороформом порциями по 10 мл.  Хлороформный  экстракт в плоскодонной колбе
на 50 мл  сушат  над безводным сульфатом натрия (5 г). Хлороформный раствор
порциями  декантируют  в  круглодонную  колбу  на  25 мл, а затем с помощью
ротационного вакуумного испарителя концентрируют до объема ~ 1 мл.  Сульфат
натрия в колбе  3 раза  промывают свежими порциями хлороформа  по 2 - 3 мл,
полученный  раствор  также  переносят в круглодонную колбу и каждую  порцию
концентрируют   до   объема  ~ 1  мл.    Остаток  в  колбе   переносят   на
хроматографическую  колонку II с  Al O  при закрытом кране.  Открывают кран

                                2 3

колонки и дают раствору впитаться в сорбент.  Колбу  несколько раз обмывают
хлороформом и полученный раствор каждый раз переносят на колонку.  Элюируют
капролактам с колонки  хлороформом со скоростью 2 кап./с  с  подсоединением
слабого  вакуума.  Общий  объем  элюата 15 мл. Собирают элюат в грушевидную
колбу  на  25 мл  с  оттянутым концом.  Полученный  раствор концентрируют с
помощью  ротационного  вакуумного  испарителя до объема 0,05 мл  и проводят

определение методом ТСХ.

Навеску почек (5 — 10 г) гомогенизируют с помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 20 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на фильтре промывают 0,1 н соляной кислотой порциями по 5 мл 4 раза. Фильтрат переносят в делительную воронку на 100 мл и трижды экстрагируют капролактам хлороформом порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфитом натрия (5 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на 50 мл. Остаток в колбе промывают несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл. Хлороформный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема ~ 1 мл. Остаток в колбе переносят на хроматографическую колонку II с оксидом алюминия при закрытом кране. Открывают кран колонки и дают раствору впитаться в сорбент. Колбу несколько раз обмывают хлороформом порциями по 1 мл и полученный раствор каждый раз переносят на колонку, элюируют капролактам с колонки хлороформом со скоростью 2 кап./с с подсоединением слабого вакуума. Общий объем элюата 40 мл. Элюат собирают в грушевидную колбу на 50 мл с втянутым концом. Полученный раствор концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема ~ 0,05 мл и проводят определение методом ТСХ.

Навеску печени (10 — 15 г) гомогенизируют с помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 35 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на фильтре промывают 0,1 н хлороводородной кислотой порциями по 5 мл 4 раза. Фильтрат переносят в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют капролактам трижды хлороформом порциями по 15 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (5 — 7 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на 50 мл. Содержимое колбы концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 — 3 мл. Оставшийся в колбе сульфат натрия промывают несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл. Хлороформный раствор переносят в грушевидную колбу и ее содержимое концентрируют до объема 1 мл. Остаток переносят на хроматографическую колонку II и далее поступают так, как описано выше при анализе почек.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом содержании картоцида на пластинку наносят аликвотную часть раствора. Содержание картоцида в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

                                 AV
                                   2

X = ---, V P 1

где:

A — количество картоцида, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

V — общий объем раствора, мл; 2

V — объем аликвоты, отобранной для хроматографирования, мл (при 1

нанесении всей пробы V  = V );
                      1    2

P — навеска пробы или объем анализируемой пробы воды, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдать требования техники безопасности, установленные для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и метиловым спиртом.

---