Методические указания по определению бета-экзотоксина в препаратах битоксибациллина

(утв. Минздравом СССР 30.03.1981 № 2353-81)

30 марта 1981 г. № 2353-81

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БЕТА-ЭКЗОТОКСИНА

---

<*> Разработаны Э.Б. Даниловой, Е.Б. Кругляк (ВНИИбакпрепарат); С.Н. Бубенщиковой, В.К. Каграмановой (МГУ).

Краткая характеристика препарата. Битоксибациллин — бактериальный инсектицидный препарат, получаемый микробиологическим путем на основе культуры Bacillus thuringiensis Var. thuringiensis. Препарат предназначен для борьбы с колорадским жуком и хлопковой совкой. В его состав входят спорокристаллический комплекс, бета-экзотоксин, а также остатки среды, наполнитель (каолин) и хлорид натрия. Бета-экзотоксин представляет собой 2-0-(4-0-5-L-дезоксиаденозин-5-ил-D-глюкопиранозил)-4-O-фосфо-D-алларовую кислоту. Молекулярная масса для свободной кислоты бета-экзотоксина 701.

Принцип метода. В основе метода лежит использование анионообменной хроматографии с применением градиента элюции.

Метрологическая характеристика метода. Чувствительность метода позволяет определять 1 мкг и более бета-экзотоксина в пробе. Время анализа 50 мин., время выхода бета-экзотоксина 34 мин. Величина стандартного отклонения не более +/- 4%.

Реактивы и материалы. Анионообменная смола с размером зерен 10 +/- 2 мкм или любой анионообменник, обладающий аналогичными характеристиками. Стандартный образец с известным процентным содержанием бета-экзотоксина. Хлороводородная кислота особой чистоты. Хлорид натрия особой чистоты. Вода дистиллированная деионизационная. Едкий натр особой чистоты. Универсальная индикаторная бумага, pH 1 — 10 («Реагент»). Фильтры «красная лента».

Приготовление рабочих растворов. Раствор а — 600 мг хлорида натрия и 5 мл 1 н хлороводородной кислоты помещают в мерную колбу на 2 л, растворяют в небольшом количестве деионизованной воды и доводят до метки той же водой. Раствор б — 11,7 г хлорида натрия и 10 мл 1 н хлороводородной кислоты помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют в небольшом количестве деионизованной воды и доводят до метки той же водой. Перед использованием растворы дегазируются с помощью водоструйного насоса в течение 10 мин.

Приготовление деионизованной воды. Деионизованную воду получают путем пропускания дистиллированной воды через ионообменную колонку, заполненную смесью катионита и анионита, с последующим контролем кондуктометром, показания которого должны быть 1,5 МОм/см.

Приготовление раствора стандартного образца бета-экзотоксина. Навеску 20 мг стандартного образца с известным содержанием бета-экзотоксина, взятую с точностью до 0,0001 г, растворяют в 5 мл деионизованной воды. Из этого раствора готовят растворы для калибровки колонки, делая разведения его в 2, 4 и 8 раз. Готовые растворы до использования хранят в холодильнике. Срок хранения не более недели.

Приборы и посуда. Жидкостный хроматограф высокого давления. Микрошприцы на 10 и 100 мкл для жидкостной хроматографии. Весы аналитические. Водоструйный насос. Колбы мерные на 1 и 2 л; конические на 100 мл. Воронки химические; пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл. Стеклянные фильтры № 3 или 4. Стаканы химические на 100 мл. Пробирки химические. Пробки резиновые.

Подготовка к определению. Подготовка колонки. Анионообменную -

смолу  типа  2632  переводят  в  хлор-форму (Cl ). Для этого смолу
помещают  в  химический  стакан  на  100  мл и заливают 10-кратным
(объем/объем)  количеством 1 н  раствора NaOH на 30 мин. Суспензию
помещают  на  стеклянный  фильтр N 3 или 4 и на фильтре под слабым
вакуумом  промывают  деионизованной  водой до pH, равного pH воды,
контролируя   с   помощью  индикаторной  бумаги.  Суспензию  вновь
переносят  в  химический  стакан  и  заливают  1 н  HCl на 30 мин.
Промывку  водой  до  pH  воды  проводят,  как  описано выше. Такую

обработку смолы проводят дважды.

Подготовленную суспензию разбавляют раствором а в соотношении по объему 1:1 и дегазируют. Полученной суспензией смолы заполняют термостатированную (50 °C) колонку размером 1,6 x 150 мм и проводят упаковку ее при скорости потока раствора а 1 мл/мин. в течение 30 мин. Колонка считается готовой к работе, если перо самописца устойчиво выписывает базовую линию.

Регенерация колонки. После каждого анализа колонку регенерируют последовательным промыванием в течение 10 мин. сначала раствором б, затем а. Показателем готовности колонки служит устойчивая базовая линия.

Срок годности колонки составляет 50 — 70 анализов. Градуируют колонку после каждой новой упаковки ее. Отработанные партии смолы собирают и затем обрабатывают так, как указано выше.

Градуировка колонки. Хроматографический процесс проводят при следующем режиме: колонка термостатирована при 50 °C; скорость элюции 18 мл/ч; элюция проходит в градиенте концентраций растворов а и б; детектирование бета-экзотоксина осуществляется при длине волны 260 нм; время удерживания бета-экзотоксина 34 мин.

При указанном режиме проводят по 5 анализов каждого из полученных разведений, включая исходный раствор стандартного образца. Для этого в колонку вносят микрошприцем такое количество раствора, чтобы в нем содержалось 20 — 30 мкг бета-экзотоксина (рассчитывается).

Ход анализа. Подготовка образца битоксибациллина к анализу. Навеску битоксибациллина 0,5 г, взятую с точностью до 0,0001 г, заливают 5 мл деионизованной воды и, периодически встряхивая, выдерживают 30 мин. Фильтруют и осадок промывают 5 мл деионизованной воды. Фильтраты объединяют, осадок выбрасывают.

Определение бета-экзотоксина в водном растворе битоксибациллина. Подготовленный водный экстракт (10 мкл) вносят в хроматографическую колонку с помощью микрошприца. Анализ проводят при условиях, указанных выше. В случае получения «зашкаленного» пика бета-экзотоксина анализ повторяют, вносят меньшее количество испытуемого раствора.

Построение градуировочной кривой. На основе данных, полученных при градуировке колонки, строят градуировочную кривую, откладывая на оси абсцисс усредненную площадь пика каждого разведения, а на оси ординат — соответствующее расчетное количество внесенного бета-экзотоксина. При концентрации бета-экзотоксина в наносимом образце от 1 до 100 мкг градуировочная кривая линейна.

Расчет градуировочного коэффициента. Градуировочный коэффициент (K, мкл/кв. мм) определяют по формуле:

                              C

K = -, S

где:

C — количество экзотоксина (расчетное), внесенное в колонку, мкг;

S — площадь пика, кв. мм, которую вычисляют по формуле:

                            W

S = — x H, 2

где:

H — высота пика, мм;

W / 2 — ширина пика на половине высоты, мм.

Расчет содержания бета-экзотоксина в битоксибациллине. Содержание бета-экзотоксина (C, %) вычисляют по формуле:

                            100SK

C = -----, A

где:

S — площадь пика (см. формулу (2));

K — градуировочный коэффициент (см. формулу (1)), мкл/кв. мм;

---