Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах
(утв. Минздравом СССР 10.12.1980 № 2273-80)
Внимание
Документ утратил силу на территории Российской Федерации в связи с изданием Постановления Минздрава РФ от 19.04.2001 № 10.
Утверждаю
Заместитель начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Министерства
здравоохранения СССР
А. И. Заиченко
10 декабря 1980 г. № 2273-80
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Разработаны в лаборатории энзимологии питания Института питания АМН СССР.
Среди особо опасных контаминантов пищевых продуктов, встречающихся в естественных условиях, выделяют группу микотоксинов — вторичных метаболитов микроскопических грибов, отличающихся высокой токсичностью, а в ряде случаев обладающих мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами. В настоящее время известно более 240 видов различных плесневых грибов, которые продуцируют около 100 токсических соединений, являющихся причиной алиментарных микотоксикозов человека и животных.
Высокий интерес специалистов в области гигиены питания к проблеме микотоксинов обусловлен, во-первых, бесспорным доказательством их реальной опасности для здоровья человека; во-вторых, чрезвычайно широкой распространенностью, и, в-третьих, весьма внушительными размерами наносимого ими экономического ущерба.
Среди микотоксинов своими токсическими и канцерогенными свойствами, а также широкой распространенностью выделяются афлатоксины, продуцируемые микроскопическими грибами из рода Aspergillus.
Центральным звеном системы профилактики афлатоксикозов является организация контроля за загрязнением пищевых продуктов афлатоксинами, в цели которого входят, во-первых, установление исходного уровня контаминации ими пищевых продуктов и выявление изменения этого уровня во времени; во-вторых, определение и подтверждение эффективности мероприятий по снижению контаминации афлатоксинами пищевых продуктов; в-третьих, обеспечение постоянной проверки степени контаминации, не допуская превышения установленных предельно допустимых концентраций (ПДК).
Министерством здравоохранения СССР утверждены временные ПДК для афлатоксина B во всех пищевых продуктах на уровне 5 мкг/кг, а для
1
афлатоксина M (в молоке и молочных продуктах) — 0,5 мкг/кг. 1
Афлатоксины — кристаллические вещества белого цвета, они относительно стабильны к действию тепла и не разрушаются в условиях пастеризации и кулинарной обработки пищевых продуктов. Афлатоксины разлагаются под действием солнечного и УФ-света, а также щелочей и окислителей. Они хорошо растворимы в диметилсульфоксиде, ацетонитриле, ацетоне, спиртах, хлороформе и хлористом метилене, умеренно растворимы в воде (около 20 мг в 1 литре) и практически нерастворимы в гексане, диэтиловом эфире и петролейном эфире. Стандарты афлатоксинов хранят при температуре ниже 0° в виде растворов в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) или хлороформе.
Афлатоксины могут быть обнаружены в зерновых, зернобобовых, арахисе и других орехах, семенах хлопчатника, кофе, какао, кормах сельскохозяйственных животных, а также в некоторых продуктах животного происхождения, в частности в молоке и молочных продуктах. В большинстве случаев обнаруживается наиболее токсичный из основных афлатоксинов - афлатоксин B . Афлатоксины B , G и G менее токсичны, встречаются реже и в 1 2 1 2
меньших концентрациях.
Большинство химических методов анализа афлатоксинов основано на измерении флуоресценции этих соединений в длинноволновом УФ-свете (максимум
возбуждения 360 - 365 нм). Афлатоксины B и B обладают синей
1 2
флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм), афлатоксины G и G -
1 2
сине-зеленой флуоресценцией (максимум эмиссии 450 нм). При попадании
афлатоксина B в рационы молочных коров с молоком может экскретироваться
1
афлатоксин M , обладающий синей флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм). 1
Флуоресцентные методы анализа имеют высокую чувствительность и позволяют обнаруживать афлатоксины в пределах до 0,5 нанограмм. В то же время, эти
методы недостаточно специфичны. Это связано с тем, что в экстрактах пищевых
продуктов могут содержаться вещества, близкие к афлатоксинам по флуоресцентным и хроматографическим свойствам, которые могут быть ошибочно приняты за афлатоксин. В связи с этим необходимы предварительная очистка
экстракта и проведение тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов.
Настоящие рекомендации предназначены для использования лабораториями санитарно-эпидемиологических станций и институтов гигиенического профиля при определении содержания афлатоксинов в различных пищевых продуктах, включая молоко и молочные продукты. Метод позволяет надежно обнаружить афлатоксины B и G на уровне 1 - 2 мкг/кг, афлатоксины B - G на уровне 1 1 2 2 0,5 - 1 мкг/кг и афлатоксин M на уровне 0,5 - 1 мкг/кг. Применение двух
1
тестов, подтверждающих наличие афлатоксинов, повышает достоверность результатов анализа. В основе количественного определения лежит визуальное сравнение интенсивности флуоресценции пятен афлатоксинов образца с интенсивностью флуоресценции пятен стандартов афлатоксинов при двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Относительное стандартное отклонение при визуальном определении составляет 0,3 - 0,5. Продолжительность определения
3 — 3,5 часа.
Метод включает следующие стадии:
- экстракцию афлатоксинов из образца смесью ацетон-вода;
- очистку экстракта от белков, липидов и пигментов;
- очистку, разделение и количественное определение афлатоксинов с помощью двумерной ТСХ;
- проведение подтверждающих тестов.
Отбор проб производится по ГОСТ 12430-66 (Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе).
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
1. Мельница лабораторная (типа ЭМ-3А) или кофемолка ЭКМ-3У.
2. Весы технические по ГОСТ 19491-74.
3. Аппарат для встряхивания проб АВУ-6С по ТУ-64-1-2451-78.
4. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлабприбор»).
5. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.
6. Баня водяная с электронагревателем.
7. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833), МРТУ 64-1-1080-63, или диагностическая лампа ОЛД-41.
8. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.
9. Камеры для ТСХ с притертыми крышками, например стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода «Дружная горка».
10. Пластины для ТСХ «Силуфол» размером 15 x 15 см, ЧССР.
11. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100 — 250 микрон (силикагель Л, ЧССР).
12. Распылитель стеклянный с грушей.
13. Цилиндры мерные на 100, 250 и 500 мл.
14. Колбы плоскодонные конические на 500 и 1000 мл и круглодонные на 250 мл с НШ 29 и притертой пробкой.
15. Колбы грушевидные с НШ 14,5 на 90 — 100 мл (см. рис. 1 — здесь и далее рисунки не приводятся).
17. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-66.
18. Колбы мерные на 100 мл по ГОСТ 1770-74.
19. Воронки химические диаметром 150 мм по ГОСТ 8613-75.
20. Делительные воронки на 250 или 500 мл по ГОСТ 8613-75.
21. Колбы плоскодонные на 100, 250 и 500 мл по ТУ 48-52.
22. Колонка стеклянная хроматографическая 300 x 15 мм (см. рис. 2).
23. <a id="p100042"></a>Афлатоксин B или смесь афлатоксинов B , B , G и G .
1 1 2 1 2
24. <a id="p100043"></a>Афлатоксин M .
1
26. Гексан по ТУ 6-09-3375-73.
28. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.
29. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 «ХЧ».
30. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52.
32. Кислота серная по ГОСТ 4204-77.
33. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29.
34. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67.
35. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, прокаленный.
36. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66.
37. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67.
38. Йод кристаллический по ГОСТ 4159-64.
I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ B , B , G и G В РАЗЛИЧНЫХ 1 2 1 2
ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
I.1. ЭКСТРАКЦИЯ
Пробу продукта измельчают в течение 2 мин. в кофемолке (образцы с высоким содержанием жира: арахис, какао-бобы, орехи, семена масличных целесообразно перед измельчением замораживать (сухой лед, жидкий азот и др.)). Берут навеску 25 г измельченного продукта в плоскодонную коническую колбу на 250 или 500 мл, тщательно перемешивают с 25 мл 10-процентного раствора хлористого натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 50 мл фильтрата.
I.2. ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА
К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15-процентного раствора уксуснокислого свинца и 30 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 мин. в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 мл фильтрата. Переносят в делительную воронку, добавляют 40 мл гексана, встряхивают и после разделения слоев отделяют нижний водно-ацетоновый слой. Верхний гексановый слой отбрасывают. К водно-ацетоновому слою добавляют 30 мл гексана, встряхивают в делительной воронке, верхний гексановый слой отбрасывают. К водно-ацетоновому раствору добавляют 40 мл хлороформа, встряхивают в делительной воронке. После разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют, а к верхнему водно-ацетоновому слою добавляют 30 мл хлороформа и 15 мл ацетона. После встряхивания и разделения слоев нижний хлороформный слой отделяют. Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 100 мл с притертой пробкой, добавляют 5 — 7 г безводного сернокислого натрия, встряхивают и оставляют на 30 мин. в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты, помещенный в стеклянную химическую воронку, в грушевидную колбу на 90 — 100 мл с отростком (см. рис. 1). Плоскодонную колбу с сернокислым натрием споласкивают 5 — 10 мл хлороформа и отфильтровывают в ту же грушевидную колбу. На цилиндрическом отростке должна быть проведена метка на уровне 100 мкл, для этого колбу калибруют с помощью микропипетки на 0,1 мл. Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе в вакууме водоструйного насоса при температуре бани не выше 50° досуха, вещество смывают со стенок хлороформом в калиброванный отросток до метки 100 мкл. Полученный раствор используют для определения содержания афлатоксинов с помощью ТСХ <*> (раствор А).
<*> При анализе некоторых продуктов хлороформный экстракт может содержать много жировых веществ. Это затрудняет нанесение экстракта на ТСХ-пластинку ввиду расплывания жирового пятна на старте, перегрузки пластинки и ухудшает разделение афлатоксинов. В этом случае целесообразно перед проведением ТСХ дополнительно очистить экстракт на хроматографической колонке с силикагелем (см. рис. 2). На дно колонки помещают маленький комочек ваты, затем безводный сернокислый натрий (толщина слоя 3 — 4 мм), наливают суспензию силикагеля в хлороформе (толщина слоя силикагеля около 20 мм) и сверху насыпают слой сернокислого натрия (15 — 20 мм). В колонку наливают 10 мл хлороформа, дают хлороформу стечь. Когда уровень хлороформа достигнет верхней границы сернокислого натрия, на колонку наносят раствор экстракта в 100 мкл хлороформа, колбу из-под экстракта ополаскивают 2 — 3 мл хлороформа и наносят на ту же колонку. Когда уровень раствора экстракта коснется слоя сернокислого натрия, в колонку наливают 50 мл смеси хлороформ-ацетон (9:1). Хлороформ-ацетоновый раствор собирают в грушевидную колбу с отростком на 90 — 100 мл (см. рис. 1) и упаривают раствор на ротационном испарителе досуха. Вещество смывают со стенок хлороформом в калиброванный отросток до метки 100 мкл. Далее полученный раствор анализируют с помощью ТСХ (раствор А).
I.3. РАЗДЕЛЕНИЕ И ОБНАРУЖЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ
I.3.1. Приготовление эталонного и рабочего раствора стандартов
Эталонный раствор смеси афлатоксинов готовят следующим образом: навески
1,0 мг кристаллического афлатоксина B , 1,0 мг афлатоксина G , 0,5 мг
1 1
афлатоксина B и 0,5 мг афлатоксина G помещают в мерную колбу на 100 мл и
2 2
доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (98:2). Концентрация
афлатоксинов B и G в эталонном растворе составляет 10 мкг/мл, а
2 1
афлатоксинов B и G - 5 мкг/мл.
2 2
Рабочий раствор готовят разбавлением одного мл эталонного раствора в 9
мл хлороформа. Концентрация рабочего раствора 1 мкг/мл для афлатоксинов
B и G и 0,5 мкг/мл для афлатоксинов B и G .
1 1 2 2
При отсутствии стандартов афлатоксинов B , G и G можно в качестве
2 1 2
эталонного раствора использовать раствор афлатоксина B с концентрацией 10
1
мкг/мл, а в качестве рабочего раствора — раствор афлатоксина B с 1 концентрацией 1 мкг/мл.
Все растворы стандартов хранят в холодильнике при температуре ниже 0°. Срок годности эталонного раствора до одного года, а рабочего раствора до 4 — 5 месяцев. При хранении необходимо следить за тем, чтобы объем растворов не уменьшался за счет испарения растворителя.
I.3.2. Очистка и разделение афлатоксинов
Пластинку «Силуфол» размером 15 x 15 см размечают тонкими карандашными линиями (см. рис. 3а). В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца или стеклянного калиброванного капилляра 20 мкл раствора экстракта — раствора А. Наносить раствор следует постепенно, не допуская размывания стартового пятна более 4 — 5 мм. В правом верхнем и левом нижнем углах на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят по 2 мкл рабочего раствора стандартов афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ, в которую предварительно наливают смесь бензол-эфир-гексан (1:2:1), уровень растворителя должен быть на 1 см ниже нанесенных пятен. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 мин. в темноте. Высушенную пластинку поворачивают на 90° по часовой стрелке и помещают в камеру для ТСХ, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-бензол (9:1:1) <*>. Проводят развитие пластинки во 2-ом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают и сушат 5 мин. в темноте. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в пищевом продукте.
<*> При развитии ТСХ-пластинки во 2-ом направлении пятно афлатоксина B 1
должно проходить примерно половину расстояния, пройденного фронтом растворителя. Если подвижность афлатоксина B ниже, то следует увеличить
1
количество ацетона в смеси хлороформ-ацетон-бензол.
I.4. ТЕСТЫ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ НАЛИЧИЕ АФЛАТОКСИНОВ В ПИЩЕВОМ ПРОДУКТЕ
Стеклянную пластинку 20 x 20 см заливают 5 — 10-процентным раствором йода в эфире, после испарения эфира пластинку с тонким слоем йода помещают над ТСХ-пластинкой на расстоянии 0,5 — 1,0 см и подвергают ее воздействию паров йода в течение 20 — 30 сек. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в пищевом продукте.
ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции
стандартов афлатоксинов изменяется с синего (B , B ) или сине-зеленого (G ,
1 2 1 G ) на желтый, а цвет флуоресценции пятен экстракта не меняется на желтый,
2 то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также меняется на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пищевом продукте.
При проведении операций подтверждения ориентировочно оценивают количество афлатоксина в пятне экстракта путем сравнения интенсивности его флуоресценции со стандартом.
I.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ
Если в экстракте обнаружены афлатоксины, то необходимо провести количественное определение. Пластинку «Силуфол» размером 15 x 15 см размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 3б. В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца 20 мкл экстракта (раствор А). В левом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 2 мкл рабочего раствора стандартов афлатоксинов. В правом верхнем углу на расстоянии 1, 2 и 3 см от верхнего края пластинки и 1,5 см от правого края пластинки наносят соответственно 2,0, 4,0 и 6,0 мкл раствора стандартов афлатоксинов. ТСХ проводят в условиях, аналогичных пункту 1.3.2. После ТСХ пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов афлатоксинов на пластинке с интенсивностью флуоресценции соответствующих пятен экстракта, определяют количество нанограмм (нг) афлатоксина в пятне экстракта.
Содержание афлатоксинов в продукте рассчитывают по формуле:
V x V x V x m
1 3 5
V x V x V x M
2 4 6
где:
C — концентрация афлатоксинов в пищевом продукте в мкг/кг;
V — объем водно-ацетоновой смеси в мл (125 мл); 1
V — объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа, в мл (50 2 мл);
V — объем водно-ацетонового фильтрата и раствора уксуснокислого свинца 3 в мл (100 мл);
V — объем фильтрата после очистки уксуснокислым свинцом в мл (80 мл); 4
V — объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед ТСХ 5 (раствор А) в мкл (100 мкл);
V — объем раствора экстракта, наносимый на пластинку, в мкл (20 мкл); 6
m — количество афлатоксина в пятне экстракта в нг;
M — навеска продукта, взятая для анализа, в г (25 г).
При приведенных в скобках объемах и навесках в 25 г формула содержания афлатоксинов выражается следующим образом:
Если интенсивность флуоресценции афлатоксинов в пятне экстракта выше интенсивности флуоресценции пятен стандартов, соответствующих 6,0 мкл рабочего раствора (6 нг афлатоксинов B и G и 3 нг афлатоксинов B и G ), 1 1 2 2 то на пластинку следует наносить меньший объем экстракта V , например 10
6
или 5 мкл. Если и в этом случае интенсивность флуоресценции пятен экстракта выше, чем у стандартов, то следует разбавить хлороформный раствор экстракта (раствор А), т.е. увеличить объем V до 200 и более мкл. 5
II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА M В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ 1
II.1. ЭКСТРАКЦИЯ
Для анализа берут 100 мл жидкого молока или 10 г сухого молока, или 50 г масла, или 50 г сыра. Навеску масла растапливают и переносят в колбу для экстракции, сыр перед взятием навески измельчают с помощью терки. Анализируемый образец помещают в плоскодонную коническую колбу на 500 мл с притертой пробкой и добавляют водный раствор лимонной кислоты и хлористого натрия согласно таблице.
| Продукт | Вес образца в г или объем в мл | Добавляемое количество воды в мл | Добавляемое количество лимонной кислоты и хлористого натрия в г |
|---|---|---|---|
| Молоко жидкое Молоко сухое Сыр Масло | 100 мл 10 г 50 г 50 г | 10 100 80 90 | 0,48 г лимонной кислоты и 4,0 г хлористого натрия во всех случаях предварительно растворяют в воде, добавляемой к анализируемому продукту |
К полученной смеси добавляют 300 мл ацетона и встряхивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр на 500 мл, отбирают 275 мл фильтрата.
II.2. ОЧИСТКА ЭКСТРАКТА
Экстракт переносят в плоскодонную коническую колбу на 1000 мл, добавляют 20 мл 15-процентного водного раствора уксуснокислого свинца и 200 мл воды, встряхивают и оставляют в темноте на 10 — 15 мин. Затем добавляют 10 мл насыщенного раствора сернокислого натрия, встряхивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр на 500 мл. Отбирают 350 мл фильтрата и переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл гексана и встряхивают. После разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, к нижнему водно-ацетоновому слою добавляют 50 мл гексана, встряхивают в делительной воронке. После разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, к нижнему водно-ацетоновому слою добавляют 100 мл хлороформа, встряхивают в делительной воронке. Нижний хлороформный слой отделяют, водно-ацетоновый слой повторно экстрагируют 50 мл хлороформа в делительной воронке. Объединенные хлороформные экстракты сушат безводным сернокислым натрием (5 — 10 г) в течение 30 мин. Высушенный экстракт фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 250 мл с НШ 29. Упаривают на ротационном испарителе до объема 10 — 20 мл. Содержимое колбы переносят в грушевидную колбу на 90 — 100 мл с калиброванным отростком (см. рис. 1) и упаривают досуха на ротационном испарителе. Вещество смывают со стенок колбы в калиброванный отросток хлороформом до отметки 100 мкл.
II.3. ОБНАРУЖЕНИЕ АФЛАТОКСИНА M 1
II.3.1. Приготовление рабочего раствора стандарта
Афлатоксин M поставляется в ампулах по 0,01 мг. Ампулу вскрывают и 1
растворяют содержимое ампулы в 2 мл смеси бензол-ацетонитрил (9:1), переносят в мерную колбу на 10 мл, трижды промывают ампулу по 1 мл той же смеси, промывные растворы переносят в ту же мерную колбу. Доводят объем раствора в мерной колбе до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Полученный раствор содержит 1 мкг афлатоксина M в 1 мл и используется для
1
ТСХ как рабочий раствор.
II.3.2. Очистка и обнаружение афлатоксина M 1
ТСХ-очистку и обнаружение афлатоксина M проводят с помощью двумерной 1 хроматографии на пластинках «Силуфол» аналогично пункту 1.3.2. В качестве
растворителей для развития хроматограмм используют в 1-ом направлении - гексан-эфир (1:2), во 2-ом направлении - смесь
хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5).
II.4. ТЕСТЫ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ НАЛИЧИЕ АФЛАТОКСИНА M В ПРОДУКТЕ 1
Тесты, подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте, проводят 1 аналогично пункту 1.4.
II.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА M 1
ТСХ-определение содержания афлатоксина M проводят аналогично пункту 1 1.5. В качестве растворителей для развития хроматограмм используют: в 1-ом
направлении - смесь гексан-эфир (1:2), во 2-ом направлении - хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт (85:10:5). После развития пластинки в обоих направлениях ее рассматривают в длинноволновом УФ-свете и сравнивают интенсивность флуоресценции афлатоксина M в экстракте с интенсивностью
1
флуоресценции пятен стандарта, определяя количество нг афлатоксина M в 1 пятне экстракта.
Содержание афлатоксина M в продукте рассчитывают по формуле: 1
V x V x V x m
1 3 5
V x V x V x M
2 4 6
где:
C — концентрация афлатоксина M в мкг/кг или в мкг/л; 1
V — объем водно-ацетоновой смеси в мл (410 мл для жидкого молока, 1 400 мл для сухого молока, 380 мл для сыра, 390 мл для масла);
V — объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа, в мл (275 2 мл);
V — объем водно-ацетонового фильтрата, раствора уксуснокислого свинца, 3 раствора сернокислого натрия и воды (275 + 20 + 10 + 200 = 505 мл);
V — объем фильтрата после очистки уксуснокислым свинцом в мл (350 мл); 4
V — объем раствора экстракта перед ТСХ в мкл (100 мкл); 5
V — объем экстракта, наносимый на ТСХ-пластинку, в мкл (20 мкл); 6
m — количество афлатоксина M в пятне экстракта в нг; 1
M — навеска продукта, взятого для анализа, в г или мл (100 мл для жидкого молока, 10 г для сухого молока, 50 г для масла, 50 г для сыра).
При приведенных в скобках величинах формула содержания афлатоксина M 1 выражается следующим образом:
C для жидкого молока = 0,11 x m мкг/л
C для сухого молока = 1,05 x m мкг/кг C для сыра = 0,20 x m мкг/кг C для масла = 0,20 x m мкг/кг. Если интенсивность флуоресценции афлатоксина M в пятне экстракта выше,
1
чем интенсивность флуоресценции пятен стандарта афлатоксина M , то 1 поступают так, как это описано в пункте 1.5.