Методические указания по определению метилнитрофоса и фенитрооксона в зерне и продуктах переработки зерна хроматоэнзимным и газохроматографическим методом
(утв. Минздравом СССР 28.01.1980 № 2132-80)
28 января 1980 г. № 2132-80
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТИЛНИТРОФОСА И ФЕНИТРООКСОНА В ЗЕРНЕ И ПРОДУКТАХ ПЕРЕРАБОТКИ ЗЕРНА ХРОМАТОЭНЗИМНЫМ И ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.
Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.
1. Краткая характеристика пестицидов
Метилнитрофос — O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-тиофосфат.
CH
S ____ 3
|| // \\
(CH O) P-O- NO C H O NPS
3 2 \____/ 2 9 12 5
──── Мол. масса 277,2.
Синонимы: метатион, сумитион, фенитротион, фолитион, польвадофос, вататион, динатион, новотион, препарат 56600, Байер 41831, агратион-20.
Химически чистый препарат - светлая жидкость со слабым неприятным запахом. Т - 95 °С при 0,01 мм рт. ст.; плотность 1,308; коэффициент
кип
-6
преломления 1,5505; давление паров при 20 °С - 6 х 10 мм рт. ст.; летучесть 0,82 мг/куб. м при 20 °С; 2,33 мг/куб. м при 30 °С; 6,11 мг/куб. м при 40 °С. Растворимость в воде около 30 мг/л, хорошо растворяется в
большинстве органических растворителей.
Препарат гидролизуется в щелочной среде (в 0,1 н NaOH при 30 °С период полураспада 30 минут). При нагревании выше 100 °С изомеризуется и может разлагаться со взрывом. Хранить препарат необходимо в эмалированной или стеклянной таре, железо способствует разложению препарата. Выпускается в форме 30-процентного к.э. и 50-процентного к.э.
ПДК в воздухе рабочей зоны 0,1 мг/куб. м. ДОК в полевых культурах утверждены 0,1 мг/кг. В настоящее время рекомендованы ДОК в зерне 1 мг/кг, муке 0,3 мг/кг, хлебе 0,1 мг/кг. Применяется в качестве контактного инсектицида и акарицида для борьбы с вредителями овощных, технических, плодовых культур, обработки незагруженных зернохранилищ, рекомендован для обработки зерна.
Фенитрооксон — O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-фосфат — токсический метаболит метилнитрофоса.
CH
O ____/ 3 || // \\ C H O NP (CH O) P-O- NO 9 12 6 3 2 \____/ 2 Относ. мол. масса 261,1.
В чистом виде — светлая жидкость со слабым неприятным запахом.
2. Методика определения метилнитрофоса и фенитрооксона в зерне, муке, хлебе, отрубях хроматоэнзимным и газохроматографическим методом
2.1 Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на извлечении метилнитрофоса (МНФ) и его токсического метаболита фенитрооксона из зерна, муки, хлеба, отрубей смесью органических растворителей (н-гексан — диэтиловый эфир, 7:3), очистке охлажденным ацетоном и параллельном определении их в аликвотных частях пробы методом газожидкостной хроматографии и хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением.
Газожидкостной хроматографией (ГЖХ) определение проводится на хроматографе марки «Цвет» с термоионным детектором (ТИД) с использованием в
качестве неподвижной фазы 5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS, газа-носителя - азота. Этот метод позволяет раздельно определять метилнитрофос (t 3,8) и
уд.
фенитрооксон (t 3 минуты); чувствительность определения каждого — 0,001 уд. мкг (т.е. 0,02 мг/кг при навеске муки, хлеба, отрубей 20 г). Количественное
определение проводится по высоте пиков. Определению фенитрооксона мешает присутствие метафоса (t 3,16 мин.). Для идентификации в этом случае
уд.
используется хроматоэнзимный метод.
Тонкослойно-хроматографическое определение с энзимным проявлением (ТСХЭ) основано на разделении соединений в тонком слое силикагеля КСК с подвижной фазой н-гексан - ацетон 4:1 и обнаружении их по способности угнетать холинэстеразу (ХЭ). При этом идентификация их проводится как по величинам R (R МНФ 0,48; фенитрооксона 0,28), так и по условиям f f обработки. Так, обнаружение фенитрооксона, являющегося Р = 0 аналогом метилнитрофоса, может быть проведено непосредственно после обработки пластинки субстратом, а для обнаружения МНФ необходима предварительная активация пестицида на пластинке бромом. Этот метод позволяет раздельно определять МНФ и фенитрооксон; чувствительность определения МНФ без активации 0,10 - 0,15 мкг, а с активацией бромом - 0,001 мкг (0,02 мг/кг); чувствительность определения фенитрооксона без активации 0,001 мкг (0,02 мг/кг). Определению метилнитрофоса мешает метафос (R метафоса 0,47).
f
2.1.2 Метрологическая характеристика метода:
- диапазон определяемых концентраций 0,5 — 50 мкг МНФ и фенитрооксона в анализируемой пробе;
- предел обнаружения МНФ и фенитрооксона 0,001 мкг (0,025 мг/кг);
- размах варьирования для МНФ и фенитрооксона 80 — 85% методом ГЖХ и 75 — 105% — методом ТСХЭ;
- среднее значение определения стандартных количеств МНФ и фенитрооксона 81% (ГЖХ) и 89% (ТСХЭ);
- стандартное отклонение при ГЖХ — 4,2%, при ТСХЭ — 8,3%;
- относительное стандартное отклонение при ГЖХ — 0,05, при ТСХЭ — 0,09;
- доверительный интервал среднего при р = 0,95 и n = 5 для МНФ и фенитрооксона методом ГЖХ 81 +/- 4,9, методом ТСХЭ — 89 +/- 9,8%.
Сочетание указанных методов позволяет идентифицировать метилнитрофос и фенитрооксон в присутствии близкого к ним по химической структуре пестицида метафоса.
2.2 Реактивы и растворы
Основной стандартный раствор пестицидов (А) — смесь стандартных растворов метилнитрофоса и фенитрооксона по 100 мкг/мл каждого (по 10 мг каждого вещества растворяют в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл).
Рабочие стандартные растворы готовят разбавлением основного раствора «А».
Раствор «Б» — 0,5 мл раствора «А» доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание каждого вещества составляет 0,5 мкг/мл).
Раствор «В» — 5 мл раствора «Б» доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание каждого вещества 0,1 мкг/мл).
2.2.1 Для экстракции
Фильтры бумажные (красная лента).
2.2.2 К методу ГЖХ
Стационарная фаза — метилсиликоновый полимер SE-30 в количестве 5% на хроматоне N-AW-ДМСS, 100 — 120 меш.
Азот особой чистоты (содержание O не должно превышать 0,003%). 2
2.2.3 К методу ТСХ с энзимным проявлением
Силикагель КСК, раздробленный и просеянный через сито, 100 меш.
Кальций сернокислый (CaSO х 2H O), прокаленный в течение 6 часов при 4 2
160 °С.
Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ-711-57-69.
Калий железосинеродистый — 0,05 М раствор (1,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
Калий железистосинеродистый — 0,05 М раствор (2,110 г — в 100 мл H O). 2
Буферный раствор pH = 8,69 — готовят раствор смеси ортофосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с pH = 8,69 к 100 мл указанного раствора прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,800 г NaOH в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл.
Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.
Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл дистиллированной воды (pH = 8,69), 2 мл раствора железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На пластинку расходуется 3 — 4 мл смеси.
2.3 Приборы и посуда
2.3.1 Для экстракции
Колбы конические плоскодонные с пробками емкостью 250 и 100 мл.
Ротационный испаритель с набором колб емкостью 50 и 100 мл.
Пробирки мерные с пробками емкостью 5 — 10 мл.
2.3.2 Для ГЖХ
Хроматограф марки «Цвет» с термоионным детектором.
Баллон с азотом особой чистоты.
Колонки стеклянные, длина — 1 м, внутренний диаметр — 3 мм.
2.3.3 Для ТСХЭ
Стеклянные пластинки размером 9 х 12 см.
Камера для хроматографирования.
Компрессор или баллон с азотом или сжатым воздухом для равномерного мелкодисперсного опрыскивания пластинок.
Мерные колбы емкостью 25 мл, 100 мл.
Микрошприцы на 10 мкл или микропипетки до 0,1 мл для нанесения стандартных растворов и проб.
Термостат СШ-35 с температурой нагрева 37 — 40 °С.
2.4 Подготовка к определению
2.4.1 Подготовка колонок для ГЖХ
Используют готовую фазу SE-30 5% на хроматоне N-AW-ДМСS. Если нет готовой фазы, 0,7 г SE-30 растворяют в небольшом количестве хлористого метилена и приливают в круглодонную колбу со шлифом, в которой находится 14 г носителя (хроматон N-AW-ДМСS), залитого полностью тем же растворителем. Тщательно перемешивают всю массу и выпаривают растворитель на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток подсушивают в сушильном шкафу 4 часа при температуре 80 °С. Приготовленный носитель хранят в склянке с притертой пробкой.
Для заполнения колонки один конец ее закрывают стеклянной ватой, а в другой через воронку засыпают носитель. Заполняют колонку постукиванием, закрывают второй конец тампоном из стеклянной ваты.
2.4.2 Приготовление пластинок для ТСХЭ
Для приготовления 12 пластинок берут 35 г силикагеля КСК, 2 г сернокислого кальция, приготовленного как описано выше, и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течение 18 — 20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.
2.5 Описание определения метилнитрофоса и фенитрооксона в зерне, муке, отрубях, хлебе
2.5.1 Экстракция
Для проведения исследований отбирается средняя проба зерна, муки, отрубей, хлеба весом 1 кг. Из каждой пробы (хлеб измельчают) для анализа методом квартования отбирается три навески по 20 г (из зерна по 50 г). Пробу заливают 50 мл смеси н-гексан — диэтиловой эфир, 7:3, и оставляют на час, периодически встряхивая. Сливают растворитель через фильтр, пробу заливают новой порцией экстрагента и экстрагируют еще час. Объединяют обе порции экстракта, сушат безводным сернокислым натрием в течение 15 мин. и переносят в прибор для отгонки растворителей. Упаривают растворитель до объема ~ 1 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °С, т.к. летучесть МНФ резко увеличивается с повышением температуры. Остатку растворителя дают испариться на воздухе при комнатной температуре. Сухой остаток смывают охлажденным при 0 °С ацетоном и, фильтруя раствор через бумажный фильтр, переносят в мерную пробирку. Оставляют на 15 мин., а затем доводят объем ацетона до 5 мл при комнатной температуре. Из этой пробы проводят определение методом ГЖХ и ТСХЭ.
2.5.2 Метод аналитического определения
2.5.2.1 Газожидкостная хроматография
-10
Условия хроматографирования. Шкала электрометра 2 х 10 А. Скорость движения ленты самописца 200 мм/час. Температура колонки 190 °С, испарителя
- 220 °С. Расход газа: азота 22 — 24 мл/мин.; водорода 15 — 17 мл/мин.; воздуха 24 л/час. Вводимый объем 2 — 5 мкл раствора. Линейность детектирования соблюдается для метилнитрофоса в пределах от 1 до 10 нг, для фенитрооксона — от 0,5 до 6 нг.
Время удерживания препаратов: метилнитрофос 3,8 мин.; фенитрооксон 3 мин.; время удерживания по метафосу: метилнитрофоса 1,2; фенитрооксона 0,95.
Содержание препаратов в пробе вычисляют по формуле:
C х V х H х 1000
V х H х P
а а
где:
X — содержание пестицида в пробе, мг/кг;
C — количество пестицида в стандарте, мкг;
V — объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл; а
V — общий объем экстракта (5 мл), мл;
H — высота пика стандартного раствора, мм; а
P — масса пробы, взятой для анализа, г.
2.5.2.2 Тонкослойная хроматография с энзимным проявлением
С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) по 2 — 3 мм слоя сорбента. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные части. На 1-ю и 3-ю полосы на расстоянии 1,5 см от нижнего края наносят по 10 мкл стандартных растворов «Б» и «В», т.е. по 0,001 мкг и 0,005 мкг действующих веществ, на 2-ю и 4-ю — 2 и 10 мкл соответственно пробы. Пластинку с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, в которую налита смесь н-гексан — ацетон, 4:1, за 30 мин. до хроматографирования.
Когда фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и дают растворителю испариться. Пластинку помещают на 1 мин. в эксикатор, насыщенный парами брома. Затем после удаления избытка брома с пластинки (~ 60 мин.) ее обрабатывают ферментным раствором и инкубируют в
течение 40 — 50 мин. в насыщенном водными парами термостате при температуре
38 °С (для увлажнения в сушильном шкафу ставят чашку Петри с водой). После инкубации пластинки опрыскивают проявляющим раствором и помещают в термостат при 38 °С. Метилнитрофос и фенитрооксон проявляются в течение 10
- 30 мин. в виде белых пятен на голубом фоне, R 0,48 и 0,28 f соответственно, чувствительность обнаружения каждого 0,001 мкг. П-нитрокрезол этим методом не обнаруживается. Фенитрооксон может быть также обнаружен указанным методом, если исключить стадию активации; в этом случае чувствительность обнаружения метилнитрофоса на 4 порядка ниже.
Количественное определение проводят путем сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к нему по величине площадью стандарта. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации соблюдается в пределах от 0,001 мкг до 0,01 мкг. Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:
а х S х V х 1000
2
S х V х P
1 1
где:
а — содержание препарата в стандарте, мкг;
S — площадь пятна стандарта, кв. мм; 1
S — площадь пятна пробы, кв. мм; 2
V — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл; 1
V — общий объем экстракта, мл;
P — масса пробы, взятой для анализа, г.
2.6 Обработка результатов анализа
Обработка результатов анализа, проведенного методом ГЖХ, приведена в п. 2.5.2.1, методом ТСХЭ — в п. 2.5.2.2.
2.7. Настоящие Методические указания разработаны М.А. Клисенко, М.В. Письменной, ВНИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, г. Киев.
3. Требования безопасности
Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами.
4. Литература
Н.Н. Мельников. Химия и технология пестицидов. Изд. «Химия», М., 1974, с. 518.