Методические указания по определению котофора в семенах хлопчатника методом хроматографии в тонком слое
(утв. Минздравом СССР 19.10.1979 № 2092-79)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
19 октября 1979 г. № 2092-79
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОТОФОРА В СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА МЕТОДОМ
ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.
Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.
1. Характеристика анализируемого пестицида
Котофор, 2-этил-тио-4,6-бис-(изопропиламино)-симм-триазин, ГС 16068, санкап.
CH
N / 3
CH -CH -S-/ \\-NH-CH
| 3 2 |
|---|
N N CH
\ // CH 3
│ / 3
NH-CH
\
CH
3
Химически чистый препарат представляет собой белый порошок с температурой плавления 104 — 106 °С. Трудно растворяется в воде (16 мг/л), хорошо — в органических растворителях — хлороформе, ацетоне, метаноле.
Технический препарат котофора представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 80% действующего вещества.
Препарат котофор малотоксичен для теплокровных (для крыс ЛД — 4760 50 мг/кг, для мышей ЛД — 2800 мг/кг), относится к группе веществ умеренно 50 кумулирующих (k — 2,6). кум
ДОК котофора в хлопковом масле — 4,5 мг/кг, в жмыхе — 0,38 мг/кг. ПДК котофора в воде составляет 1,0 мг/л, а при поступлении в организм с водой — 5,0 мг/л.
Как и прочие симм-триазины котофор стоек во внешней среде. В почве и воде он сохраняет свою активность от 10 до 14 месяцев в зависимости от нанесенного количества.
2. Методика определения котофора в семенах хлопчатника методом тонкослойной хроматографии
2.1 Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Методика основана на хроматографировании котофора в тонком слое пластинок «Силуфол» или тонком слое силикагеля КСК в системе н-гексан — ацетон или четыреххлористый углерод — диэтиловый эфир после экстрактации метанолом и очистки экстракта 1 № соляной кислотой.
2.1.2 Метрологическая характеристика методики
Диапазон определяемых концентраций 0,06 мг/кг - 1,0 мг/кг. Предел обнаружения 3 мкг в анализируемой пробе, что соответствует 0,06 мг/кг.
_
Среднее значение определения стандартных количеств С = 84%, число _
параллельных определений n = 5, дисперсия 28,6, стандартное отклонение S = 5,348, величина точного измерения (доверительный интервал) ДЕЛЬТА =
0,95-4
5, относительное стандартное отклонение S = 5,9% (по величине точного z измерения). Среднее значение определения стандартных количеств и доверительный интервал среднего (84 +/- 5%) приведены для 3-х концентраций, находящихся в определяемом диапазоне концентраций (0,06 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг).
Определению остаточных количеств котофора в семенах хлопчатника близкие по строению и области применения пестициды (например, прометрин) не мешают.
2.2 Реактивы и материалы
Метиловый спирт, х.ч., ГОСТ 6995-67.
н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-73.
Хлороформ, ч.д.а., ГОСТ 3160-51.
Углерод четыреххлористый, х.ч., ГОСТ 20288-74.
Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-66.
Силикагель КСК, ГОСТ 3956-76, ТУ 6-09-2523-72.
Кальций сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 3210-66.
Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор, ч.д.а., ТУ 6-09-3719-74.
Серебро азотнокислое, х.ч., ГОСТ 1277-75.
Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 3652-69.
Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-67.
Натр едкий, х.ч., ГОСТ 4328-66.
Фильтры бумажные 11,0 см, ТУ 6-09-1678-72.
Пластинки для хроматографии «Силуфол» (ЧССР).
Вата обезжиренная (гигроскопическая).
Раствор бромфенолового синего в ацетоне — 0,4%.
Водный раствор азотнокислого серебра — 2%.
Водный раствор лимонной кислоты — 4%.
Водный раствор соляной кислоты — 1 н.
Водный раствор едкого натра — 1 н.
Стандартный раствор котофора, х.ч., в хлороформе — 100 мкг/мл.
2.3 Приборы, аппаратура, посуда
Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде, ТУ 64-1-1081-73.
Шкаф сушильный электрический общелабораторного назначения, ТУ 16-531-299-71.
Испаритель ротационный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74.
Баня водяная, ТУ 46-22-608-75.
Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-75.
Воронка делительная на 250 мл, ГОСТ 8613-75.
Воронки простые конусообразные с коротким стеблем № 5, ГОСТ 8613-75, ТУ 25-11-1061-75.
Колбы лабораторные конические на 250 мл, ГОСТ 10394-72.
Колбы лабораторные круглодонные короткогорлые на 100 мл, ГОСТ 10394-72.
Колбы мерные с коническим шлифом на 100 мл, ГОСТ 1770-74.
Пипетки с делениями на 10 мл, ГОСТ 20292-74.
Микропипетки на 0,1 мл с ценой деления 0,001 мл.
Сито лабораторное с диаметром отверстий 2 мм.
Пластинки стеклянные для нанесения тонкого слоя сорбента 90 х 120 мм.
Колбы мерные с коническим шлифом на 1000 мл, ГОСТ 1770-74.
2.4 Подготовка к определению
2.4.1 Приготовление стандартного и других растворов
Приготовление стандартного раствора. 10 мг котофора х.ч. растворяют в 100 мл хлороформа. В 1 мл такого раствора содержится 100 мкг котофора. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 месяца. Химически чистый котофор можно получить из технического препарата. Способ очистки технического препарата, содержащего 80% действующего вещества, заключается в двукратной перекристаллизации из хлороформа. Полнота очистки контролируется по температуре плавления 104 — 106 °С.
Приготовление 1 н раствора соляной кислоты. 86 мл 36-процентной соляной кислоты (d = 1,1789 г/куб. см) доводят в мерной колбе до 1 л дистиллированной водой. Раствор можно приготовить из фиксанала. Хранить в прохладном месте в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 месяца.
Приготовление 1 н раствора едкого натра. 40 г едкого натра растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы едкого натра.
Приготовление 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне. 0,4 г бромфенолового синего растворяют в 125,9 мл ацетона. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 2 недели.
Приготовление 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. 2 г азотнокислого серебра растворяют в 98 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 1 неделя.
Приготовление проявляющего реактива № 1. Смешивают равные объемы 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне и 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. Рекомендуется свежеприготовленная смесь.
Приготовление 4-процентного водного раствора лимонной кислоты (проявляющий реактив № 2). 4 г лимонной кислоты растворяют в 96 мл дистиллированной воды. Хранить в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 1 месяц.
2.4.2 Приготовление хроматографических пластинок
Тщательно промытую содой, хромовой смесью, дистиллированной водой и высушенную стеклянную пластинку 90 х 120 мм протирают этиловым спиртом или диэтиловым эфиром и покрывают сорбционной массой, приготовляемой из 35 г силикагеля КСК, 2 г кальция сернокислого и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель предварительно очищают от примеси. Для чего заливают на 18 — 20 часов разбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят 2 — 3 часа с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 — 6 часов при температуре 130 °С. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш. Хранят в склянке с притертой пробкой.
10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки путем ее покачивания. Сушат пластинки при комнатной температуре 18 — 20 часов. Хранят в эксикаторе.
2.4.3 Условия хроматографирования и способ количественного определения
Пробу и стандартные растворы наносят на хроматографическую пластинку так, чтобы размер пятна не превышал 10 — 12 мм. Центр пятна должен находиться на расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки. Нанесение пробы на пластинку производится с помощью пипеток с оттянутым концом или капилляров. Стандартные растворы наносятся микропипеткой. Пластинки с нанесенными пробами помещаются в хроматографическую камеру, представляющую собой стеклянный сосуд с притертой стеклянной крышкой, либо в эксикатор. Камера содержит смесь растворителей н-гексана и ацетона (10:3) либо четыреххлористого углерода и диэтилового эфира (4:1). Перед хроматографированием камера насыщается парами системы подвижных растворителей в течение 30 минут. После подъема фронта растворителей на высоту 10 см хроматографирование прекращается. В вытяжном шкафу удаляются пары растворителей. Затем обрабатывают хроматографическую пластинку в камере под вытяжным шкафом с помощью пульверизатора проявляющим реактивом № 1. Пластинку подсушивают на воздухе и обрабатывают проявляющим реактивом № 2.
Котофор обнаруживается на пластинках в виде синих пятен со следующими величинами R : f
| Система подвижных растворителей | R f | |
| Силикагель | Силуфол | |
| Гексан + ацетон (10:3) | 0,52 +/- 0,01 | 0,50 +/- 0,01 |
| Четыреххлористый углерод + диэтиловый эфир (4:1) | 0,21 +/- 0,01 | 0,29 +/- 0,01 |
Количество котофора в пробе определяют сравнением размеров и интенсивности окраски пятен пестицида на хроматограммах пробы и стандартного раствора.
2.4.4 Отбор пробы
Отбор пробы производится в соответствии с «Правилами отбора проб для анализа пестицидов», рекомендуемыми специалистами СЭВ. Отобранные пробы семян хлопчатника должны содержаться в сухом месте, в укупоренной защищенной от света (стеклянной или полиэтиленовой) таре.
В процессе подготовки к анализу семена хлопчатника необходимо освободить от волокон ваты, очистить от кожуры и измельчить.
2.5 Проведение определения
50 г измельченных семян хлопчатника помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают метиловым спиртом до покрытия пробы и оставляют на ночь. Препарат трижды экстрагируют метиловым спиртом порциями по 75 мл. Метаноловые экстракты объединяют и сливают их через слой безводного сернокислого натрия. Упаривают метаноловый экстракт на водяной бане до небольшого объема (0,1 — 0,2 мл). Остатку метилового спирта дают испариться полностью при комнатной температуре. К сухому остатку прибавляют 5 мл 1 н раствора соляной кислоты, тщательно очищая стенки колбы стеклянной палочкой. Смывы сливают в делительную воронку через слой ваты. Колбу еще трижды ополаскивают 1 н раствором соляной кислоты по 5 мл и сливают в ту же делительную воронку. Водный раствор котофора в ионизированной форме дважды промывают в делительной воронке хлороформом и органические вытяжки отбрасывают. Затем в делительную воронку приливают 1 н раствор едкого натра до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге). После этого в воронку прибавляют равный объем хлороформа, предварительно насыщенного водой и встряхивают 1 — 2 минуты. Хлороформный экстракт сливают через воронку с безводным сернокислым натрием в колбу для отгонки растворителя. Экстракцию хлороформом повторяют трижды, сливая хлороформ в ту же колбу. Хлороформ отгоняют на водяной бане либо на приборе для отгонки растворителя до небольшого объема (0,1 — 0,2 мл). Этот объем наносят на хроматографическую пластинку, после чего еще трижды ополаскивают колбу хлороформом (небольшими объемами), смывы также наносят на пластинку в центр пятна.
Затем пластинка (силикагелевая или «Силуфол») помещается в хроматографическую камеру. Далее определение проводят в условиях, изложенных в подразделе 2.4.3.
2.6 Обработка результатов
Содержание остатков котофора в анализируемой пробе вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Допустимое расхождение результатов параллельных определений не должно превышать 2,8 х S.
Расчет содержания остаточных количеств котофора проводят по формуле:
А
Х — содержание котофора в анализируемой пробе, мг/кг;
А — количество котофора, найденное путем сравнения со стандартными количествами, мкг;
При определении остаточных количеств котофора необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с ядовитыми, взрыво- и огнеопасными веществами.
4. Методика разработана М.С. Петросян, Ю.А. Бунятян, С.Г. Геворкян (Арм. филиал ВНИИГИНТОКС, Ереван).