Методические указания по определению микробиологических инсектицидов непрямым иммунофлуоресцентным методом

(утв. Минздравом СССР 19.10.1979 № 2089-79)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИНСЕКТИЦИДОВ НЕПРЯМЫМ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

Известные в настоящее время микробиологические препараты для защиты растений могут быть вирусной, бактериальной и грибной природы. Все вирусные препараты, получаемые в промышленных или лабораторных условиях, содержат в качестве действующего начала вирусные включения типа полиэдров или гранул размером от 0,2 до 5 и более микрон.

Бактериальные препараты, такие как энтобактерин, дендробациллин, инсектин, ромелин и некоторые другие, имеют в своем составе споры и кристаллический токсин, размеры которых лежат в пределах разрешения обычного светового микроскопа. Грибные препараты боверин и энтомофторин также имеют корпускулярную природу, так как включают прежде всего споры, а также конидии, гифальные и мицелиальные тела грибов.

Все биологические препараты в большинстве случаев выпускаются в виде порошка светло-серого цвета, состоящего из соответствующих компонентов действующего начала и наполнителя (каолин или тальк).

Принцип метода

Метод иммунофлуоресценции, разработанный в 1940 году Кунсом с сотрудниками (Coons et al. 1941) заключается в том, что в молекулу антитела вводится флуорохром. Раствором меченых флуорохромом антител обрабатывают препарат, содержащий соответствующий антиген. В результате происходит связывание антигена с меченым антителом, и в люминесцентном микроскопе обнаруживается свечение.

Существуют две модификации иммунофлуоресцентного метода: прямая и непрямая. В случае первой модификации флуоресцирующими красителями метят иммунную сыворотку, которую наносят непосредственно на исследуемый препарат, где предполагается наличие антигена.

При непрямом методе используют немеченую иммунную сыворотку и флуоресцирующую антисыворотку. В этом случае на препарат наносят каплю иммунной к выявляемым антигенам нефлуоресцирующей сыворотки, затем несвязывающуюся сыворотку отмывают физиологическим раствором и наносят флуоресцирующую сыворотку, иммунную к гамма-глобулину первой сыворотки. В результате происходит двойное осаждение сыворотки: на антигене преципитирует иммунный к нему гамма-глобулин нефлуоресцирующей сыворотки, а на нем преципитирует флуоресцирующая сыворотка. Указанный метод находит широкое применение при выявлении различных микроорганизмов.

Реактивы и растворы

2-процентный раствор силиката натрия растворимого, ГОСТ 13079-67, в ацетоне, ГОСТ 2603-71.

Иммунная специфическая кроличья сыворотка.

Мертиолят натрия (тимероал, импорт.) или борная кислота, ГОСТ 9656-61.

Физиологический раствор.

Люминесцирующая ослиная сыворотка против гамма-глобулинов кролика <1>.

---

<1> Стандартные люминесцирующие сыворотки против сывороточных глобулинов кролика можно получить из Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Адрес института: Москва Д-98, ул. Гамалеи, 18, телефон: 1940006, д. 050.

Дистиллированная вода.

Нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат.

Приборы и посуда

Люминесцентный микроскоп (марки МЛ-1, МЛ2-2, МБИ-15 и др.).

Центрифуга (ЦЛС-1, ЦЛН-1 и др.).

Пипетки на 1,0 и 5 мл, ГОСТ 1770-51.

Глазные пипетки или капельницы по Строшеину, Ост НКТП 4017.

Чашки с крышкой, ГОСТ 6236-52.

Предметные стекла.

Пенициллиновые флаконы.

Химические стаканы на 200 — 250 мл, ГОСТ 6236-52.

Бумажные фильтры, ТУ 6-09-1706-72.

Получение иммунных специфических кроличьих сывороток

Специфические сыворотки против микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов, могут готовиться централизованно в специальном Контрольном институте или в существующих институтах (ВНИИБакпрепарат, ВИЗР, ВНИИБМЗР).

Для иммунизации используют молодых кроликов весом 2,5 — 3 кг. В случае работы с вирусными препаратами в качестве антигенов служат высокоочищенные дифференциальным центрифугированием вирусные включения: полиэдры или гранулы. Способ иммунизации — внутривенный. Схемы иммунизации кроликов приведены в таблицах 1 и 2.

ИЗ НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА И КАПУСТНОЙ СОВКИ

№ инъекций	1	2	3	4	5	6
Количество вводимого материала в мл (титр взвеси 250 млн. полиэдров в мл)	1	2	3	5	5	5
Интервалы в днях	3 3 3 7 7

Таблица 2

СХЕМА ИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ ГРАНУЛАМИ ИЗ ОЗИМОЙ СОВКИ

№ инъекций	1	2	3	4	5	6
Количество вводимого белка в мг (воздушно-сухие гранулы)	10,0	10,0	20,0	30,0	30,0	30,0
Интервалы в днях	3 3 3 7 7

Через десять дней после последней инъекции проводят тотальное обескровливание кроликов. Кровь собирают в стерильные пробирки. Для лучшего отслаивания сыворотки пробирки с кровью помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°. После этого сгусток крови отслаивают и оставляют на сутки при 4° для ретракции сгустка. Затем сыворотку отсасывают от сгустка, переносят в стерильные флаконы и центрифугируют в течение 10 — 15 минут при 800 — 1000 об./мин. для отделения клеточных компонентов. После этого сыворотку разливают в стерильные ампулы, добавляют консервант (мертиолят, борная кислота) в концентрации 1:10000 и хранят до употребления в холодильнике при 4° или в замороженном виде при температуре -20°. В случае централизованного производства проводят лиофилизацию сывороток.

Для получения иммунных сывороток к действующим компонентам бактериальных препаратов (дендробациллин, энтобактерин) целесообразно использовать методику, предложенную В.И. Полтевым (1969).

Сыворотки готовят к вегетативным формам бактерий. Для этого бактерии выращивают при температуре 28 — 30° в течение 8 часов, консервируют 5-процентным формалином и хранят в холодильнике.

Перед иммунизацией кроликов взвесь микробов разбавляют раствором 9,5-процентного хлористого натрия до оптического стандарта, соответствующего 2 млрд. микробных тел. Антиген вводят внутривенно кролику через каждые 5 дней по схеме: 1-е введение — 0,5 мл, 2-е — 1, 3-е — 1, 4-е — 1,5 и 5-е — 1,5 мл. Через 5 — 7 дней у кроликов берут кровь и получают сыворотку.

Ход анализа

На поле, обработанном биопрепаратом, берутся 10 листьев или стеблей растений. В лаборатории на поверхность растительного субстрата с помощью глазной пипетки наносят 2-процентный раствор органического стекла в ацетоне, который при комнатной температуре и ниже быстро застывает, превращаясь в эластичную пленку толщиной от 0,01 до 0,1 мм. Затем пленку с субстрата снимают, переносят на предметное стекло, на которое нанесен слой 2-процентного раствора органического стекла в ацетоне. Пленку в этот слой помещают чистой стороной (т.е. верхней). Раствор застывает и фиксирует пленку с отпечатком. Полученный с субстрата препарат окрашивают иммунофлуоресцентным непрямым методом. При этом на пленку наносят иммунную специфическую сыворотку в разведении 1:10. Препараты остаются в контакте с сывороткой в течение 15 — 20 минут во влажной камере (используются чашки Петри) при температуре 37°. После этого препараты промывают дважды по десять минут физиологическим раствором и обрабатывают люминесцирующей ослиной сывороткой против гамма-глобулинов кролика. Техника применения люминесцирующей сыворотки описана в наставлении, прилагаемом к каждой партии сыворотки.

Заключается она в следующем: сухую сыворотку, находящуюся в ампуле, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. После растворения сыворотку центрифугируют при 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут в пенициллиновом флаконе и осторожно переносят пипеткой в новый флакон.

Сыворотку разводят до рабочего разведения, указанного на этикетке. Разведенную сыворотку наносят на препарат и оставляют в контакте с ним во влажной камере при 37° в течение 15 — 20 минут. Затем препараты промывают дважды в физиологическом растворе, ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и просматривают под люминесцентным микроскопом в падающих сине-фиолетовых лучах. При выявлении полиэдренных вирусных включений (препараты «ВИРИН-ЭКС», «ВИРИН-ЭНШ») удобнее пользоваться объективом с увеличением 40, в случае выявления гранул, бактериальных спор и кристаллического токсина (препараты энтобактерин, дендробациллин и др.) — объективом масляной иммерсии.

Для контроля иммунологической специфичности необходим просмотр контрольных препаратов.

1. Препараты, обработанные по описанной методике, но не содержащие искомых вирусных включений.

2. Препараты, заведомо содержащие искомые вирусные включения.

3. Препараты, обработанные физиологическим раствором вместо иммунной кроличьей сыворотки.

4. Препараты, обработанные нормальной сывороткой вместо специфической.

При соблюдении всех условий метода в контрольных препаратах специфическое свечение отсутствует.

Расчет обнаруженного количества действующего начала препарата

В ходе анализа определяют площадь поля зрения микроскопа с рабочим объективом (используя окуляр и объектмикрометры) и подсчитывают число включений в 100 — 500 полях. Для удобства счета определяют, в каких пределах перемещения предметного столика можно получить требуемое число полей. Так, если работа ведется с объективом х40, то целесообразно перемещать столик в продольном направлении на 30 мм, что будет соответствовать 100 диаметрам полей зрения. Установив среднее количество микроорганизмов в одном поле зрения, определяют их число на единице площади субстрата по формуле:

                                N х S

M = -----, S о

где:

M — количество включений на поверхности исследуемого образца;

    N   -   число   включений  в  одном  поле  зрения  микроскопа,  которое
определяется как  среднее  арифметическое  из 1000 (10 образцов, и в каждом

просматривается 100 полей зрения);

S — площадь субстрата, на которой определяется количество микроорганизмов;

S — площадь поля зрения микроскопа. о

Пример расчета

    При  просмотре препаратов из исследуемых 10 образцов установлено, что в
одном  поле  зрения микроскопа обнаруживается в среднем 0,5 микроорганизмов
со  специфическим  свечением (N = 0,5). Площадь поля зрения люминесцентного
микроскопа  МЛ-3  с  объективом  40  х 0,65 Л равна 0,07 кв. мм (S ). Чтобы

                                                              о

определить количество микроорганизмов на площади субстрата в 1 кв. см (100 кв. мм), необходимо сделать следующий расчет:

    0,5 х 100    50

M = --------- = ---- ~ 714. 0,07 0,07

Таким образом, на 1 кв. см поверхности субстрата содержится около 714 определяемых микроорганизмов.

---