Бактериологическая диагностика туберкулеза внелегочных локализаций с использованием полимеразной цепной реакции и выявления L-форм микобактерий. Методические рекомендации № 2000/170

(утв. Минздравом РФ 10.04.2001)

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА ВНЕЛЕГОЧНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ И ВЫЯВЛЕНИЯ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

АННОТАЦИЯ

В Методических рекомендациях представлены методы бактериологической диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции и посева на L-формы, предусматривающие повышение эффективности ПЦР за счет оптимизации методов выделения ДНК из клинического материала и верификацию туберкулезной природы L-форм с применением полимеразной цепной реакции. Использование предлагаемых методов позволяет значительно повысить эффективность бактериологической диагностики туберкулеза внелегочных локализаций.

Методика предназначена для работников научно-исследовательских и практических лабораторий, занимающихся бактериологической диагностикой туберкулеза различных локализаций.

Методические рекомендации подготовлены сотрудниками Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ к.б.н. Вишневской Е.Б., д.м.н. Бобченок А.П., Мельниковой Н.Н. и д.м.н. Вишневским Б.И.

ВВЕДЕНИЕ

Бактериологические методы играют значительную роль в диагностике внелегочного туберкулеза, однако, нередко стандартными методами микроскопии и посева не удается определить наличие обычных клеточных форм микобактерий туберкулеза, поскольку клинические образцы, как правило, олигобациллярны. При анализе олигобациллярных образцов клинического материала особую значимость приобретает метод ПЦР. Благодаря высокой чувствительности, этот метод позволяет обнаружить ДНК возбудителя даже в случае очень низкого ее содержания в исследуемом материале. В то же время, при работе с олигобациллярными образцами появляется и ряд новых проблем. Если в случае анализа биологических жидкостей исходный материал концентрируется в процессе предпосевной обработки, то образцы тканей и костей сконцентрировать невозможно. Для ПЦР-анализа используется малый объем материала, поэтому высока вероятность того, что при незначительном количестве микобактериальных клеток в образце они не попадут в исследуемый фрагмент. Кроме того, избыток тканевой ДНК в исследуемом материале мешает проведению специфической ПЦР.

В связи с тем, что возбудитель туберкулеза обладает высокой степенью изменчивости, большое значение имеет выделение из клинического материала не только обычных клеточных форм, но и вариантов дефектных по клеточной стенке, так называемых L-форм. Однако, в отличие от клеточных форм, бактериологическое исследование выделенных L-форм представляет определенные трудности. В то же время, для диагностики туберкулеза необходима точная идентификация туберкулезного происхождения L-форм. Доказательством туберкулезной природы L-форм может служить их реверсия в палочковидные формы, но она происходит достаточно редко. Известный метод иммунофлюоресценции для идентификации L-форм сложен, обладает недостаточной чувствительностью и специфичностью, при этом стандартизованные варианты этого анализа отсутствуют. Таким образом, разработка способов, позволяющих повысить эффективность ПЦР и обеспечить выделение и идентификацию L-форм M.tuberculosis, является важной задачей лабораторной диагностики внелегочного туберкулеза.

ФОРМУЛА МЕТОДА

Метод бактериологической диагностики туберкулеза внелегочных локализаций путем полимеразной цепной реакции и выделения L-форм, отличающийся тем, что 1) выделение ДНК для ПЦР осуществляется дифференцированно в зависимости от типа исследуемого патологического материала: при анализе олигобациллярных образцов ДНК выделяют параллельно из нескольких фрагментов образца; синовиальную жидкость предварительно подвергают центрифугированию; извлечение ДНК из тканей почек и синовиальной оболочки осуществляется щелочным лизисом с последующим выделением ДНК на сорбенте; 2) из патологического материала методом посева на полужидкую среду выделяют L-формы, туберкулезное происхождение которых идентифицируют методом ПЦР.

Приоритетная справка на выдачу патента № 2000103371 от 10.02.2000 г. по заявке «Способ бактериологической диагностики туберкулеза».

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА

Выявление ДНК и L-форм M.tuberculosis complex методами полимеразной цепной реакции и посева на полужидкую агаризованную среду при анализе образцов внелегочного материала (ткани почек, соскобы эндометрия, моча, костная ткань, биопсийный материал).

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА

1. Оборудование.

• Центрифуга-вортекс для осаждения и перемешивания биологических проб для ПЦР-анализа ЦВ-«ВСМ» (Москва), ТУ 9443-003-29032954-97, рег. № 98/219-155.
• Дозаторы пипеточные с варьируемыми объемами дозирования одноканальные, с наконечниками, «Ленпипет», Россия, ТУ 9452-001-33189998-95, рег. № 93/199-209.
• Термостат для температурной подготовки проб к проведению ПЦР-анализа Т-«ВСМ» (Москва), ТУ 9443-002-29032954-97, рег. № 98/219-154.
• Термостат программируемый для проведения ПЦР-анализа ТП-«ВСМ» (Москва), ТУ 9443-001-29032954-97, рег. № 98/219-153.
• Стандартное оборудование бактериологической лаборатории.

2. Реактивы и материалы.

2.1 Растворители, кислоты:

• спирт этиловый — регистрационное удостоверение 74/614/11;
• 2-пропанол — ТУ 6-09-4522-77 хч.

2.2 Соли, детергенты, красители:

• гуанидина изотиоцианат — ТУ 6-09-07-810-77;
• натрий уксуснокислый — ТУ 6-09-875-78;
• натрия гидроксид — ГОСТ 13586-77;
• натрия хлорид — регистрационное удостоверение 71/380/6;
• трис(оксиметил)аминометан — ТУ 6-09-4292-76 хч;
• Этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты динатриевая соль - ГОСТ 10652-73 хч;
• Тритон Х-100 — Lot 10740934, Sigma, США.

2.3 Сорбенты, носители:

• диатомовая земля — Lot 425-769, Sigma, США.

2.4 Тест-системы:

• Набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) «Политуб» (Москва, НПФ «Литех»), ТУ 9398-410-17253567-97, рег. № 98/219-22-1

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

I. ПЦР-АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ БОЛЬНЫХ ВНЕЛЕГОЧНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

Рекомендуемый для исследования материал:

• при гинекологическом туберкулезе — ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;
• при туберкулезе костей у детей — фрагменты костей;
• при туберкулезе костей у взрослых — гной, некротические массы;
• при туберкулезе суставов — параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

При других внелегочных локализациях туберкулеза — биоптаты из очагов поражения.

Подготовка образцов послеоперационного и биопсийного материала к ПЦР-анализу.

Из твердых клинических образцов, отобранных для анализа методом ПЦР, отделяют по два фрагмента, так, чтобы в случае разнородности материала (фрагмент кости — грануляции, ткань почки — гной) в исследуемые фрагменты попали все типы материала. Отделенные фрагменты подвергают щелочному лизису. К 0.05 куб. см тщательно растертого стеклянной палочкой образца приливают 0.11 мл раствора, содержащего 0.1М NaOH, 1М NaCl и 0.5% додецилсульфата натрия, тщательно встряхивают и инкубируют 10 мин. на кипящей водяной бане. После охлаждения до комнатной температуры ДНК из образцов костей и суставов выделяют методом сорбции на диатомовой земле в присутствии солей гуанидина с предварительным осаждением изопропанолом (Методические рекомендации МЗ РФ «Методы выделения ДНК для диагностики внелегочного туберкулеза путем полимеразной цепной реакции», Санкт-Петербург, 2000 г).

Из образцов ткани (ткань почки, эндометрий, биоптаты маточных труб) ДНК для ПЦР после щелочного лизиса выделяют следующим образом. К каждому образцу добавляют по 900 мкл раствора, содержащего 6М роданистый гуанидин, 2% Triton Х-100 и 0.05М ЭДТА и по 10 мкл суспензии сорбента (диатомовой земли). Инкубируют 20 мин. при комнатной температуре, периодически встряхивая, затем центрифугируют 15 сек. при 10000g. Дважды проводят отмывку 0.5 мл 4М роданистого гуанидина. Однократно проводят отмывку 1 мл изопропанола. Дважды проводят отмывку 70.0% этанолом и однократно — ацетоном. При проведении отмывок после добавления отмывочного реагента образцы интенсивно встряхивают и центрифугируют 15 сек. при 10000g, после чего супернатант аккуратно отсасывают или сливают. В случае, если после отмывки каким-либо из отмывочных реагентов супернатант имеет выраженную окраску, повторяют отмывку этим реагентом. После последней отмывки осадок подсушивают с открытой крышкой 5-10 мин. при 50 град. C, а затем ДНК элюируют с сорбента ТЕ-буфером (встряхивают с 50 мкл буфера и инкубируют 10 мин. с закрытой крышкой при 50 град. C) и центрифугируют 15 сек. при 10000g. Супернатант отбирают, стараясь не захватывать частицы осадка диатомовой земли, и используют для проведения ПЦР. ПЦР проводят параллельно с двумя фрагментами каждого образца.

Синовиальную жидкость от одного больного разливают по микроцентрифужным пробиркам в объеме 1.5 мл и центрифугируют 5 мин. при 10000g. Супернатант сливают. В случае если объем осадка составляет менее 20 мкл, объединяют осадки из нескольких центрифужных пробирок. Осадки инактивируют нагреванием, для чего к ним добавляют 100 мкл физиологического раствора и инкубируют 15 мин. на кипящей водяной бане. Далее ДНК выделяют так же, как из образцов тканей, и используют для проведения ПЦР.

Проведение амплификации.

При использовании набора «Политуб» режимы амплификации устанавливают в соответствии с инструкцией изготовителя, реакцию проводят в объеме 25 мкл, с 5 мкл анализируемого раствора ДНК. Для анализа образцов внелегочного материала рекомендуется проведение реакции в два этапа. На первом этапе проводят 30 циклов амплификации. В реакционную смесь вносят 5 мкл амплификата и реамплифицируют в том же режиме в течение 10 циклов.

II. ВЫДЕЛЕНИЕ L-ФОРМ И АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ МЕТОДОМ ПЦР

Образцы клинического материала от больных внелегочным туберкулезом подвергают деконтаминации и проводят посев на полужидкие среды для выделения L-форм в соответствии с Методическими рекомендациями МЗ СССР «Выделение L-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала» (Москва, 1984 г.). Результаты посева учитываются макроскопически и с помощью фазово-контрастной и световой микроскопии.

При получении характерного макророста L-форм и микроскопического подтверждения их выделения и отсутствия контаминации проводят верификацию туберкулезного происхождения L-форм методом ПЦР.

ПЦР-анализ выделенных культур L-форм следует проводить в срок, не превышающий двух недель с момента появления характерного макророста L-форм (при инкубации пробирок с культурой L-форм в термостате при +37 град. C) или в срок, не превышающий двух месяцев, при хранении пробирок с культурами L-форм в холодильнике при +4 град. C.

Из пробирки с полужидкой средой, содержащей культуру L-форм, отбирают 0.25 мл из области максимального помутнения среды (или из области с максимальным количеством микроколоний L-форм). Отобранный материал помещают в микропробирки объемом 1.5 мл и заливают 0.75 мл 6М раствора изотиоцианата гуанидина. Добавляют 0.02 мл суспензии диатомовой земли, пробирки закрывают крышками и тщательно перемешивают встряхиванием. Инкубируют 30 мин. при комнатной температуре, периодически перемешивая встряхиванием. Центрифугируют 1 мин. при 10000g, супернатант отсасывают.

Далее проводят серию последовательных отмывок 4М роданистым гуанидином, 70% этанолом и ацетоном. Отмывочные реагенты добавляют в количестве 1 мл, встряхивают и центрифугируют 15 сек. при 10000g, после чего супернатант аккуратно отсасывают или сливают в емкость с хлорамином. Отмывку каждым из реагентов проводят дважды. После последней отмывки осадок подсушивают с открытой крышкой 5-10 мин. при 50 град. C, а затем ДНК элюируют с сорбента ТЕ-буфером (встряхивают с 50 мкл буфера и инкубируют 10 мин. с закрытой крышкой при 50 град. C) и центрифугируют 15 сек. при 10000g. Супернатант отбирают, стараясь не захватывать частицы осадка диатомовой земли, и используют для проведения ПЦР. При попадании частиц осадка в отобранную пробу снова проводят прогрев при 50 град. C в течение 5 мин., центрифугируют 15 сек. при 10000g и отбирают супернатант.

Непосредственно ПЦР и визуализацию результатов исследования проводят с применением «Набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса» в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) «Политуб» (Москва, НПФ «Литех») в соответствии с инструкцией изготовителя. Число циклов амплификации — 30.

Не рекомендуется применять для идентификации выделенных L-форм тест-системы для ПЦР-анализа, основанные на амплификации специфического участка инсерционного элемента IS 6110 M.tuberculosis, так как не все штаммы L-форм, принадлежащие к M.tuberculosis complex, содержат этот элемент.

В случае получения положительного результата ПЦР-анализа выделенную культуру L-форм характеризуют как L-формы M.tuberculosis complex.

При получении отрицательного результата проводят контроль ингибирования ПЦР. Для этого в реакционную смесь вносят по 4 мкл образца и 1 мкл положительного контроля, образец считают ингибирующим в случае отсутствия специфического бэнда в агарозном геле. Если образец ингибирует ПЦР, исследование этой культуры L-форм повторяют, при этом на этапе выделения ДНК увеличивают число отмывок каждым реагентом до трех.

В случае получения отрицательного результата при отсутствии ингибирования ПЦР выделенную культуру L-форм расценивают как L-формы кислотоустойчивых микобактерий, без указания видовой принадлежности.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

Эффективность ПЦР-анализа при исследовании образцов, полученных от больных внелегочным туберкулезом, представлена в таблице 1.

Локализация туберкулеза	Всего (100%)	Выделены МБТ		ПЦР +		Специфичность ПЦР
		абс.	%	абс.	%	%
Туберкулез костей и суставов	167	63	37.7	121	72.5	90.7
Туберкулез мочеполовой системы	29	13	44.8	27	93.1	96.1
Туберкулез женских гениталий	298	9	3.0	209	70.1	90.5
Туберкулез периферических лимфоузлов	42	11	26.2	36	85.7	90.3

Апробация модифицированного варианта подготовки материала к ПЦР-анализу проведена на образцах от 30 больных туберкулезом костей и позвоночника, 12 больных с оститами и остеомиелитами нетуберкулезной этиологии, 38 образцах ткани от больных туберкулезом почек и гениталий и 8 образцах синовиальной жидкости. Из каждого образца костного материала отбирали по 2-4 фрагмента от разных участков, из которых выделяли ДНК и параллельно исследовали методом ПЦР. Положительным считали образец, в котором хотя бы один фрагмент дал положительный результат ПЦР. Почти у половины образцов (46.7%) положительный результат ПЦР наблюдался только в одном из исследованных фрагментов. Чувствительность ПЦР составила при этом 70%, в то время как при расчете относительно всех исследованных фрагментов (60 от 30 образцов больных активным туберкулезом) ПЦР была положительна лишь в 14 случаях из 30. Таким образом, исследование нескольких фрагментов образца позволяет в значительной мере повысить эффективность выявления ДНК M.tuberculosis методом ПЦР.

При исследовании образцов от больных активным туберкулезом почек и женских гениталий сравнивали ферментативный и щелочной варианты лизиса материала. В таблице 2 приведены результаты ПЦР-анализа образцов, ДНК из которых была выделена двумя различными методами.

Как видно из таблицы, эффективность ПЦР оказалась достоверно выше в случае применения щелочного лизиса патологического материала.

Локализация туберкулеза	Всего больных	Ферментативный лизис, ПЦР+		Щелочной лизис ПЦР+
		абс.	%	абс.	%
Туберкулез почек	12	6	50.0	10	83.3
Гинекологический туберкулез	26	11	42.3	18	69.2

P < 0,05

Сравнение ферментативного (с помощью гиалуронидазы) лизиса 8 образцов синовиальной жидкости с методом осаждения материала центрифугированием не выявило различий между этими вариантами. Поскольку ферментативный метод является более трудоемким и дорогостоящим, выделение ДНК из синовиальной жидкости с предварительным центрифугированием представляется более целесообразным.

---