Методические рекомендации. Применение метода клеточных культур для исследования биологического действия пестицидов

(утв. Минздравом СССР 20.03.1979 № 1970-79)

20 марта 1979 г. № 1970-79

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПЕСТИЦИДОВ

Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, Молдавский научно-исследовательский институт гигиены и эпидемиологии.

Методические рекомендации предназначены для токсикологов научно-исследовательских учреждений гигиенического профиля.

ВВЕДЕНИЕ

Культуры клеток как биологическая модель с успехом применяются в вирусологии, онкологии, фармакологии и других областях биологии и медицины. Все чаще этот метод используется гигиенистами и токсикологами.

Известно, что клетки, выращенные in vitro, сохраняют многие черты метаболизма исходных тканей хозяина и в то же время лишены тканевых и органных взаимосвязей, регуляторных влияний нервной и эндокринной систем, обладают весьма ограниченными компенсаторными возможностями. Эти особенности культур клеток дают возможность исследовать взаимодействие химических агентов с клеткой в «чистом виде», выявить изменения клеточных и субклеточных структур, которые в условиях целостного организма могут маскироваться или видоизменяться указанными выше компенсаторными и регуляторными механизмами на ранних этапах развития токсического процесса (стадия компенсации) или при действии низких доз (концентраций) химических агентов.

Кроме того, культуры соматических клеток являются удобной моделью для изучения влияния химических соединений на ядерный аппарат и процессы репродукции клеток, а также для решения ряда других вопросов взаимодействия клетки с ядом.

Вместе с тем, рассматриваемая тест-система имеет ряд ограничений, обусловленных самой природой метода. В частности, в исследованиях на культурах клеток не могут быть учтены такие важные с общетоксикологических позиций моменты, как путь поступления химического агента в организм, его распределение, выведение и другие вопросы токсикодинамики. Как и при применении других модельных тест-систем, экстраполяция полученных результатов на целостный организм требует большой осторожности, особенно когда речь идет о количественных показателях.

В связи с этим следует подчеркнуть, что, несмотря на ценную информацию, получаемую при исследовании влияния пестицидов на культуру клеток, этот метод не подменяет какие-либо токсикологические эксперименты in vivo.

В предлагаемых методических рекомендациях основное внимание уделяется вопросам определения параметров цитотоксичности пестицидов (без чего не может обойтись любое исследование in vitro), описанию методов выявления морфологических и цитохимических изменений в клетках при действии указанных химических соединений, а также методу комплексного изучения митотического режима культур клеток как одного из показателей цитогенетического действия химических агентов. Подробно описана методика исследования состояния ДНК и РНК в эксплантированных клетках при действии пестицидов с использованием люминесцентной микроскопии.

1. КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О МЕТОДАХ РАБОТЫ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОК В САНИТАРНО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Однослойные культуры клеток принято разделять на две основные группы: первичные (первично-трипсинизированные) культуры и перевиваемые линии клеток. Первичные культуры получают непосредственно из тканей человеческого или животного происхождения путем их диспергирования протеолитическими ферментами (чаще трипсином) и выращивания их в соответствующих питательных средах. Срок жизни таких культур ограничен, и по прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, приводящие в конечном итоге к гибели клеток.

В отдельных случаях, используя ряд дополнительных методических приемов, из первичных культур удается получить клоны клеток, способные к неопределенно длительному росту in vitro, то есть получить перевиваемую линию клеток.

Методике получения, выращивания и описанию свойств однослойных культур посвящена обширная литература. Ниже приводятся основные этапы работы с культурами клеток, необходимые для организации санитарно-токсикологического эксперимента.

Исследования проводят в специально отведенном помещении (бокс с предбоксником), снабженном соответствующим оборудованием (термостат, холодильник, магнитная мешалка, центрифуга и др.), специальной посудой, реактивами, набором питательных сред и т.п. (Методическое письмо для работы с клеточными культурами, 1969).

Для работы с культурами клеток целесообразно использовать готовые питательные среды, выпускаемые Московским НИИ вирусных препаратов, Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АН СССР и др. Для проведения токсикологических опытов достаточно иметь следующий набор сред: среда 199, 0,5% гидролизат лактальбумина, раствор Хэнкса, раствор Эрла, 0,25 — 0,3 процентный раствор трипсина, раствор версена и нативная бычья сыворотка. В качестве антибиотиков применяют обычно пенициллин и стрептомицин.

Все работы по получению и ведению культур проводят с соблюдением правил асептики и антисептики, позволяющих исключить возможность бактериального заражения и гибели клеток.

1.1. Получение первично-трипсинизированных культур

Первично-трипсинизированные культуры могут быть получены из тканей взрослых особей или их эмбрионов. В санитарно-токсикологическом эксперименте может быть использована любая первично-трипсинизированная культура, однако предпочтительнее работать с культурой фибробластов эмбриона человека. Это обусловлено ее высокой чувствительностью к действию химических агентов, относительным сходством метаболических процессов эксплантированных клеток с таковыми целостного организма.

Методика получения первично-трипсинизированных культур из различных по происхождению тканей в принципе одинакова. Особенности заключаются в основном в технике забора и предварительной подготовке первичного материала, длительности обработки трипсином и подборе оптимального состава ростовой среды.

Получение культуры фибробластов эмбриона человека

Кусочки тканей эмбрионов (материал медицинских абортов) отбирают в стерильный флакон со средой Хэнкса или Эрла, содержащей пенициллин и стрептомицин из расчета 200 ед./мл каждого. В стерильном боксе эмбриональный материал выкладывают в чашку Петри, при помощи глазных ножниц и пинцета отбирают кожно-мышечную ткань, тщательно удаляют сгустки крови, кусочки плаценты и крупные кости. Отобранный материал переносят в лабораторный стакан, с помощью изогнутых ножниц измельчают до величины кусочков 1 — 3 мм, промывают 4 — 5 порциями раствора Хэнкса, Эрла или фосфатно-буферного раствора с антибиотиками и переносят в коническую колбу. Ткань заливают теплым раствором трипсина, в колбу опускают стерильный магнит и трипсинизируют в течение 10 — 15 минут на магнитной мешалке. Первую порцию суспензии выбрасывают, т.к. она содержит много форменных элементов крови. Трипсинизацию продолжают такими циклами до полной дезагрегации ткани. В каждую вновь полученную порцию суспензии добавляют равный объем холодного раствора Хэнкса для прекращения действия трипсина, взвесь центрифугируют в пробирках 10 мин. при 800 — 1000 об./мин. Осадки собирают в заранее подготовленный флакон с определенным (обычно 50 мл) объемом среды 199, тщательно пипетируют (без образования пены) и фильтруют через двухслойный марлевый фильтр.

Для подсчета клеток на часовое стекло набирают равные объемы клеточной взвеси и 1 процентного раствора метиленовой сини (по 0,1 — 0,2 мл), хорошо смешивают и заполняют камеру Горяева. При малом увеличении микроскопа считают число клеток в 25 больших квадратах в обеих сетках камеры. Учитывают лишь хорошо окрасившиеся клетки с четким ободком цитоплазмы вокруг ядра, конгломераты клеток учитывают как одну клетку. Число клеток в 1 мл соответствует сумме клеток в 50 квадратах камеры, умноженной на 10000.

Клеточную взвесь разводят средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл взвеси содержалось 500 — 600 тысяч клеток. Перед разведением рассчитывают необходимые количества составных компонентов ростовой среды, окончательное соотношение которых должно составлять: среда 199 — 50%, гидролизат лактальбумина — 35%, нативная бычья сыворотка — 15%; пенициллин и стрептомицин по 100 ед./мл. Полученную таким образом суспензию в зависимости от цели опыта разливают по 1,5 — 2 мл в пенициллиновые флаконы или в пробирки с покровными стеклышками (24 x 8 мм) или без них. Флаконы с культурой помещают (желательно в специальном штативе) в термостат при 37 °C под таким углом, чтобы среда не касалась пробки и полностью покрывала стеклышко. Клеточный монослой формируется на 3 — 4 сутки.

1.2. Перевиваемые линии клеток

В санитарно-токсикологическом эксперименте используются также перевиваемые линии клеток, поддерживаемые в виде однослойных культур. Перевиваемые линии характеризуются морфологической однотипностью составляющих их клеточных элементов, значительным сходством метаболизма и цитофизиологических показателей. Вместе с тем, они сохраняют значительную степень индивидуальности, что определяет, в частности, различную чувствительность к действию токсических агентов. В связи с этим токсикологические исследования желательно проводить параллельно на двух-, трехклеточных линиях с целью отбора и последующего изучения наиболее чувствительной из них.

Перевиваемые линии клеток удобнее всего пересевать в матрасы различной емкости, в зависимости от назначения пассажа. Для постановки развернутого токсикологического эксперимента культуру накапливают в одном или двух больших матрасах. В качестве ростовых сред чаще всего используют среду 199 с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков (по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина) или ее смесь с 0,5 процентным раствором гидролизата лактальбумина. Через 5 — 7 дней после пересева на стенке матраса формируется сплошной клеточный слой, и культуру вновь пересевают. Для этого ее интенсивно ополаскивают раствором версена, затем матрас выдерживают монослоем вверх при 37 °C, тщательно смывают средой клетки со стекла, пипетируют до получения однородной суспензии, клетки подсчитывают и суспензию разводят ростовой средой до посевной дозы (от 50 до 200 тысяч клеток в 1 мл, в зависимости от линии клеток). Часть полученной взвеси засевают в матрас для дальнейшего ведения культуры, остальное — во флаконы или пробирки для использования в токсикологическом опыте.

Во избежание гибели клеточной линии из-за бактериального загрязнения или других случайных причин рекомендуется параллельно вести резервные культуры.

2. ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕСТИЦИДОВ

Независимо от конечных целей исследования постановку опытов in vitro следует начинать с предварительного определения параметров токсичности пестицидов по отношению к конкретно выбранной линии перевиваемых клеток или первичной культуры. Результаты этих опытов дают возможность составить представление о сравнительной токсичности пестицидов, темпах развития токсического эффекта, а отчасти — о характере повреждения клеток. Кроме того, полученные данные позволяют выбрать адекватный диапазон доз (от токсических до недействующих) с целью проведения более глубоких цитоморфологических, цитохимических, электронно-микроскопического, цитогенетических и других исследований.

2.1. Определение параметров токсичности

Опыты ставят на 3 — 4-дневных перевиваемых и первично-трипсинизированных культурах, выращенных на стенке флаконов или пробирок с хорошо сформированным монослоем. Отбор пригодных для работы культур производят при малом увеличении микроскопа с опущенным конденсором. Из отобранных флаконов выливают питательную среду. Культуры промывают теплым раствором Хэнкса или Эрла и вносят 2 мл поддерживающей среды с исследуемым пестицидом.

Методические приемы внесения в клеточные культуры исследуемых пестицидов различаются в зависимости от их физико-химических свойств:

1. водорастворимые препараты вносят в определенном количестве в питательную среду, затем производят соответствующие разведения питательной средой от наиболее высокого содержания до наиболее низкого с равными количественными промежутками между ними. Полученные растворы вносят в пробирки с клеточными культурами;

2. твердые порошкообразные вещества измельчают, растирая в фарфоровой ступке, и вносят в определенном количестве с питательной средой. Тщательно перемешивают до получения однородной взвеси. Разведения производят так же, как указано в п. 1. Следует отметить, что густая суспензия, осаждаясь на клетки, затрудняет наблюдение за ними. Во избежание этого пробирки с культурами помещают во вращающийся в термостате барабан;

3. нерастворимые в воде вещества предварительно растворяют в чистом стерильном растительном масле или этиловом спирте, затем производят разведения питательной средой в обычном порядке. Следует отметить, что клетки реагируют на присутствие масла или этанола. За исходный раствор могут быть приняты 0,1 мл масла на пробирку и 0,1 мл этанола на 0,9 мл питательной среды. Перед опытом необходимо проверить чувствительность клеток к этим растворителям. В контрольные пробирки вносят такое же количество масла или спирта, как и в пробирки, содержащие пестицид.

Выбор концентраций пестицида обычно производят эмпирически с учетом токсичности пестицида in vivo, если такие данные имеются. В первом предварительном опыте целесообразно испытать ряд концентраций, выбирая их таким образом, чтобы кратность разведений оставалась постоянной (обычно 10-кратной). Такая схема позволяет быстро найти токсическую концентрацию.

Поскольку зона токсического действия пестицидов достаточно узка (как правило, не выходит за пределы одного порядка), то в повторном опыте целесообразно брать двукратные междозовые интервалы. Для получения репрезентативных результатов на каждую дозу и соответствующие контроли («чистый» контроль и контроль растворителя при необходимости) берут не менее 3 — 5 флаконов с культурами.

    Степень  цитотоксичности  определяют  на  нефиксированных культурах при
малом  увеличении  микроскопа.  Учитывают такие показатели, как целостность
монослоя,   степень   его   разрежения,   характер  расположения  клеточных
элементов.  Наблюдение  ведут  в  динамике  через 3, 12, 24, 48 и 72 часа с
обязательным   учетом  состояния  контрольных  культур.  Степень  указанных
изменений  оценивают с помощью балльной системы: полную дегенерацию культур
с  отделением  клеток от стекла классифицируют как 4 балла, гибель примерно

75% клеточных элементов (3,50% — 2,25%) — 1 балл (М.К. Ворошилова и соавт., 1964). Минимальные изменения монослоя (дегенерация отдельных клеток по периферии монослоя) оценивают как 0,5 балла и данную концентрацию принимают

за  пороговую.  Наименьшую  концентрацию  препарата, вызывающую дегенерацию
примерно   50%   клеток    при   48-часовой   экспозиции,   принимают    за
среднетоксическую  дозу  -  ТД    (Gabliks,  Friedman.  1965).  Определение

                          50

параметров токсичности пестицидов должно производиться по результатам не менее трех повторностей опыта.

2.2. Изучение морфологических изменений культур клеток

    Диапазон  токсичности  ядохимикатов для культур клеток значительно уже,
чем in vivo, и часто находится  в пределах одного порядка. В связи с этим в
опытах  in  vitro  десятикратные  интервалы  между дозами не приемлемы. Для

исследования дозовой зависимости эффекта оправдано использование следующего ряда доз: 1/2, 1/4, 1/8, ТД . 50

    Морфологические,   цитохимические   исследования  и  особенно  изучение
митотического  режима  культур  клеток  следует проводить в динамике. Выбор
точек  фиксации может быть произвольным, однако с таким расчетом, чтобы они
захватывали  все  этапы  клеточного цикла, т.е. периоды G , S, G , и стадии
                                                         1      2
митоза.  Для  этого целесообразно фиксировать культуры через 3, 12, 24 и 48
часов  после  введения  в среду пестицида. Для изучения вопросов элиминации
или  дупликации  патологических  форм  деления  нужно ввести дополнительные

сроки фиксации (например, 72 и 96 часов от начала действия).

В санитарно-токсикологическом эксперименте существенное значение имеет решение вопроса, обладает ли данное вещество свойством избирательно повреждать репродуктивный аппарат клеток. В связи с этим выбор длительности экспозиции не имеет существенного значения и контакт культуры с ядохимикатом может быть постоянным. При исследовании чувствительности отдельных периодов клеточного цикла продолжительность действия пестицида на культуру не должна превышать двух часов.

При постановке развернутого опыта нужно предварительно рассчитать необходимое количество флаконов с культурой, имея в виду, что для статистической обработки на каждую точку фиксации необходимо иметь не менее пяти опытных и контрольных препаратов.

Для фиксации культур клеток могут быть использованы метиловый спирт, смесь Буэна, 10-процентный нейтральный формалин, смесь Шабадаша и другие фиксаторы. Для унификации условий опытов необходимо применять один из них постоянно. Хорошие результаты дает фиксация в смеси Шабадаша (96° этиловый спирт — 100 мл, медь азотнокислая — 1,8 г, кальций азотнокислый — 0,9 г; ex tempore добавляют 10 мл 100-процентного нейтрального формалина) в течение 15 минут с последующей дофиксацией в 96° спирте. Подробные сведения по гистологической технике можно получить из руководства Г.А. Меркулова (1969) или из других подобных источников.

Фиксированные препараты окрашивают гематоксилином и эозином. При этом цитоплазма клеток не должна быть окрашена гематоксилином, а степень окрашивания ядер должна быть такой, чтобы четко были видны ядерные структуры. Заключают в бальзам на предметном стекле монослоем вниз.

Полученные препараты вначале изучают при малом увеличении микроскопа. Отмечают степень разрежения монослоя, характер роста (тяжистый, островковый), форму клеток, наличие зернистости или включений в цитоплазме, форму ядер, число ядрышек, характер распределения хроматина и др. Степень цитотоксичности пестицидов в определенной степени отражает индекс альтерации. Для его определения в каждом препарате подсчитывают при иммерсионном увеличении число дегенерирующих элементов на 1000 клеток. Результаты подсчета подвергают статистической обработке.

Следует отметить, однако, что индекс альтерации не отражает истинную степень цитотоксичности. Это связано с тем, что дегенерирующие под влиянием пестицидов клетки теряют адгезивные свойства, большинство из них отпадает от стекла и, следовательно, не может быть учтено при исследовании фиксированных препаратов.

2.3. Методы цитохимического исследования культур клеток

Проведение цитохимических исследований направлено, в первую очередь, на раскрытие механизма взаимодействия яда с клеткой, на поиск «точек приложения» вещества, в зависимости от его химического строения, интенсивности, длительности воздействия и т.д.

На культурах клеток в принципе можно поставить любую цитохимическую реакцию, методика которой разработана для гистологических срезов (Пирс, 1962; М. Берстон, 1965). Однако для этого нужно предварительно модифицировать основные условия опыта (подбор фиксирующей жидкости и установление оптимальных сроков фиксации, инкубации и т.д.) применительно к новому объекту исследования.

Результаты цитохимических исследований количественно могут быть оценены различными цитофотометрическими методами. При отсутствии необходимой аппаратуры удовлетворительные результаты дает полуколичественная визуальная оценка степени окрашивания или накопления гранул красителя в различных клеточных структурах с использованием балльной системы (от 1 до 3 баллов; см. В.В. Соколовский, 1971).

Для постановки цитохимических реакций культуры выращивают на покровных стеклах. Выбор доз и длительность экспозиции производятся с учетом данных обзорного морфологического исследования. Каждую реакцию необходимо проводить одновременно в контрольных и в опытных культурах.

Гликоген. Поскольку в клетках первично-трипсинизированных культур содержится мало гликогена, исследования целесообразно проводить на перевиваемых линиях.

Метод основан на окислении полисахаридов перйодатом калия или натрия с образованием свободных альдегидных групп, дающих в реакции с фуксинсернистой кислотой соединение красно-фиолетового цвета.

Для постановки реакции необходимо иметь заранее приготовленный реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота), перйодат калия или натрия, 1 н раствор соляной кислоты и бисульфит натрия (или метабисульфит калия) для сернистой воды.

Контрольные и опытные культуры фиксируют в смеси Шабадаша в течение 15 минут, затем ополаскивают 96° спиртом и дистиллированной водой. Культуры помещают в приготовленный 0,23 — 0,27 процентный раствор перйодата калия или натрия на 20 минут (в темноте), промывают в двух сменах дистиллированной воды, переносят в сернистую воду на 2 минуты, затем помещают в реактив Шиффа на 40 — 60 минут. Реакция проходит при комнатной температуре в темноте. Вновь промывают в трех сменах сернистой воды по три минуты в каждой, затем в двух сменах дистиллированной воды по 5 — 7 минут. Ядра докрашивают гематоксилином (см. выше), обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам. Гликоген выявляется в цитоплазме в виде глыбок красно-фиолетового цвета.

Выявление липидов позволяет обнаружить ранние признаки жировой дистрофии клеток. В токсикологическом эксперименте часто бывает достаточным выявление всех жиров и жироподобных веществ в клетке без дифференцировки их отдельных видов. Этим требованиям удовлетворяет окраска липидов Суданом III, IV или Суданом черным В, который обладает наиболее широким диапазоном окрашивания среди других судановых красителей. Для окрашивания липидов культуры ополаскивают в теплом растворе Хэнкса (37°), фиксируют в охлажденном 10 процентном нейтральном формалине 30 — 40 минут, после чего промывают водопроводной водой, помещают на 1 минуту в 70° спирт, затем в краситель на 20 минут; после окраски дифференцируют в 70° и 40° спиртах по несколько секунд в каждом, промывают в дистиллированной воде, докрашивают ядра клеток квасцовым кармином, снова промывают дистиллированной водой и заключают в глицерин-желатину. Результат: черно-синие гранулы липидов выявляются в цитоплазме клеток.

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) — митохондриальный фермент, осуществляющий окисление янтарной кислоты путем отщепления атомов водорода и их дальнейший транспорт. Гистохимическое выявление СДГ при действии токсических агентов отражает, с одной стороны, функциональное состояние митохондрий, с другой — позволяет судить о состоянии окислительно-восстановительных процессов, обеспечивающих клетку энергией.

Для выявления активности СДГ в качестве акцепторов водорода используют соли тетразолия. Восстанавливаясь, они образуют нерастворимый ярко окрашенный формазан, количество которого в клетках прямо пропорционально ферментативной активности СДГ.

Стеклышки с культурой ополаскивают в теплом растворе Хэнкса, укладывают монослоем вниз на предметное стекло, на которое предварительно нанесена инкубационная среда следующего состава: 20 мг неотетразолия, растворенного в 2 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,2 М раствора сукцината натрия и 2 мл фосфатного буфера (pH 7,6). Реакция должна проходить при минимальном доступе воздуха (в чашках Петри) при 37° — в течение 1 — 2 часов. Для прекращения реакции культуры ополаскивают 1-процентным раствором соляной кислоты, фиксируют в 10-процентном нейтральном формалине 15 — 20 минут, промывают водопроводной водой и заключают в глицерин-желатину.

Результат: в цитоплазме клеток видны синевато-фиолетовые гранулы формазана.

Фосфатазы являются гидролитическими ферментами, осуществляющими расщепление фосфорных эфиров. В зависимости от оптимума pH, при котором проявляется максимальная активность, фосфатазы делятся на кислые и щелочные. Кислая фосфатаза является одним из многочисленных ферментов лизосом; щелочная фосфатаза локализуется главным образом в микросомной фракции клеток.

Основой цитохимического выявления фосфатаз является их специфическое воздействие на соответствующий субстрат, содержащийся в инкубационной среде, и выпадение в результате этой реакции нерастворимого осадка. Принцип выявления щелочной фосфатазы методом азосочетания сводится к тому, что вследствие гидролиза ароматического эфира содержащимся в клетке ферментом освобождается ароматический радикал, который в ходе дальнейшей реакции образует нерастворимый азокраситель.

Щелочная фосфатаза. Культуры фиксируют в холодном 10-процентном нейтральном формалине 5 минут, хорошо промывают водой и помещают на 30 — 40 минут в инкубационную среду следующего состава: 0,1 М веронал-ацетатный буфер pH 9,2 — 20 мл, альфа-нафтилфосфат натрия — 20 мг, прочный красный TR — 20 мг. Среду готовят ex tempore, фильтруют непосредственно на стекло с культурой клеток. Реакция проходит при комнатной температуре. Для контроля среды одно стеклышко помещают в среду без альфа-нафтилфосфата натрия.

После инкубации культуры промывают водопроводной водой, ядра подкрашивают гематоксилином Майера 4 — 6 минут, препараты заключают в глицерин-желатину.

В местах активности фермента образуются мелкие темно-коричневого цвета гранулки, расположенные в основном в цитоплазме. В надъядерной зоне обнаруживаются лишь единичные гранулы. Наиболее высокая активность щелочной фосфатазы в клетках первичной культуры фибробластов эмбриона человека наблюдается на 4 — 5 день роста. Следует отметить высокую чувствительность фермента к действию некоторых пестицидов. В частности при воздействии на культуру медным купоросом активность фермента резко подавляется, в то время как севин существенно не влияет на его активность.

Кислая фосфатаза. Культуры фиксируют в холодном 10-процентном нейтральном формалине, время фиксации — 15 минут. Инкубируют в термостате при 37° в течение 40 — 60 минут в среде следующего состава: 0,1 М веронал-ацетатный буфер pH 4,8 — 5,0 — 20 мл, гранатовый прочный GBC — 20 мг. Дальнейшие процедуры реакции такие же, как для щелочной фосфатазы.

В местах активности фермента образуются темно-коричневые гранулы. Активность фермента в клетках культуры фибробластов эмбриона человека низкая, поэтому целесообразно проводить опыты на перевиваемых линиях.

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) выполняют в клетке ряд важнейших функций, связанных с ростом и делением клеток, хранением и передачей генетической информации, синтезом белка, регуляцией деятельности клеточных ферментов и др.

Выявление ДНК. Наиболее специфичным и распространенным методом гистохимического выявления ДНК является реакция Фельгена, основанная на мягком кислотном гидролизе тканей. Освободившиеся при этом альдегидные группировки взаимодействуют с фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа) в результате чего ДНК окрашивается в пурпурный цвет.

Постановка реакции в культурах клеток сводится к следующему. Фиксированные в жидкости Шабадаша культуры ополаскивают в 96° спирте и в холодной воде и помещают на 1 минуту в 1 н раствор соляной кислоты при комнатной температуре. Подготовленные таким образом культуры помещают в химический стакан с 1 н раствором соляной кислоты на 9 — 10 минут в водяной бане при 60 °C. В течение этого времени температура должна поддерживаться на таком уровне. По истечении времени гидролиза стеклышки ополаскивают холодным 1 н раствором соляной кислоты, промывают в двух сменах дистиллированной воды и помещают в реактив Шиффа на 3 часа (в темноте), затем вновь промывают в двух сменах дистиллированной воды. Для большей четкости гистологической картины можно докрасить цитоплазму клеток 1-процентным водным раствором светового зеленого. Для этого краситель наносят непосредственно на препарат на 25 — 30 секунд, дифференцируют в 70° спирте, обезвоживают в 96° и 100° спиртах, проводят через толуол и заключают в бальзам.

Результат: ДНК, окрашенная в красно-фиолетовый цвет, локализована исключительно в ядрах. О ее состоянии судят по интенсивности окраски ядерного вещества и по количеству окрашенных структур.

Совместное выявление ДНК и РНК методом Браше. При окраске фиксированного материала в смеси метиловый зеленый — пиронин ДНК специфически окрашивается метиловым зеленым, а РНК ядрышка и цитоплазмы — пиронином.

Перед приготовлением смеси красителей метиловый зеленый должен быть очищен от содержащейся, как правило, примеси метилового фиолетового, препятствующего элективной окраске ядер. Для этого к 100 мл водного раствора метилового зеленого добавляют 100 мл хлороформа, интенсивно взбалтывают, дают отстояться, верхний водный раствор метилового зеленого сливают и используют для приготовления смеси красителей. Процедуру отмывания повторяют несколько раз.

Рабочий раствор метилового зеленого — пиронина состоит из равных частей растворов А и Б. Для приготовления раствора А соединяют 17,5 мл 5-процентного водного раствора пиронина G или Y, 10 мл 2-процентного водного раствора метилового зеленого и 250 мл дистиллированной воды. Раствор Б представляет собой ацетатный буфер с pH 4,8.

Фиксированные в смеси Шабадаша культуры промывают 96° спиртом и водопроводной водой и помещают в предварительно нагретую смесь красителей на 30 — 60 минут при комнатной температуре. Аккуратно промокают стеклышки фильтровальной бумагой, ополаскивают в изобутиловом спирте, проводят через 2 смены толуола и заключают в бальзам.

Результат: РНК — содержащие клеточные структуры окрашены в различные оттенки красного и розового цвета, ДНК ядер — в зеленый цвет.

Для установления специфичности окрашивания РНК необходима постановка контроля с обработкой одного стеклышка рибонуклеазой (или 5-процентным раствором трихлоруксусной кислоты). При этом РНК разрушается и в препарате не должны выявляться структуры, окрашенные в красный цвет.

2.4. Определение ДНК и РНК методом люминесцентной микроскопии

Изучение действия пестицидов на ДНК и РНК можно проводить с помощью метода люминесцентной микроскопии. Для этого клетки выращивают на стеклышках. Просмотр препаратов производится через 3, 24 и 48 часов после внесения изучаемых пестицидов. Стеклышки ополаскивают средой 199, фиксируют 5 — 10 минут в свежеприготовленной смеси спирт-уксусная кислота (3:1), затем проводят через спирты нисходящей концентрации (90°, 70°, 50°, 30°) по 3 — 5 секунд в каждом и промывают водопроводной водой. Препараты высушивают при комнатной температуре и окрашивают. Для этого стеклышки с фиксированными клетками первоначально помещают на 10 минут в фосфатный буферный раствор (pH 5,6), затем на 3 минуты в раствор акридинового оранжевого (1:1000) и трижды по 1 минуте промывают буферным раствором. Далее покровное стекло помещают слоем клеток вверх на предметное стекло, наносят каплю свежего буферного раствора, покрывают покровным стеклом и исследуют в люминесцентном микроскопе.

О степени изменений ДНК и РНК судят по цвету флуоресцирующих структур и равномерности распределения их в клетке. В норме для ДНК характерно зеленое свечение. При наличии изменений цвет меняется на светло-зеленый, желто-зеленый, желтый, РНК в цитоплазме контрольных культур светится красно-оранжевым или ярко-красным цветом. Под влиянием пестицидов свечение становится темно-красным, почти черным.

В норме распределение нуклеиновых кислот в клетках обычно равномерное. Под воздействием пестицидов в ядрах хроматиновая сеть становится разреженной, в них появляются мелкие или крупные гранулы зеленого цвета. Для РНК отсутствие свечения имеет место по периферии клетки, занимая 1/2 — 1/4 часть цитоплазмы.

Для количественной характеристики степени повреждения нуклеиновых кислот подсчитывают число измененных и неизмененных клеток в 10 полях зрения (как правило, всего 200 — 250 клеток), полученные данные пересчитывают на 100 клеток (проц.). Цитотоксичность регистрируют по описанной выше балльной системе.

3. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПЕСТИЦИДОВ НА МИТОТИЧЕСКИЙ РЕЖИМ КУЛЬТУР КЛЕТОК

Сущность митоза как наиболее распространенного способа репродукции клеток заключается в равномерном распределении генетического материала между дочерними клетками.

В митотическом цикле клетки митоз занимает сравнительно небольшой отрезок времени, однако с точки зрения цитопатологии он представляет огромный интерес. Это связано с тем, что во время митоза появляются, по существу, все основные нарушения синтетических процессов, возникающие в интерфазе под влиянием химических и других экстремальных факторов. Следовательно, комплексное изучение митотического режима органов и тканей, а также культур эксплантированных клеток может дать ценную информацию не только о степени цитотоксичности ядохимикатов, но и о их влиянии на наследственные структуры клеток.

Процесс митоза принято разделять на 4 стадии: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.

В ряде случаев для суждения о соотношении фаз митоза бывает достаточным определение коэффициента фаз, представляющего собой частное от деления суммы про- и метафаз на сумму ана- и телофаз.

3.2. Качественный и количественный анализ патологии митоза

Данные качественного и количественного анализа патологии митоза являются основными показателями состояния митотического режима культур клеток при действии пестицидов.

По современной классификации (И.А. Алов, 1965, 1976) патологические митозы подразделяются на три группы: I — патология митоза, связанная с повреждением хромосом (хромосомные и хроматидные мосты, отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам, фрагментация и пульверизация хромосом, образование микроядер и др.); II — патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата (к-митозы, рассеивание хромосом в метакинезе, многополюсный митоз, трехгрупповая метафаза и др.); III — патология митоза, связанная с нарушением цитотомии. Изучение патологии митоза в объеме указанной классификации дает возможность судить о состоянии всего репродуктивного аппарата клеток, в том числе и хромосом как носителей генетической информации.

Ниже проводится краткое описание форм патологии митоза, наиболее часто наблюдаемых при действии пестицидов на культуру фибробластов эмбриона человека.

Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам. В основе нарушения движения хромосом лежит повреждение кинетохора или снижение его функциональной активности. В некоторых случаях отставание хромосом может быть обусловлено изменениями микротрубочек, связанных с кинетохорами. Исходом этой формы патологии может быть случайное попадание отставшей хромосомы в одно из дочерних ядер или ее элиминация. В некоторых случаях, особенно при множественных отставаниях, отставшие хромосомы формируют дополнительное микроядро. При любом исходе этот вид патологии приводит к формированию клеток с несбалансированным набором хромосом.

Фрагментация — один из основных видов повреждения хромосом при действии пестицидов. Фрагменты могут быть одиночными и множественными. Следует отметить, что не всегда возможно отличить хромосомный фрагмент от отставшей хромосомы, в связи с чем эти два вида патологии митоза можно учитывать совместно.

Судьба фрагментов хромосом различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, элиминироваться из клетки или, случайно воссоединяясь, приводить к различным типам хромосомных аберраций (обменам, инверсиям, транслокациям).

Мосты являются следствием разрывов хромосом или хроматид с последующим воссоединением фрагментов, содержащих центромер. Образовавшаяся дицентрическая хромосома испытывает воздействие обоих митотических центров, растягивается между ними и образует мост. Мосты бывают одиночные и множественные, хромосомные и хроматидные. Кроме того, мосты могут образовываться вследствие слипания хромосом. Такие мосты отличаются тем, что в центре нити, формирующей мост, имеется четкое утолщение. В телофазе мосты довольно быстро рвутся, однако в следующем поколении клеток они могут вновь восстанавливаться.

Колхициновый митоз (к-митоз) — форма патологии, типичная для статмокинетических веществ. Развитие к-митоза связано с повреждением митотического аппарата клетки (микротрубочек) и сопровождается гиперспирализацией, а иногда и фрагментацией хромосом. Различают несколько видов к-метафаз. При обработке первичной культуры фибробластов эмбриона человека пестицидами наиболее часто встречается комковатая к-метафаза (хромосомы склеены в комковатое неправильной формы тельце). Эта форма патологии митоза обычно заканчивается пикнозом ядра и гибелью клетки. Реже наблюдаются метафазы с рассеянными по всей цитоплазме хромосомами. Такие формы, как «шар-метафаза», «звезда-метафаза», «псевдоанафаза» встречаются в единичных случаях. Исходом к-митоза является гибель клетки, реже — полиплоидизация или восстановление нормального течения митоза.

Трехгрупповая метафаза обусловлена повреждением кинетохоров либо дезорганизацией нитей веретена деления. При этой форме в клетке наряду с экваториальной пластинкой содержатся еще две дополнительные группы хромосом, расположенные у полюсов. Трехгрупповые метафазы приводят к анэуплоидии или к образованию многоядерной клетки.

Многополюсный митоз является следствием избыточной репродукции центриолей. При этом вместо двух образуются три или более дочерних клетки. Следствием этой формы патологии деления является образование клеток с анэуплоидными наборами хромосом.

Микроядра — это небольшие дополнительные образования, сформировавшиеся из отставших хромосом или их групп. При действии пестицидов микроядра наблюдаются в метафазе, анафазе и телофазе. По-видимому, такие клетки чаще всего погибают. Микроядра могут элиминироваться из клетки.

Остальные формы патологии (пульверизация хромосом, раннее разделение хроматид, моноцентрический и асимметрический митозы, неравномерная цитотомия и др.) при действии пестицидов встречаются очень редко и в процессе анализа могут быть объединены в группу «прочие формы патологии митоза».

При анализе патологических митозов встречаются погибающие делящиеся клетки, особенно при действии токсических доз пестицидов. Такие клетки обычно уменьшены в размерах, клеточная оболочка четко обозначена, образует выросты, цитоплазма клеток гомогенная, резко эозинофильная, митотические фигуры деформированы. Эти клетки трудно отнести к какому-либо виду патологии, их целесообразно учитывать отдельно как дегенерирующие митозы.

Регистрация патологических митозов осуществляется при иммерсионном увеличении микроскопа. Для этого в каждом препарате изучают 100 митотических фигур, и информацию о каждой делящейся клетке заносят в соответствующую графу регистрационного журнала, отмечая фазу деления и вид патологии, если она имеется. При этом удобно пользоваться клавишным счетчиком для подсчета форменных элементов крови. Ниже приведена форма регистрационной таблицы, которая может быть изменена в зависимости от индивидуальных особенностей патологии митоза при действии различных пестицидов.

Цифровые материалы обрабатывают общепринятыми методами статистической обработки (В.Ю. Урбах, 1964; Д. Сепетлиев, 1968).

4. МЕТОД ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ФИБРОБЛАСТОВ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ХРОМОСОМНОГО АНАЛИЗА

Для изучения мутагенной активности пестицидов обычно используется культура лимфоцитов периферической крови человека. Этот метод детально разработан и многократно апробирован. Значительно реже применяется культура первичных фибробластов эмбриона человека.

Вместе с тем, при проведении комплексных исследований, предусмотренных настоящими методическими рекомендациями, наиболее предпочтительным тест-объектом является именно культура фибробластов эмбриона человека. Сопоставление данных, полученных в результате морфологических, цитохимических и люминесцентно-микроскопического исследований (с учетом длительности и интенсивности воздействия), с данными цитогенетического анализа даст возможность оценить влияние пестицидов на различные стороны жизнедеятельности клетки и, таким образом, составить цельное представление о механизме взаимодействия яда с клеткой. Кроме того, культура ФБЧ имеет ряд преимуществ перед культурой лимфоцитов. В первую очередь на этом тест-объекте можно изучить влияние мутагена на любую стадию клеточного цикла, что весьма существенно, учитывая их неодинаковую чувствительность. Хромосомный анализ культуры ФБЧ может оказаться незаменимым методом исследования плодов женщин (абортного материала), имеющих профессиональный контакт с пестицидами. Немаловажным является и то, что для получения препаратов хромосом не требуется обработка культур дефицитными митогенами.

Для хромосомного анализа культуры выращивают на покровных стеклах. При выборе доз пестицидов и длительности экспозиции учитывают, в первую очередь, результаты предварительно проведенного анализа патологических митозов, ориентируясь при этом на время максимального эффекта и минимальные концентрации пестицидов. В основу приведенного ниже метода положена общепринятая методика приготовления хромосомных препаратов из культур лимфоцитов периферической крови с некоторыми модификациями, касающимися главным образом дозы колхицина и длительности обработки им. Опыт показал, что 2 — 3-часовая обработка культуры фибробластов человека колхицином в дозе 0,25 — 0,5 мкг/мл, применяемая обычно для получения хромосомных препаратов, не приводит к накоплению достаточного количества метафаз, в то же время появляются явные признаки дегенерации клеток. Оптимальные результаты получаются при следующих условиях постановки опыта. Раствор колхицина готовится на среде 199 или Игла в рабочей концентрации 1 мкг/мл среды. За 10 — 12 часов до конца экспозиции пестицида (на ночь) в каждый флакон в стерильных условиях вводят по 1 капле раствора колхицина, не меняя среду. Конечная концентрация колхицина в питательной среде равна 0,025 мкг/мл.

Глазным пинцетом стекла с культурами переносят в широкий химический стакан с предварительно нагретым до 37 °C гипотоническим раствором хлористого калия (555 мг KCl на 100 мл дистиллированной воды). Длительность гипотонической обработки — 30 минут при 37 °C. После этого прикосновением края стекла к чистой марле максимально удаляют гипотонический раствор и культуры фиксируют в смеси метанол-уксусной кислоты (3:1) 1 час при 4 °C. Затем переносят в свежий фиксатор, в котором культуры могут находиться в течение 3 — 5 дней. Перед приготовлением препаратов необходимо произвести смену фиксатора (на 15 — 20 минут).

Стеклышки сушат над электрической плиткой с открытой спиралью. Высушенные препараты можно хранить в течение нескольких месяцев и более.

Для окрашивания препаратов можно применять ацеторсеин, синьку по Унна или стандартный краситель Романовского — Гимза. Последний дает более четкое окрашивание хромосом. Перед окраской препараты смачивают водой, помещают в свежеприготовленный раствор красителя Романовского — Гимза (1 мл краски на 10 мл воды) на 15 — 20 минут (под контролем микроскопа), ополаскивают водой и сушат на воздухе. Окрашенные препараты наклеивают бальзамом на предметные стекла монослоем вверх. Исследование хромосом и учет хромосомных аберраций проводят по методу, описанному в методических рекомендациях Института медицинской генетики АМН СССР (1974), а также в ряде руководств по генетике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алов И.А. Патология митоза (Формы патологии, классификация, количественная характеристика). Вестник АМН СССР, 1965, 11, 58 — 66.

2. Алов И.А. Элементы патологии клетки. Цитология, ВИНИТИ, М., 1976.

3. Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.И., Семенов С.Ф., Степанова Л.Г. Культура тканей в вирусологических исследованиях. М., 1962.