Методические указания по определению этрела и его производных (гидрела, дигидрела) в яблоках, огурцах, томатах, зерне злаков, семенах хлопчатника и хлопковом масле методом газожидкостной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 27.09.1978 № 1918-78)

27 сентября 1978 г. № 1918-78

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЭТРЕЛА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ (ГИДРЕЛА, ДИГИДРЕЛА) В ЯБЛОКАХ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЗЕРНЕ ЗЛАКОВ, СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА И ХЛОПКОВОМ МАСЛЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

---

<*> Разработаны К.Ф. Новиковой, Т.В. Алдошиной, Ф.Р. Мельцер (ВНИИХСЗР).

    Краткая   характеристика   препарата.   Этрел   (этефон)   -  препарат,
действующим   началом   которого  является   2-хлорэтилфосфоновая  кислота.
Брутто-формула   C H O ClP.    Молекулярная    масса  144,5.   Общепринятое

              2 6 3

название - кампозан. Представляет  собой  твердое кристаллическое  вещество
белого  цвета с  т. пл.  74 - 76 °C.  Быстро  растворяется  в  гидрофильных
растворителях,  в  воде,  спирте.  В  водных  растворах  при  pH  ниже  3,5
стабилен,   при   pH   выше  3,5   разлагается.   Препарат   гигроскопичен.
Применяется  в сельском хозяйстве в качестве регулятора роста растений.
    К  производным  этрела  относятся  гидрел и дигидрел. Это отечественные
препараты,  рекомендуемые  для  применения  в  качестве  регуляторов  роста

растений.

    Брутто-формула   гидрела   C H  O N CL P .    Молекулярная   масса 321.
                                4 16 6 2  2 2
Брутто формула  дигидрела C H  O N Cl P .   Молекулярная   масса   349. Эти
                           6 20 6 2  2 2
вещества   хорошо   растворяются   в   воде  и  спиртах.  В  ацетоне  могут

разлагаться с отщеплением гидразина.

ДСД гидрела 0,003 мг/кг; МДУ в картофеле, томатах, огурцах, яблоках, черешне, мандаринах, хлопковом масле, семенах хлопчатника 0,15 мг/кг. ДСД этрела 0,006 мг/кг; МДУ в томатах, огурцах, зерне хлебных злаков 0,5 мг/кг.

Принцип метода. Метод основан на извлечении этрела из анализируемого объекта метанолом, а производных этрела — смесью метанола с ацетоном (1:1), этерификации с помощью диазометана, очистке экстракта перераспределением метилового эфира хлорэтилфосфоновой кислоты из водной фазы в этилацетат с последующим газохроматографическим определением с применением ТИД.

Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения 1 нг в 3 мкл хроматографируемой пробы. Предел определения 0,15 мг/кг (огурцы, томаты, яблоки) и 0,5 мг/кг (семяна злаковых, хлопчатника и хлопковое масло). Среднее значение определения для овощей и фруктов 79,9%, для семян злаковых, хлопчатника и хлопкового масла — 63,8%. Стандартное отклонение для овощей и фруктов +/- 7,1%, для семян хлопчатника и хлопкового масла +/- 4,9%. Доверительный интервал среднего (при p = 0,95 и n = 5) для овощей и фруктов +/- 7,1, для семян злаковых, хлопчатника и хлопкового масла +/- 4,9%.

Реактивы и растворы. Метанол х.ч. Этанол х.ч. Ацетон х.ч. Гексан х.ч. Серный эфир абсолютированный. Этилацетат х.ч., свежеперегнанный. Хлороводородная кислота, 10-процентный раствор в метаноле. Едкое кали х.ч., чешуированное. Едкое кали, 50-процентный раствор в воде. Нитрозометилмочевина. Диазометан свежеприготовленный. Нитрит натрия х.ч. Метиламин, 24-процентный водный раствор. Мочевина х.ч. Хлорид натрия х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Стандартные растворы этрела, гидрела и дигидрела в метаноле и ацетоне с содержанием 100 и 10 мкг/мл. Хлорид кальция безводный. Серная кислота 1 н.

Для получения абсолютного серного эфира серный эфир сушат над безводным хлоридом кальция в течение нескольких дней (12 г хлорида кальция на 100 мл эфира). Эфир фильтруют в колбу для перегонки растворителей, туда же помещают мелко нарезанные кусочки металлического натрия и перегоняют эфир в приемник, снабженный алонжем и хлоркальциевой трубкой.

Для получения нитрозометилмочевины во взвешенную колбу вместимостью 1 л наливают 200 г (1,5 М) 24-процентного водного раствора метиламина и добавляют концентрированную хлороводородную кислоту до кислой реакции по метилкрасному (около 150 мл). Затем добавляют до 500 г дистиллированную воду и 300 г 5 М мочевины. Полученный раствор осторожно кипятят с обратным холодильником при умеренном нагревании в течение 3 ч. Усиливают нагрев и кипятят энергично еще 15 мин. Раствор охлаждают до комнатной температуры и растворяют в нем 110 г (1,5 М) нитрита натрия. Охлаждают раствор до 0 °C в смеси льда с хлоридом натрия.

В стакане вместимостью 3 л готовят смесь из 600 г льда и 100 г 1 н концентрированной серной кислоты. К раствору при охлаждении стакана в смеси льда с хлоридом натрия медленно приливают при помешивании механической мешалкой холодный раствор метилмочевины и нитрита натрия. Температура раствора не должна подниматься выше 0 °C. Нитрозометилмочевина всплывает на поверхность в виде кристаллов. Кристаллы отфильтровывают и отсасывают под вакуумом, затем размешивают их с 50 мл холодной воды до образования пасты и снова отсасывают. Сушат кристаллы в вакуумном эксикаторе до постоянной массы. Выход 105 — 115 г. Хранить нитрозометилмочевину нужно в темной склянке в холодильнике, так как под действием света и тепла она может взорваться.

Вещество ядовито! Следует избегать попадания на кожу.

Диазометан (т. кип. 24 °C) — взрывчатое и очень ядовитое вещество. Целесообразно получать его только в растворах. Растворы даже на холоде устойчивы лишь в течение нескольких дней. Лучше всего их использовать свежеприготовленными. Сосуд с диазометаном нужно закрывать корковой пробкой и хранить в холодильнике. В круглодонную колбу вместимостью 500 мл помещают 30 мл 50-процентного водного раствора едкого кали и 100 мл абсолютированного серного эфира. Смесь охлаждают льдом до 5 °C, после чего при взбалтывании через химическую воронку небольшими порциями добавляют 10,3 г (0,1 М) нитрозометилмочевины. Колбу присоединяют к обратному холодильнику, противоположный конец которого снабжен алонжем, проходящим через резиновую или корковую пробку с двумя отверстиями и погруженным в 40 мл абсолютированного серного эфира, находящегося в конической колбе вместимостью 200 мл. Приемная колба погружена в охлаждающую смесь льда и соли. Реакционную колбу переносят в водяную баню, нагретую до 40 °C, и перегоняют образующийся диазометан, время от времени взбалтывая содержимое колбы. Отгонку диазометана прекращают, как только дистиллят в холодильнике становится бесцветным. Обычно это наступает после того, как отогнаны 2/3 эфира. Ни в коем случае нельзя отгонять весь эфир! Оставшиеся на дне колбы перекисные соединения взрывоопасны!

Приборы и посуда. Хроматограф «Цвет-106» или аналогичный, снабженный ТИД. Стеклянные колонки длиной 1 м с внутренним диаметром 3,5 мм. Механический встряхиватель. Делительные воронки на 100 мл. Ротационный вакуумный испаритель. Установка для получения диазометана. Колбы: круглодонные на 500 мл со шлифом; плоскодонные на 250 мл со шлифом; грушевидные на 25 мл; конические на 100 мл; мерные на 100 мл. Мерные цилиндры. Пробирки градуированные на 5 мл. Пипетки на 2; 5 и 10 мл. Микрошприцы вместимостью 10 мкл.

Ход анализа. Экстракция. Измельченные яблоки (10 г) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 г безводного сульфата натрия и 70 мл метанола — для извлечения этрела или смеси метанола с ацетоном (1:1) — для извлечения гидрела или дигидрела. Смесь встряхивают на механическом встряхивателе 30 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу и повторяют экстракцию тем же количеством растворителя в течение 30 мин. К объединенному экстракту добавляют 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле и отгоняют растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 35 °C до объема 5 — 10 мл. К остатку приливают эфирный раствор диазометана до появления постоянного желтого цвета. Обычно требуется 10 — 13 мл свежеприготовленного раствора метилирующего реагента.

Колбу прикрывают корковой пробкой и оставляют в покос на 15 — 20 мин. Избыток диазометана отгоняют на ротационном испарителе без нагревания. Остаток (10 мл) смывают метанолом в делительную воронку на 100 мл. Полученный объем вдвое разбавляют дистиллированном водой, прибавляют 5 — 7 г хлорида натрия и 20 мл гексана. Энергично встряхивают смесь несколько секунд. Дают слоям разделиться, нижний слой переносят в делительную воронку, а верхний, гексановый, отбрасывают. Метиловый эфир хлорэтилфосфоновой кислоты экстрагируют из водной фазы этилацетатом порциями 20 мл и еще два раза по 10 мл. Этилацетатный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия в течение 10 — 20 мин., фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл и отгоняют растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 30 — 35 °C до 1 — 1,5 мл. Остаток количественно переносят в градуированную пробирку и доводят объем до 5 мл этилацетатом. В хроматограф вводят 3 мкл полученного раствора. Если раствор до хроматографирования должен стоять более 1 ч, нужно держать его на холоде.

К 10 г измельченного образца огурцов, томатов добавляют 100 г безводного сульфата натрия и 70 мл соответствующего экстрагента. Экстракцию проводят так же, как из яблок. Экстракт сушат над 30 г безводного сульфата натрия, фильтруют в колбу прибора для отгонки растворителя, добавляют 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле и отгоняют растворитель до объема 10 мл. Проводят метилирование. После удаления избытка диазометана остаток смывают метанолом в делительную воронку, разбавляют вдвое водой, добавляют 5 — 7 г хлорида натрия и 20 мл гексана. Смесь энергично встряхивают, дают слоям разделиться, нижний водный слой переносят в другую делительную воронку, а гексановый слой отбрасывают. Эту операцию повторяют еще два раза порциями по 10 мл. Метиловый эфир хлорэтилфосфоновой кислоты экстрагируют из водной фазы этилацетатом по 20; 10 и 10 мл. Далее поступают так же, как с образцом яблок.

Навеску размолотых семян злаковых и хлопчатника (10 г) помещают в круглодонную колбу на 500 мл, заливают 100 мл смеси метанола с ацетоном (1:1). Содержимое колбы встряхивают 30 мин. на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу. Экстракцию проводят еще дважды тем же растворителем порциями по 100 мл. К объединенному экстракту добавляют 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле и отгоняют растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 15 — 20 мл. Колбу с экстрактом помещают в испаритель холодильника на 5 — 6 ч, предварительно закрыв пробкой. Охлажденный раствор фильтруют через бумажный фильтр, который содержит 5 — 7 г безводного сульфата натрия. Стенки колбы обмывают охлажденным метанолом, который также пропускают через фильтр. В фильтрат добавляют 25 мл высушенного серного эфира, содержимое колбы тщательно перемешивают. Через несколько минут к фильтрату снова добавляют 15 мл серного эфира. Выпавший белый осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Фильтрат упаривают до объема 10 мл. К раствору приливают 2 мл абсолютного метилового спирта и 25 мл свежеприготовленного диазометана. Неплотно закрыв колбу корковой пробкой, оставляют раствор на 30 — 40 мин. Затем отгоняют избыток диазометана на ротационном вакуумном испарителе без обогрева колбы. Остаток (10 мл) переносят метанолом в делительную воронку и далее экстракт очищают по такой же схеме, как образец яблок.

Навеску хлопкового масла (10 г) помещают в делительную воронку на 100 мл. Производные этрела трижды экстрагируют из масла этиловым спиртом порциями по 30 мл. Объединенный спиртовой экстракт помещают в круглодонную колбу на 200 мл и отгоняют растворитель до объема 15 — 20 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя, предварительно добавив в него 0,5 мл 10-процентного раствора хлороводородной кислоты в метаноле. Колбу с экстрактом помещают в испаритель холодильника на 5 — 6 ч и далее проводят такие же операции, как с семенами хлопчатника.

Условия хроматографирования. Хроматограф «Цвет-106» с ТИД. Скорость -10 протяжки ленты самописца 0,33 см/мин. Рабочая шкала электрометра 10 x 10

А.  Стеклянная колонка длиной 1 м, диаметром 3,5 мм заполнена хромосорбом W
(100  -  120  меш),  промытым  кислотой и силанизированным DMCS с 5% SE-30.
Температура  колонки  110  °C,  испарителя  140  °C. Скорость газа-носителя

(азота) 40 мл/мин., водорода — 18 — 20 мл/мин., воздуха — 180 — 200 мл/мин. Время удерживания эфира в этих условиях 2 мин. 15 сек. В хроматограф вводят 3 мкл раствора. Линейность детектирования сохраняется в пределах 1 — 20 нг.

Альтернативная колонка. Стеклянная колонка длиной 1,2 м с внутренним диаметром 3 мм. Заполнена хроматоном N-AW-HCDS (0,16 — 0,20 мм) с 10% полипропиленгликоль адипината. Температура колонки 170 °C, испарителя — 200 °C. Скорость потока газа-носителя (азота) 75 мл/мин., водорода — 18 — 20 мл/мин., воздуха — 200 мл/мин. Время удерживания эфира в этих условиях 2 мин. 45 с.

Приготовление стандартов для сравнения с рабочей пробой. В ряд грушевидных колб вносят различное количество стандартных растворов этрела (гидрела, дигидрела) с содержанием 10 мкг/мл. Растворы доводят до 2 мл метанолом, приливают 5 — 6 мл эфирного раствора диазометана и, закрыв пробкой, оставляют на 15 мин. в покое. Избыток диазометана отгоняют на ротационном вакуумном испарителе без нагрева. Остаток смывают метанолом в делительную воронку, разбавляют вдвое водой, добавляют 5 — 7 г хлорида натрия и экстрагируют метиловый эфир хлорэтилфосфоновой кислоты этилацетатом порциями 20 мл, затем два раза по 10 мл. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре бани 30 — 35 °C до объема 1 — 1,5 мл. Остаток количественно переносят в градуированную пробирку и доводят объем раствора до 5 мл этилацетатом. В хроматограф вводят 3 мкл полученного раствора.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом соотношения со стандартами по высоте пиков. Содержание действующего вещества в анализируемой пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                                  H C  V
                                   п ст

X = ------, H V P ст а

где:

H — высота пика анализируемой пробы, мм; п

H — высота пика стандарта, мм; ст

C — содержание анализируемого вещества в стандарте, нг; ст

V — объем конечного раствора, из которого отбирают пробу для хроматографирования, мл (5 мл);

V — объем аликвоты, которую вводят в хроматограф, мкл (3 мкл); а

P — навеска анализируемого образца, г (10 г).

Требования безопасности. Следует соблюдать правила безопасности при работе с серным эфиром. Перегонку эфира необходимо вести на водяной бане. Полное отсутствие открытого огня в помещении! Отгонять эфир полностью нельзя, так как в колбе остаются взрывоопасные перекисные соединения. Соблюдать меры безопасности при работе с нитрозометилмочевиной и диазометаном. Работу проводить под тягой, в перчатках.

---