Библиотека
Скачать PDF

Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина M1 в молоке, сухом молоке и сыре с помощью тест-системы «Ridascreen fast aflatoxin M1», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

Министерство здравоохранения Российской Федерации · № 17ФЦ/3739Действующий акт

(утв. Минздравом РФ 30.11.2004 № 17ФЦ/3739)

Утверждаю
Главный врач
Федерального центра
госсанэпиднадзора
Минздрава России,
Председатель
Лабораторного совета
Госсанэпидслужбы России
Е. Н. Беляев

30 ноября 2004 г. № 17ФЦ/3739

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ АФЛАТОКСИНА M1 В МОЛОКЕ, СУХОМ МОЛОКЕ И СЫРЕ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «RIDASCREEN FAST AFLATOXIN M1», ПРОИЗВОДСТВА ФИРМЫ R-BIOPHARM AG, ГЕРМАНИЯ

1. Разработано: ООО «Стайлаб»; Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждены.

3. Вводится впервые.

    Настоящие     методические    рекомендации    устанавливают    методику
экспресс-определения  содержания  афлатоксина  M   в молоке, сухом молоке и
                                            1

сыре методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Предел обнаружения афлатоксина M : 1

в молоке и сухом молоке 0,000005 мг/кг;

в сыре 0,00005 мг/л.

1. Общие положения

Афлатоксины принадлежат к канцерогенным, высокотоксичным продуктам жизнедеятельности плесневых грибов рода Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus.

    Афлатоксин  M   является  метаболитом  афлатоксина  B   и  выделяется с
                 1                                       1

молоком коровы, которой скармливали корма, содержащие афлатоксин B . 1

Афлатоксин M не разрушается при пастеризации молока, поэтому его 1 необходимо контролировать не только в молоке, но также и в готовых молочных продуктах.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования»

безопасности  и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно
допустимые  концентрации  афлатоксина  M   0,0005 мг/л (500 ppt) в молоке и
                                    1

0,00002 мг/л (20 ppt) в продуктах детского питания на молочной основе. В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Набор Ridascreen Fast Aflatoxin M представляет собой тест-систему для 1

иммуноферментного   анализа   в   комплекте   с   необходимыми  реагентами,
выпускается  серийно и предназначен для экспресс определения афлатоксина M
                                                                      1

в молоке, сухом молоке и сыре.

2. Метод измерений

В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.

Поставляемый  в  комплекте  набора  планшет  сенсибилизирован  антителами к
афлатоксину   M .  Анализ  выполняется  следующим  образом.  Исследуемые  и
           1

стандартные  образцы  дозируются  в  лунки  активированного  планшета.  При
инкубации планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксина  M
                                                                      1

связываются антителами к афлатоксину M на поверхности планшета. После 1

отмывки   планшета   в   лунки  дозируется  препарат,  содержащий  конъюгат
афлатоксина  M   с  ферментом.  Во  время  следующей  инкубации  происходит
          1

иммуносорбция на поверхность лунок планшета уже конъюгата к афлатоксину M . 1 На очередной стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные (неадсорбированные) молекулы конъюгата. После промывки планшета в его лунки

дозируется  раствор,  содержащий субстрат и хромоген. В процессе  инкубации
при  химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный
фрагмент  молекулы  конъюгата,  связанной на поверхности лунки, выступает в
качестве   катализатора,  образуются  окрашенные  продукты  реакции.  После

определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

    Оптическая плотность в лунках, измеренная на  ИФА-анализаторе  (ридере)
при   450   нм,  обратно  пропорциональна  концентрации  афлатоксина  M   в
                                                                   1

исследуемых образцах.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации афлатоксина M 1 применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

3.1. Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104

Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50 мкл 8-канальные автоматические пипетки на 50 и 250 мкл

3.2. Реактивы

Тест-система RIDASCREEN FAST Aflatoxin M для иммуноферментного анализа 1 в стандартной комплектации, включая: микротитровальный планшет на 96 (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами к афлатоксину M ; 1

комплект стандартных растворов афлатоксина M в молочном буфере объемом 1 1,3 куб. см со следующими концентрациями: 0 нг/л (нулевой стандарт), 5 нг/л, 10 нг/л, 20 нг/л, 40 нг/л, 80 нг/л; конъюгат афлатоксина M с пероксидазой (красная крышка) объемом 3 см; 1

субстрат (зеленая крышка), содержащий пероксид карбамида, объемом 7 куб. см;

хромоген (голубая крышка), содержащий тетраметилбензидин, объемом 7 куб. см;

стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 № раствор серной к-ты, объемом 14 куб. см.;

буфер 1 (белая крышка) для разбавления проб объемом 20 куб. см;

буфер 2 (белая крышка) для разбавления конъюгата объемом 12 куб. см;

состав для приготовления моющего буфера: 10 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 0,05% твина;

инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

логарифмическую бумагу; дистиллированная (или деионизированная) вода ГОСТ 6709. Только для сыра: метанол; н-Гептан; дихлорметан. Для приготовления фосфатного буфера:

дигидрофосфат натрия (x H O) 0,55 г; 2

гидрофосфат натрия (x 2H O) 2,85 г; 2 хлорид натрия 9 г.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Центрифуга эффективностью 3500 g, с центрифужными пробирками;

колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 100 куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91;

пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками;

воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336;

фильтровальная бумага «красная лента»;

пипетки-пастерки;

лабораторный шейкер (только для сыра);

испаритель (только для сыра);

наконечники для автоматических пипеток;

ванночки для реагентов;

листовая фильтровальная бумага;

разовые резиновые перчатки;

тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичный афлатоксин M . 1 При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

5. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

6. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

    температура воздуха            20 - 25 °C;
    атмосферное давление           84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);
    влажность воздуха              не более 80% при температуре 25 °C;
    напряжение в сети              220 +/- 10 В;
    частота переменного тока       50 +/- 1 Гц.

7. Подготовка к проведению анализа

7.1 Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодном темном месте.

7.2 Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 — 25 °C). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы афлатоксина M поставляются 1 готовыми для использования.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.

Приготовление раствора конъюгата. Конъюгат афлатоксина M с ферментом 1 (флакон с красной крышкой) поставляется в концентрированном виде. Поскольку

разбавленный  раствор  конъюгата  имеет  ограниченную стабильность, следует
готовить  раствор  по  потребности.  Перед  разбавлением концентрированного
раствора   конъюгата   осторожно   встряхните   содержимое   флакона.   Для
приготовления   готового   к  использованию  раствора  конъюгата  разбавьте
концентрат  конъюгата буферным раствором N 2, имеющимся в комплекте набора,

в отношении 1:10 (например, смешайте 400 мкл концентрата конъюгата с 4 куб. см буфера, данного разведения достаточно для 4-х стрипов).

Приготовление моющего буферного раствора. Набор содержит пакетик с солью. Для приготовления моющего буфера растворите содержимое пакетика в 1 л дистиллированной воды. Готовый буферный раствор может храниться при 4 °C в течение 4 недель.

7.3 Пробоподготовка

7.1 Молоко

7.1.1. Разлейте пробы молока в центрифужные пробирки и центрифугируйте в течение 10 мин. при 10 °C и ускорении 3500 g. При отсутствии в лаборатории центрифуги с охлаждением перед центрифугированием охладите пробы до 10 °C.

7.1.2. С помощью пипетки Пастера и резиновой лабораторной груши удалите верхний жирный слой.

7.1.3 Для анализа используют 100 мкл снятого молока.

7.2 Сухое молоко.

7.2.1 Взвесьте 10 г сухого молока и поместите навеску в колбу.

7.2.2. Добавьте в колбу 100 куб. см дистиллированной или деионизованной воды и перемешивайте раствор в течение 5 мин.

7.2.3 Далее следуйте пп. 7.1.1 - 7.1.3.

7.3 Сыр

7.3.1. Представительную пробу сыра следует тщательно растереть и перемешать без добавления жидкости. Участки сыра с плесенью следует отделить от пробы, чтобы исключить возможные мешающие влияния на результаты анализа.

7.3.2 Поместите 2 г сыра в центрифужную стеклянную пробирку.
7.3.3 Добавьте 40 куб. см дихлорметана.
7.3.4 Встряхивайте пробирку в течение 15 мин.
7.3.5 Отфильтруйте суспензию.
7.3.6 Испарите 10 куб. см экстракта в слабом токе азота при 60 °C.

7.3.7. Растворите жирный остаток в смеси 0,5 куб. см метанола, 0,5 куб. см фосфатного буфера, добавьте в пробирку 1 куб. см гептана, энергично встряхните.

7.3.8 Центрифугируйте в течение 15 мин. при 15 °C и ускорении 2700 g.
7.3.9 Удалите верхний гептановый слой.

7.3.10. С помощью пипетки Пастера осторожно отберите нижний водно-метанольный слой.

7.3.11. К аликвоте 100 мкл добавьте 400 мкл буфера № 1 (разбавление 1:5 до концентрации метанола 10%).

7.3.12 Для анализа используют 100 мкл раствора.

8. Выполнение измерений

8.1 Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN FAST:

  • немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;
  • иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;
  • в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;
  • воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;
  • на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2 Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок — по две лунки на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. — стандарты, Пр. — пробы):

Стрип 1 Стрип 2 Стрип 3 Стрип 4 Стрип 5 Стрип 6 Стрип 7 Стрип 8 Стрип 9 Стрип 10 Стрип 11 Стрип 12
Ст. 1 Ст. 1 Пр. 3 Пр. 3 Пр. 11 Пр. 11 Пр. 19 Пр. 19 Пр. 27 Пр. 27 Пр. 35 Пр. 35
Ст. 2 Ст. 2 Пр. 4 Пр. 4 Пр. 12 Пр. 12 Пр. 20 Пр. 20 Пр. 28 Пр. 28 Пр. 36 Пр. 36
Ст. 3 Ст. 3 Пр. 5 Пр. 5 Пр. 13 Пр. 13 Пр. 21 Пр. 21 Пр. 29 Пр. 29 Пр. 37 Пр. 37
Ст. 4 Ст. 4 Пр. 6 Пр. 6 Пр. 14 Пр. 14 Пр. 22 Пр. 22 Пр. 30 Пр. 30 Пр. 38 Пр. 38
Ст. 5 Ст. 5 Пр. 7 Пр. 7 Пр. 15 Пр. 15 Пр. 23 Пр. 23 Пр. 31 Пр. 31 Пр. 39 Пр. 39
Ст. 6 Ст. 6 Пр. 8 Пр. 8 Пр. 16 Пр. 16 Пр. 24 Пр. 24 Пр. 32 Пр. 32 Пр. 40 Пр. 40
Пр. 1 Пр. 1 Пр. 9 Пр. 9 Пр. 17 Пр. 17 Пр. 25 Пр. 25 Пр. 33 Пр. 33 Пр. 41 Пр. 41
Пр. 2 Пр. 2 Пр. 10 Пр. 10 Пр. 18 Пр. 18 Пр. 26 Пр. 26 Пр. 34 Пр. 27 Пр. 42 Пр. 42
8.2.4 Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 100 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 60 мин. в темноте.

8.2.9. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета, осторожно и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.10. С помощью дозатора наполните лунки по 250 мкл моющего буферного раствора и снова вылейте жидкость. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.11. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 100 мкл готового раствора конъюгата в каждую лунку.

8.2.12. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 60 мин. в темноте.

8.2.13. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующий добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета, осторожно и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.14. С помощью дозатора наполните лунки по 250 мкл моющего буферного раствора и снова вылейте жидкость. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.15. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл субстрата в каждую лунку.

8.2.16. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл хромогена в каждую лунку.

8.2.17. Перемешайте вручную, соблюдая осторожность, и инкубируйте при комнатной температуре (20 — 25 °C) в течение 30 минут в темноте.

8.2.18. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте.

8.2.19. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

9. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)

------------------------------------------------- x 100 = % поглощения Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

    По  величинам  относительного  поглощения,  вычисленным для стандартных
растворов, и  соответствующим значениям концентрации афлатоксина M  в нг/кг
                                                              1

строится  калибровочная  кривая  в  полулогарифмической  системе координат.
Калибровочная  кривая  должна  быть  почти линейна в диапазоне 10 - 40 нг/л

(см. рис. 1 — не приводится).

Концентрация афлатоксина M в исследуемых растворах в нг/кг считывается 1

по   калибровочной   кривой   соответственно   относительному   поглощению,
измеренному  и  вычисленному  для  этих растворов. Положительные результаты
количественного    определения    концентрации   афлатоксина   M    следует
                                                            1

подтверждать с помощью хроматографических методов.

Внимание:

Для того чтобы вычислить концентрацию афлатоксина M в исследуемой 1 исходной пробе, величину концентрации афлатоксина M , полученную по 1 калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления.

При работе в соответствии с настоящей методикой фактор разбавления принимает следующие значения:

    Молоко/сухое молоко       1
    Сыр                       10.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.