Методические рекомендации по экспресс-определению дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерновых культурах, солоде и кормах с помощью тест-системы «Ridascreen Fast Don», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

(утв. Минздравом России 30.11.2004 № 17ФЦ/3738)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ, СОЛОДЕ И КОРМАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «RIDASCREEN FAST DON», ПРОИЗВОДСТВА ФИРМЫ R-BIOPHARM AG, ГЕРМАНИЯ

1. Разработаны: ООО «Стайлаб», Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждено.

3. Вводится впервые.

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина, ДОН) в зерновых культурах, солоде и кормах методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Диапазон определяемых концентраций дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерновых культурах, солоде и кормах 0,0015 — 0,005 мг/кг при навеске 0,005 кг.

1. Общие положения

Дезоксиниваленол (ДОН) принадлежит к токсичным микотоксинам трихоцетеновой группы, образующихся в результате жизнедеятельности плесневых грибов рода Fusarium.

Так, например, заметные концентрации дезоксиниваленола, а также 3-ацетил- и 15-ацетил-деоксиниваленола обычно наблюдаются в зерновых культурах, культивируемых в Северной Америке, России и европейских странах. Содержание дезоксиниваленола в пшенице, кукурузе и рисе часто может достигать уровня 1 мг/кг и более, что в связи с цитотоксическими и иммунодепрессивными свойствами этого микотоксина представляет собой серьезную угрозу здоровью как человека, так и животных.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» устанавливает предельно допустимые концентрации ДОН 0,7 — 1,0 мг/л.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Набор Ridascreen Fast Don представляет собой тест-систему для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускается серийно и предназначен для экспресс-определения дезоксиниваленола в зерновых культурах, солоде и кормах.

2. Метод измерений

Принцип работы тест-систем Ridascreen Fast Don основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами «захвата», специфичными к антителам к микотоксинам. Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые (стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела к микотоксинам и препарат, содержащий конъюгат микотоксинов с ферментом дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы микотоксинов и молекулы конъюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к микотоксинам. В то же самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами «захвата» на поверхности.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации микотоксинов в исследуемых образцах.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

4.1. Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104

Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50 мкл

8-канальные автоматические пипетки на 50 и 250 мкл

Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 1000 куб. см ГОСТ 1770

Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью 100 куб. см ГОСТ 1770

Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 1 куб. см ГОСТ 29227.

4.2. Реактивы

Тест-система RIDASCREEN FAST Don для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 или 96 лунок (6 или 12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами «захвата».

Комплект стандартных растворов дезоксиниваленола (вомитоксина) в воде объемом 1,3 куб. см, со следующими концентрациями, данными с учетом разбавления пробы: 0 мкг/л (нулевой стандарт), 0,222 мг/л, 0,666 мг/л, 2 мг/л, 6 мг/л.

Антитела к дезоксиниваленолу (черная крышка) объемом 3 куб. см (6 куб. см для 96 лунок).

Конъюгат дезоксиниваленола с пероксидазой (красная крышка) объемом 3 куб. см (6 куб. см для 96 лунок).

Состав для приготовления 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,4), содержащий 0,05% твина 20.

Субстрат/хромоген (белая крышка) подкрашенный раствор объемом 6 куб. см (12 куб. см для 96 лунок).

Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 № раствор серной к-ты, объемом 6 куб. см.

Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках.

Логарифмическую бумагу.

Дистиллированная (или деионизированная) вода, ГОСТ 6709.

4.3. Вспомогательные устройства и материалы

Мельница для размола сыпучих продуктов.

Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 250 куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91.

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками.

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336.

Фильтровальная бумага «красная лента».

Гомогенизатор Ultra-Turrax (дополнительно).

Лабораторный шейкер (дополнительно).

Наконечники для автоматических пипеток.

Ванночки для реагентов.

Листовая фильтровальная бумага.

Разовые резиновые перчатки.

Тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

5. Требования безопасности

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

5.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

5.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные микотоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

5.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

5.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

6. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

7. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

    Температура воздуха            20 - 25 °C;
    Атмосферное давление           84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);
    Влажность воздуха              не более 80% при температуре 25 °C;
    Напряжение в сети              220 +/- 10 В;
    Частота переменного тока       50 +/- 1 Гц.

8. Подготовка к проведению анализа

8.1 Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

8.2 Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 — 25 °C). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы дезоксиниваленола поставляются готовыми для использования. Величина концентрации дезоксиниваленола, нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой, без последующих расчетов.

Приготовление 10 мМ фосфатного буферного раствора. В мерную колбу на 1000 куб. см переносят содержимое пакетика с буферным составом и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при температуре 4 °C — 4 недели.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.

8.3 Пробоподготовка

8.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов.

8.2. Взвешивают 5 г размолотой пробы, переносят в колбу на 250 куб. см с притертой пробкой, приливают в колбу 100 куб. см дистиллированной воды.

8.3. Энергично встряхивают колбу с навеской и водой в течение 3 минут или гомогенизируют с помощью лабораторного шейкера.

8.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа «красная лента».

8.5 Для анализа используют 50 мкл раствора.

9. Выполнение измерений

9.1 Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCRIN FAST:

• после использования немедленно охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;
• иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;
• в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;
• воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;
• на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется помещать планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

9.2 Проведение измерений

9.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок — по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

9.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.

9.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу как это показано на рисунке (Ст. — стандарты, Пр. — пробы):

Стрип 1	Стрип 2	Стрип 3	Стрип 4	Стрип 5	Стрип 6
Ст. 1	Пр. 4	Пр. 12	Пр. 20	Пр. 28	Пр. 36
Ст. 2	Пр. 5	Пр. 13	Пр. 21	Пр. 29	Пр. 37
Ст. 3	Пр. 6	Пр. 14	Пр. 22	Пр. 30	Пр. 38
Ст. 4	Пр. 7	Пр. 15	Пр. 23	Пр. 31	Пр. 39
Ст. 5	Пр. 8	Пр. 16	Пр. 24	Пр. 32	Пр. 40
Пр. 1	Пр. 9	Пр. 17	Пр. 25	Пр. 33	Пр. 41
Пр. 2	Пр. 10	Пр. 18	Пр. 26	Пр. 34	Пр. 42
Пр. 3	Пр. 11	Пр. 19	Пр. 27	Пр. 35	Пр. 43

9.2.4 Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

9.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

9.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

9.2.7. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

9.2.8. Используя каждый раз свежий наконечник пипетки, добавьте по 50 мкл препарата конъюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 9.2.3).

9.2.9. Быстро добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител (желательно использовать многоканальную пипетку).

9.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин. (+/- 1 мин.). Не встряхивайте планшет во время инкубации!

9.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующий добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

9.2.12. С помощью дозатора или промывалки наполните лунки по 250 мкл дистиллированной воды или моющим буфером (при исследовании пшеницы и продуктов, содержащих пшеницу, используйте только моющий буфер) и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

9.2.13. Быстро добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку.

9.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 3 минут (+/- 0,5 мин.) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!

9.2.15. Добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте.

9.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

10. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)

------------------------------------------------- х 100 = % поглощения Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации дезоксиваленола в мг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат (не приводится).

Искомая концентрация дезоксиваленола в исследуемых растворах в мг/кг считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации ДОН следует подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.

---