Методические рекомендации по экспресс-определению микотоксинов в зерновых культурах, кормах и орехах с помощью тест-систем «Ridascreen fast», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

Министерство здравоохранения Российской Федерации · № 17ФЦ/3737Действующий акт

(утв. Минздравом России 30.11.2004 № 17ФЦ/3737)

Утверждаю
Главный врач
Федерального центра
госсанэпиднадзора
Минздрава России,
Председатель
Лабораторного совета
Госсанэпидслужбы России
Е. Н. Беляев

30 ноября 2004 г. № 17ФЦ/3737

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ, КОРМАХ И ОРЕХАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМ «RIDASCREEN FAST», ПРОИЗВОДСТВА ФИРМЫ R-BIOPHARM AG, ГЕРМАНИЯ

1. Разработано: ООО «Стайлаб»; Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждено.

3. Вводится впервые.

    Настоящие     методические    рекомендации    устанавливают    методику
экспресс-определения   содержания   следующих   микотоксинов:  зеараленона,
Т-2 токсина,  суммы  афлатоксинов  B ,  B ,  G ,  G   в зерновых культурах,
                                    1    2    1    2

комбикормах и орехах методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Диапазоны определяемых концентраций микотоксинов приведены в таблице:

№ п/п	Микотоксин	Диапазон определяемых концентраций <*>	Загрязняемые культуры
1.	SUM AT-B , B , G , G 1 2 1 2	0,0017 — 0,045 мг/кг	Зерновые культуры, корма, орехи
2.	Т-2 токсин	0,05 — 0,4 мг/кг	Зерновые культуры, корма
3.	Зеараленон (Ф-2)	0,05 — 0,4 мг/кг	Зерновые культуры, корма

<*> Диапазон определяемых концентраций при навеске образца 5 г.

1. Общие положения

    Микотоксинами  называют  группу  высокотоксичных канцерогенных веществ,
образующихся  в  результате  жизнедеятельности плесневых грибов Aspergillus

flavus, Aspergillus parasiticus и Fusarium. Так, например, афлатоксин B , а 1

также  афлатоксины  B ,  G ,  G   часто  могут  быть  обнаружены в зерновых
                     2    1    2
культурах,  кукурузе,  хлопковом  семени  и орехах. Продовольственное сырье
довольно  часто  бывает  загрязнено Т-2 токсином, однако распространенность
продуцентов   Т-2   токсина   и   уровень  загрязнения  сильно  зависит  от
региональной    специфики.    Т-2    токсин   обладает   цитотоксичными   и
иммунодепрессивными  свойствами  и  является  серьезным  фактором риска для
здоровья  сельскохозяйственных  животных  и  человека.  Зеараленон,  будучи
"растительным   гормоном",  обладающим  эстрогенными  свойствами,  вызывает
нарушения  репродуктивной  функции животных, в том числе - свиней, лошадей,
крупного    и   мелкого   рогатого   скота,   с   клиническими   признаками
гиперэстрогенизма,    наиболее   выраженного   у   свиней.   С   продуктами
растительного  происхождения  зеараленон  может попадать также и в организм

человека.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования»

безопасности  и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно
допустимые  концентрации  зеараленона  и  Т-2  токсина  - 0,1 - 1,0 мг/кг в
зерновых культурах и кормах. Сумма афлатоксинов B , B , G , G  в Российской
                                                 1   2   1   2

Федерации не нормируется.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы RIDASCREEN FAST представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения микотоксинов в зерновых культурах, комбикормах и орехах.

2. Метод измерений

Принцип работы тест-систем RIDASCREEN FAST основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами «захвата», специфичными к антителам к микотоксинам.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к микотоксинам, и препарат, содержащий конъюгат микотоксинов с ферментом, последовательно дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы микотоксинов и молекулы конъюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к микотоксинам. В то же самое время, при инкубации происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами «захвата» на поверхности.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации микотоксинов в исследуемых образцах.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

3.1. Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104

Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50 мкл

8-канальные автоматические пипетки на 50 и 250 мкл

Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 100 куб. см ГОСТ 1770

Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью 50 куб. см и 100 куб. см ГОСТ 1770

Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 1 куб. см ГОСТ 29227

3.2. Реактивы

Тест-система RIDASCREEN FAST для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами «захвата».

Комплект стандартных растворов микотоксинов в водном растворе метанола, объемом 1,3 куб. см, со следующими концентрациями:

Сумма афлатоксинов 0 мкг/л (нулевой стандарт), 1,7 мкг/л, 5 мкг/л, 15 мкг/л, 45 мкг/л,

Зеараленон 0 мкг/л (нулевой стандарт), 50 мкг/л, 100 мкг/л, 200 мкг/л, 400 мкг/л,

Т-2 токсин 0 мкг/л (нулевой стандарт), 50 мкг/л, 100 мкг/л, 200 мкг/л, 400 мкг/л.

Антитела к микотоксинам (черная крышка) объемом 3 куб. см.

Конъюгат микотоксинов с пероксидазой (красная крышка) объемом 3 куб. см.

Субстрат/хромоген (белая крышка) — подкрашенный раствор объемом 6 куб. см.

Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 № раствор серной к-ты, объемом 6 куб. см.

Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках.

Логарифмическую бумагу.

Метанол, ч.д.а. ГОСТ 6995-77

Дистиллированная (или деионизированная) вода ГОСТ 6709

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Мельница для размола сыпучих продуктов

Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50 (100) куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага «красная лента»

Наконечники для автоматических пипеток

Ванночки для реагентов

Листовая фильтровальная бумага

Разовые резиновые перчатки

Тара для лабораторных отходов

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные микотоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной микотоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

5. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

6. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

температура воздуха                20 - 25 °C;
атмосферное давление               84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);
влажность воздуха                  не более 80% при температуре 25 °C;
напряжение в сети                  220 +/- 10 В;
частота переменного тока           50 +/- 1 Гц.

7. Подготовка к проведению анализа

7.1 Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

7.2 Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 — 25 °C). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы микотоксинов поставляются готовыми для использования. Величина концентрации микотоксинов, нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 70%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 100 куб. см помещают 70 куб. см метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.

7.3 Пробоподготовка

7.3.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов.

7.3.2. Взвешивают 5 г размолотой пробы, переносят в колбу с притертой пробкой, приливают 25 куб. см 70%-го водного раствора метанола.

7.3.3. Тщательно встряхивают колбу в течение трех минут (рекомендуется использовать аппарат для встряхивания).

7.3.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа «красная лента».

7.3.5. Смешивают в пробирке 1 куб. см фильтрата и 1 куб. см дистиллированной воды.

7.3.6 Для анализа используют 50 мкл раствора.

8. Выполнение измерений

8.1 Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN FAST:

немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;
иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;
в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;
воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;
на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2 Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок — по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. — стандарты, Пр. — пробы):

Стрип 1	Стрип 2	Стрип 3	Стрип 4	Стрип 5	Стрип 6
Ст. 1	Пр. 4	Пр. 12	Пр. 20	Пр. 28	Пр. 36
Ст. 2	Пр. 5	Пр. 13	Пр. 21	Пр. 29	Пр. 37
Ст. 3	Пр. 6	Пр. 14	Пр. 22	Пр. 30	Пр. 38
Ст. 4	Пр. 7	Пр. 15	Пр. 23	Пр. 31	Пр. 39
Ст. 5	Пр. 8	Пр. 16	Пр. 24	Пр. 32	Пр. 40
Пр. 1	Пр. 9	Пр. 17	Пр. 25	Пр. 33	Пр. 41
Пр. 2	Пр. 10	Пр. 18	Пр. 26	Пр. 34	Пр. 42
Пр. 3	Пр. 11	Пр. 19	Пр. 27	Пр. 35	Пр. 43

8.2.4 Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл препарата конъюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.3).

8.2.9. Таким же образом добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.

8.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию в темном месте при комнатной температуре в течение 10 мин. (+/- 1 мин.). Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.12. При помощи многоканальной пипетки или специальной промывалки наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости, как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.13. Как можно быстрее добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку (лучше использовать многоканальную пипетку).

8.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут (+/- 0,5 мин.) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.15. Быстро добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте (лучше также использовать многоканальную пипетку).

8.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

9. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)

------------------------------------------------- x 100 = % поглощения Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат (не приводится).

Концентрация микотоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации микотоксинов следует подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.