Библиотека
Скачать PDF

Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина В1 в зерновых культурах и орехах с помощью тест-системы «AFLAPLATE», производства фирмы R-Biopharm Rhone Ltd, Великобритания

Министерство здравоохранения Российской Федерации · № 17ФЦ/3736Действующий акт

(утв. Минздравом России 30.11.2004 № 17ФЦ/3736)

Утверждаю
Главный врач
Федерального центра
госсанэпиднадзора
Минздрава России,
Председатель
Лабораторного совета
Госсанэпидслужбы России
Е. Н. Беляев
30 ноября 2004 г. № 17ФЦ/3736

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ АФЛАТОКСИНА В1 В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ И ОРЕХАХ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «AFLAPLATE», ПРОИЗВОДСТВА ФИРМЫ

R-BIOPHARM RHONE LTD, ВЕЛИКОБРИТАНИЯ

1. Разработаны: ООО «Стайлаб»; Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждено.

3. Вводятся в первые.

    Настоящие     Методические    рекомендации    устанавливают    методику
экспресс-определения  содержания  афлатоксина  B   в  зерновых  культурах и
                                            1

орехах методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Диапазон определяемых концентраций афлатоксина B в зерновых культурах 1 и орехах 0,0015 — 0,0050 мг/кг.

1. Общие положения

    Афлатоксинами  называют  группу  высокотоксичных канцерогенных веществ,
образующихся  в  результате  жизнедеятельности плесневых грибов Aspergillus
flavus  и Aspergillus  parasiticus. Так, например, афлатоксин B  может быть
                                                           1

обнаружен в зерновых культурах и орехах.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования»

безопасности  и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно
допустимые  концентрации  афлатоксина B  0,005 мг/кг в зерновых культурах и
                                   1

орехах.

В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

    Набор  AFLAPLATE  представляет собой тест-систему для иммуноферментного
анализа  в  комплекте  с  необходимыми  реагентами,  выпускается  серийно и
предназначен для экспресс-определения афлатоксина B  в зерновых культурах и
                                               1

орехах.

2. Метод измерений

    Принцип   работы  тест-системы  AFLAPLATE  основан  на  методе  прямого
конкурентного  иммуноферментного  анализа (ИФА). В основе процедуры анализа
лежит  взаимодействие  антигенов с антителами. Афлатоксин B  экстрагируется
                                                       1

из   размолотой   пробы   водно-метанольным   раствором,   экстракт   затем
фильтруется.   Фильтрат   смешивается   с   препаратом  конъюгата  (токсин,
помеченный  ферментом).  Смесь  фильтрата с конъюгатом переносится в лунки,
покрытые  антителами  к  токсину. При инкубации молекулы токсина и молекулы
конъюгата,  конкурируя  между  собой, связываются антителами на поверхности

лунок.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата и другие несвязанные молекулы.

После промывки в лунки дозируется раствор, содержащий субстрат. В процессе инкубации развивается цветная реакция, в которой ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой субстрат окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

    Оптическая  плотность  в лунках, измеренная на планшетном фотометре при
450  нм,  обратно пропорциональна концентрации афлатоксина B  в исследуемых
                                                        1

образцах.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации афлатоксина B 1 применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

3.1. Средства измерений

Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с ГОСТ 24104 наибольшим пределом взвешивания 200 г

Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 100 мкл

8-канальные автоматические пипетки на 100 и 250 мкл

Градуированные мерные цилиндры на 250 куб. см ГОСТ 1770

3.2. Реактивы

Тест-система AFLAPLATE для иммуноферментного анализа, включая:

48 микротитровальных лунок, сенсибилизированных моноклональными антителами;

48 микротитровальных белых лунок для смешения реагентов;

6 стандартных растворов афлатоксина B по 0,8 куб. см со следующими 1 концентрациями, данными с учетом разбавления пробы: 0 (нулевой стандарт); 1,5; 5; 10; 20 и 50 мкг/л;

конъюгат (красная этикетка) объемом 11 куб. см;

субстрат, ТМБ (голубая этикетка) объемом 15 куб. см;

2%-ный раствор серной кислоты — стоп-реагент (желтая этикетка) объемом 15 куб. см;

концентрирующий моющий буфер (зеленая этикетка) объемом 20 куб. см;

инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

логарифмическую бумагу;

Метанол, ч.д.а ГОСТ 6995

Хлорид натрия

Дистиллированная (или деионизированная) вода ГОСТ 6709

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Мельница для размола сыпучих продуктов

Высокоскоростной блендер с кувшином на 1 л (для использования с растворителями) или лабораторный шейкер

Колбы конические со шлифом и притертой пробкой на 250 (50) куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага «белая лента»

Наконечники для автоматических пипеток

Ванночки для реагентов

Листовая фильтровальная бумага

Разовые резиновые перчатки

Тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-системы AFLAPLATE:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 — 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Поскольку субстрат и стандартные растворы светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с этими растворами.

В случае окрашивания субстрата не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора субстрата является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,8, это также может быть признаком порчи реагентов.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные афлатоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование, кувшин блендера (лабораторный шейкер) и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5%-ном растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10%-ный раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до рН 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

5. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

6. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Температура воздуха 20 — 25 °С;

Атмосферное давление 84,0 — 106,7 кПа (630 — 800 мм. рт. ст.);

Влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С;

Напряжение в сети 220 + 10 В;

Частота переменного тока 50 +/- 1 Гц

7. Подготовка к проведению анализа

7.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

7.2. Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 — 25°С). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы афлатоксина поставляются готовыми для использования. Величина концентрации афлатоксина, нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 60%-ного раствора метанола. В мерную колбу на 250 куб. см помещают 150 куб. см метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.

Приготовление буферного раствора. Приготовьте буферный раствор, смешивая 1 часть концентрированного буфера (зеленая этикетка) и 24 части дистиллированной воды. На каждый стрип из 8 лунок требуется примерно 50 куб. см готового буферного раствора. Готовый буфер может храниться в течение 6 месяцев при 4 °С.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °С.

7.3. Пробоподготовка

7.3.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов до размера частиц 0,85 мм.

7.3.2. Навеску размолотой пробы массой 50 г смешивают в блендере с 4 г хлорида натрия и 250 куб. см 60%-ного раствора метанола.

7.3.3 Перемешивают 1 мин. на высокой скорости.

7.3.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа «белая лента».

7.3.5 Фильтрат готов для постановки иммуноферментной реакции.
7.3.6 Для анализа используют 100 мкл фильтрата.

8. Выполнение измерений

8.1 Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы AFLAPLATE:

  • После использования немедленно охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;
  • В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;
  • Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;
  • На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется помещать планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2 Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок белого цвета для смешения растворов — по одной лунке на каждую пробу и 6 лунок — для стандартных растворов. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество прозрачных лунок с антителами — по одной лунке на каждую пробу и 6 лунок — для стандартных растворов. Поместите лунки в рамку.

8.2.3. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °С.

8.2.4. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. — стандарты, Пр. — пробы, показаны только прозрачные лунки):

Стрип 1 Стрип 2 Стрип 3 Стрип 4 Стрип 5 Стрип 6
Ст. 1 Пр. 3 Пр. 11 Пр. 19 Пр. 27 Пр. 35
Ст. 2 Пр. 4 Пр. 12 Пр. 20 Пр. 28 Пр. 36
Ст. 3 Пр. 5 Пр. 13 Пр. 21 Пр. 29 Пр. 37
Ст. 4 Пр. 6 Пр. 14 Пр. 22 Пр. 30 Пр. 38
Ст. 5 Пр. 7 Пр. 15 Пр. 23 Пр. 31 Пр. 39
Ст. 6 Пр. 8 Пр. 16 Пр. 24 Пр. 32 Пр. 40
Пр. 1 Пр. 9 Пр. 17 Пр. 25 Пр. 33 Пр. 41
Пр. 2 Пр. 10 Пр. 18 Пр. 26 Пр. 34 Пр. 42

8.2.5. Пометьте лунки с антителами, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.6. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.7. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.8. Внесите по 100 мкл конъюгата (красная этикетка) в белые лунки смешения.

8.2.9. Используя каждый раз свежий наконечник пипетки, добавьте по 100 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки смешения согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.5).

8.2.10. С помощью 8-канальной пипетки на 100 мкл перемешайте растворы в лунках, набирая растворы в наконечники и выпуская их обратно в лунки 3 раза подряд (для каждого стрипа из 8 лунок используйте свежие наконечники!). При использовании автоматических пипеток всегда старайтесь избежать образования пузырьков в лунках.

8.2.11 Поменяйте наконечники.

8.2.12. Перенесите по 100 мкл растворов из лунок смешения в соответствующие лунки с антителами.

8.2.13. Перемешайте растворы в лунках с антителами, передвигая рамку с лунками по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.14. Извлеките из рамки лунки смешения (белого цвета) и поместите их в раствор для деконтаминации.

8.2.15. Прозрачные лунки с антителами поставьте на 15 мин. в темное место при комнатной температуре для инкубации. Несоблюдение времени инкубации в процессе постановки иммуноферментного анализа может привести к недостоверным результатам!

8.2.16. После инкубации вылейте содержимое лунок в деконтаминирующий раствор.

8.2.17. С помощью промывалки (или 8-канальной пипетки на 250 мкл) заполните лунки готовым моющим буфером и снова опорожните лунки.

8.2.18. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующий добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.19 Повторите процедуру отмывки еще 4 раза.

8.2.20. Отберите необходимый объем субстрата (голубая этикетка) из флакона в чистую ванночку для реагентов (на 1 стрип требуется 1 куб. см).

8.2.21. С помощью 8-канальной пипетки перенесите из ванночки по 100 мкл субстрата в каждую лунку с антителами.

8.2.22. Перемешайте растворы в лунках, передвигая рамку по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.23 Инкубируйте лунки в течение 20 мин. в темноте.

8.2.24. Отберите необходимый объем стоп-раствора (желтая этикетка) из флакона в новую чистую ванночку для реагентов (на 1 стрип требуется 1 куб. см).

8.2.25. С помощью 8-канальной пипетки с новыми наконечниками перенесите из ванночки по 100 мкл стоп — раствора в каждую лунку.

8.2.26. Перемешайте растворы в лунках, передвигая рамку по гладкой поверхности быстрыми поступательными движениями.

8.2.27 Протрите донышки лунок фильтровальной бумагой.

8.2.28. В течение 5-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

9. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

          Оптическая плотность лунки
            со стандартом (пробой)

-------------------------- х 100 = % поглощения. Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом

    По  величинам  относительного  поглощения,  вычисленным для стандартных
растворов  и соответствующим значениям концентрации афлатоксина B  в мкг/кг
                                                             1

(ppb), строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат (диаграмма — не приводится).

    Концентрация  афлатоксинов  в  исследуемых  растворах  в  мкг/кг  (ppb)
считывается   по   калибровочной   кривой   соответственно   относительному
поглощению,  измеренному  и  вычисленному для этих растворов. Положительные
результаты  количественного определения концентрации афлатоксина B  следует
                                                              1

подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.