Методические рекомендации по экспресс-определению афлатоксина M1 в молоке и сухом молоке с помощью тест-системы «Ridascreen Fast Aflatoxin M1», производства фирмы R-Biopharm AG, Германия
(утв. Минздравом РФ 30.11.2004 № 17ФЦ/3735)
Утверждаю
Главный врач
Федерального центра
госсанэпиднадзора
Минздрава России,
Председатель
Лабораторного совета
Госсанэпидслужбы России
Е. Н. Беляев
30 ноября 2004 г. № 17ФЦ/3735
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ АФЛАТОКСИНА M1 В МОЛОКЕ И СУХОМ МОЛОКЕ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «RIDASCREEN FAST AFLATOXIN M1», ПРОИЗВОДСТВА ФИРМЫ R-BIOPHARM AG, ГЕРМАНИЯ
1. Разработаны: ООО «Стайлаб», Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс- определения содержания афлатоксина M в молоке и сухом молоке методом
1
иммуноферментного анализа (ИФА).
Диапазон определяемых концентраций афлатоксина M в молоке и сухом 1 молоке 0,00025 — 0,00200 мг/л.
1. Общие положения
Афлатоксины принадлежат к канцерогенным, высокотоксичным продуктам жизнедеятельности плесневых грибов рода Aspergillus flavus и Aspergillus
parasiticus.
Афлатоксин M является метаболитом афлатоксина B и выделяется с 1 1
молоком коровы, которой скармливали корма, содержащие афлатоксин B . 1
Афлатоксин M не разрушается при пастеризации молока, поэтому его 1 необходимо контролировать не только в молоке, но также и в термообработанных молочных продуктах.
В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования»
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно допустимые концентрации афлатоксина M 0,0005 мг/л в молоке и 0,00002 мг/л
1
в продуктах детского питания на молочной основе.
В последнее время в целях скрининга за рубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).
Набор Ridascreen Fast Aflatoxin M представляет собой тест-систему для 1
иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускается серийно и предназначен для экспресс-определения афлатоксина M
1
в молоке и сухом молоке.
2. Метод измерений
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами "захвата", специфичными к иммуноглобулину IgG, в свою очередь,
полученному путем иммунизации афлатоксином M . Анализ выполняется следующим 1 образом. Исследуемые (стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела к
афлатоксину M , и препарат, содержащий конъюгат афлатоксина M с ферментом,
1 1
дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в
течение определенного времени молекулы афлатоксина M и молекулы конъюгата,
1
конкурируя между собой, связываются антителами к афлатоксину M . В то же 1 самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами «захвата» на поверхности.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на ИФА-анализаторе (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации афлатоксина M в
1
исследуемых образцах.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.
3.1 Средства измерений
Спектрофотометр для ИФА (ридер) с фильтром на 450 нм
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104
Одноканальные автоматические пипетки, объем дозирования 50 мкл
8-канальные автоматические пипетки на 50 и 250 мкл.
3.2 Реактивы
Тест-система RIDASCREEN FAST Aflatoxin M для иммуноферментного анализа 1 в стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 48 (6 по 8 лунок), сенсибилизированный антителами «захвата».
Комплект стандартных растворов афлатоксина M в молоке объемом 1 1,3 куб. см, со следующими концентрациями: 0 нг/л (нулевой стандарт), 250 нг/л, 500 нг/л, 1000 нг/л, 2000 нг/л.
Антитела к афлатоксину M (черная крышка) объемом 3 куб. см. 1
Конъюгат афлатоксина M с пероксидазой (красная крышка) объемом 1 3 куб. см.
Субстрат/хромоген (белая крышка) подкрашенный раствор объемом 6 куб. см.
Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 № раствор серной к-ты, объемом 12 куб. см.
Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках.
Дистиллированная (или деионизированная) вода, ГОСТ 6709.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Центрифуга эффективностью 3500 g, с центрифужными пробирками.
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 100 куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91.
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками.
Наконечники для автоматических пипеток.
Листовая фильтровальная бумага.
Тара для лабораторных отходов.
Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.
Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.
В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.
Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.
4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.
4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичный афлатоксин M . 1 При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.
4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.
4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.
5. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.
6. Условия измерений
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Температура воздуха 20 - 25 °C. Атмосферное давление 84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.). Влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C. Напряжение в сети 220 +/- 10 В. Частота переменного тока 50 +/- 1 Гц.
7. Подготовка к проведению анализа
7.1 Отбор проб
Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.
7.2 Подготовка реактивов и материалов
Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 — 25 °C). Это займет около 1 часа.
Стандартные растворы. Стандартные растворы афлатоксина M поставляются 1 готовыми для использования. Величина концентрации афлатоксина M , 1
нанесенная на флаконы с растворами, дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения
может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.
Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.
7.3 Пробоподготовка
7.1 Молоко
7.1.1. Разлейте пробы молока в центрифужные пробирки и центрифугируйте в течение 10 мин. при 10 °C и ускорении 3500 g. При отсутствии в лаборатории центрифуги с охлаждением перед центрифугированием охладите пробы до 10 °C.
7.1.2. С помощью пипетки Пастера и резиновой лабораторной груши удалите верхний жирный слой.
7.1.3 Для анализа используют 50 мкл снятого молока.
7.2 Сухое молоко
7.2.1 Взвесьте 10 г сухого молока и поместите навеску в колбу.
7.2.2. Добавьте в колбу 100 куб. см дистиллированной или деионизованной воды и перемешивайте раствор в течение 5 мин.
7.2.3 Далее следуйте пп. 7.1.1 - 7.1.3.
8. Выполнение измерений
8.1 Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCRIN FAST:
- немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;
- иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;
- в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;
- воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;
- на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.
8.2 Проведение измерений
8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок — по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.
8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.
8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу как это показано на рисунке (Ст. — стандарты, Пр. — пробы):
| Стрип 1 | Стрип 2 | Стрип 3 | Стрип 4 | Стрип 5 | Стрип 6 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ст. 1 | Пр. 4 | Пр. 12 | Пр. 20 | Пр. 28 | Пр. 36 |
| Ст. 2 | Пр. 5 | Пр. 13 | Пр. 21 | Пр. 29 | Пр. 37 |
| Ст. 3 | Пр. 6 | Пр. 14 | Пр. 22 | Пр. 30 | Пр. 38 |
| Ст. 4 | Пр. 7 | Пр. 15 | Пр. 23 | Пр. 31 | Пр. 39 |
| Ст. 5 | Пр. 8 | Пр. 16 | Пр. 24 | Пр. 32 | Пр. 40 |
| Пр. 1 | Пр. 9 | Пр. 17 | Пр. 25 | Пр. 33 | Пр. 41 |
| Пр. 2 | Пр. 10 | Пр. 18 | Пр. 26 | Пр. 34 | Пр. 42 |
| Пр. 3 | Пр. 11 | Пр. 19 | Пр. 27 | Пр. 35 | Пр. 43 |
8.2.4 Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.
8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.
8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).
8.2.7. Используя каждый раз свежий наконечник пипетки, добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки.
8.2.8. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл препарата конъюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.3).
8.2.9. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.
8.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 10 мин (+/- 1 мин.). Не встряхивайте планшет во время инкубации!
8.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета, осторожно и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.
8.2.12. С помощью дозатора или промывалки наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.
8.2.13. Добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку.
8.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут (+/- 0,5 мин.) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!
8.2.15. Добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте.
8.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.
9. Обработка результатов измерений
Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
Оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)
------------------------------------------------- х 100 = % поглощения. Оптическая плотность лунки с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации афлатоксина M в нг/л
1
строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат (не приводится).
Концентрация афлатоксина M в исследуемых растворах в нг/кг считывается 1
по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации афлатоксина M следует
1
подтверждать с помощью хроматографических методов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.