Методические указания по унифицированному методу микробиологического определения в объектах окружающей среды биологических инсектицидных препаратов на основе кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис
(утв. Минздравом СССР 31.07.1973 № 1112-73, 18.10.1977 № 1796-77)
18 октября 1977 г. № 1796-77
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО УНИФИЦИРОВАННОМУ МЕТОДУ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНСЕКТИЦИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КРИСТАЛЛОСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ВИДА БАЦИЛЛА ТУРИНГИЕНЗИС <*>
<*> Разработаны В.И. Мурзой (ВНИИГИНТОКС) взамен «Определения энтобактерина в капусте, яблоках и смородине» (разработчик С.А. Ивашина) 31.07.73 № 1112.73; «Микробиологического метода определения энтобактерина в воздухе рабочей зоны» (разработчик В.И. Мурза) 31.07.73 № 1112-73 и «Методических указаний по определению гомелина в объектах окружающей среды микробиологическим методом» (разработчик В.И. Мурза) 18.10.77 № 1796-77.
Настоящие Методические указания распространяются на микробиологический метод определения содержания бактериальных инсектицидных препаратов (лепидоцид, инсектин, гомелин, битоксибациллин, БИП, дипел и т.п.) в воздухе, на растениях, в почве, воде и других объектах окружающей среды при санитарном контроле.
Краткая характеристика препаратов. Бактериальные инсектицидные препараты состоят из энтомоцидного компонента (споры, токсины и другие продукты жизнедеятельности кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис) — 10 — 60% и инертного наполнителя (каолин, хлористый натрий и т.п.) — 40 — 90%. Препараты представляют собой мелкодисперсные порошки аморфной структуры серого или коричневого цвета. Имеют слабый специфический запах. В воде образуют малостойкую суспензию. Споры бацилл турингиензис и термостабильный бета-экзотоксин выдерживают длительное кипячение, а кристаллоиды белоксодержащего эндотоксина разрушаются при температуре 60 °C и выше.
Бациллы турингиензис не развиваются и не размножаются в теплокровном организме, безопасны в эпидемиологическом отношении.
Бактериальные инсектицидные препараты малотоксичны — ЛД для 50
белых мышей, крыс и морских свинок при введении в желудок более 5 г/кг. Раздражающее и аллергенное действие препаратов не
исключается.
Препараты применяются в качестве инсектицидов кишечного действия. Высокоэффективны в борьбе с пяденицами, совками, листовертками, огневками и другими насекомыми на полевых, садовых
культурах и лесонасаждениях.
Утвержденные или рекомендованные предельно допустимые уровни загрязнения объектов окружающей среды бактериальными инсектицидными препаратами составляют: ПДК в воздухе рабочей зоны 4 7
- 10 — 10 микробных тел (м.т.) в 1 куб. м; в атмосферном
4 5
воздухе населенных пунктов - 3,0 x 10 - 1,5 x 10 м.т./куб. м; в
7 8
воде водоемов санитарно-бытового водопользования - 10 - 10
м.т./л; в почве - нет необходимости нормировать; МДУ в пищевых
7 8
продуктах - 10 - 10 м.т./кг.
Принцип метода. Метод основан на получении смыва с фильтрующего материала, растений и посеве его на плотную питательную среду, выращивании бацилл турингиензис при оптимальной температуре, идентификации и подсчете выросших колоний, расчете содержания препарата в исследуемом объекте.
Метрологическая характеристика метода. Диапазон определения 2 8 концентраций - от 3 x 10 до 3 x 10 м.т./мл. Предел обнаружения 2 6
- 2 x 10 м.т./куб. м воздуха; 2 x 10 м.т./кг пищевого продукта
и т.п. Среднее значение определения стандартных количеств препарата - 80% при 6 исследованных параллельных пробах. Стандартное отклонение отдельного определения +/- 10,5%. Относительное стандартное отклонение 0,13. Доверительный интервал среднего значения из 6 определений при надежности 0,95 равен
+/- 13,8%.
Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий.
Реактивы и материалы. Аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы типа АФА-БА, АФА-ХА и т.п. Иммерсионное масло. Малахитовый зеленый, 5-процентный водный раствор. Метиленовый синий, 0,3-процентный спиртовой раствор. Мясо-пептонный агар 1,5-процентный, pH 7,0 — 7,2. Физиологический раствор (0,85-процентный водный раствор хлорида натрия) стерильный. Формалин. Эозин, 0,5-процентный водно-карболовый раствор.
Приборы, аппаратура, посуда. Автоклав. Аппарат для встряхивания. Водяная баня. Колбы на 100 мл. Микроскоп. Петля микробиологическая. Пипетки на 1 и 10 мл. Пробирки. Резиновые соединительные трубки. Стекла предметные. Термостат. Фильтродержатели. Чашки Петри. Шпатель Дрыгальского. Эксикатор. Электроаспиратор.
Посуду и питательные среды стерилизуют в автоклаве при 120 °C 30 мин. Аналитические фильтры стерилизуют в эксикаторе в парах формалина в течение 24 ч.
Отбор проб. Бактериальные инсектицидные препараты (бациллы турингиензис) улавливают из воздуха на аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы путем фильтрации через них воздуха. Через фильтр просасывают 10 — 100 мл воздуха со скоростью 5 — 15 л/мин. и более. Пробы растений, почвы и других объектов окружающей среды отбирают в количестве 100 — 150 г. Пробы отбирают и хранят, соблюдая стерильность. Хранят при температуре 2 — 5 °C.
Ход анализа. Аналитический фильтр или навеску растений, почвы и т.п. в количестве 1 — 2 г помещают в колбу, заливают 10 — 20 мл физиологического раствора и смывают бациллы турингиензис путем встряхивания в течение 20 — 30 мин. Затем колбу помещают в водяную баню с температурой воды 80 °C на 10 мин. Из пастеризованного смыва готовят разведения в физиологическом растворе 1:10, 1:100, 1:1000 и т.д. На чашки Петри с мясо-пептонным агаром засевают по 0,1 мл исходного смыва и его разведений (в зависимости от предполагаемого бактериального обсеменения исследуемой пробы). На каждое разведение используют по 2 — 5 чашек. Чашки Петри помещают в термостат с температурой нагрева 28 °C. Через 48 — 72 ч проводят идентификацию и подсчет колоний бацилл турингиензис. При идентификации учитывают внешний вид колоний (компактные, 1,5 — 2,5 мм в диаметре, сероватого цвета с ризоидными краями) и готовят из «характерных» колоний препараты для микроскопического исследования.
На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и микробную массу из части колонии, смешивают и распределяют на площади 1 — 2 кв. см, высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и красят раствором метиленового синего в течение 2 — 3 мин. Рассматривают препарат в микроскоп через иммерсионную систему.
Бациллы турингиензис — сине-фиолетовые крупные палочки (2,5 — 5,0 x 1,3 — 1,8 мкм) с закругленными концами, единичные или в виде нитей из 5 — 10 клеток. Через 48 — 72 ч роста на мясо-пептонном агаре бациллы турингиензис образуют споры (овальной формы, 0,7 x 1,0 мкм, размещены около центра клетки) и кристаллоидные белоксодержащие включения эндотоксина (ромбовидной или овальной формы, 0,5 x 2,0 мкм). Для дифференциации бацилл турингиензис от бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий применяют специальный метод окраски препаратов.
Мазок красят раствором малахитового зеленого при подогреве над пламенем горелки до появления паров, промывают водой и докрашивают в течение 30 с водно-карболовым раствором эозина. При этом способе окраски споры становятся зелеными, а кристаллы эндотоксина — красными. Бациллы цереус и другие почвенные спорообразователи не содержат указанных внутриклеточных включений, что и служит дифференциальным признаком.
После идентификации подсчитывают колонии бацилл турингиензис, выросшие на каждой чашке Петри. В расчет обсемененности исследованной пробы принимают то разведение смыва, при дублированном посеве которого на чашках Петри выросло по 25 — 250 колоний бацилл турингиензис.
Обработка результатов анализа. Концентрацию бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе воздуха (X, м.т./куб. м), почвы, растений и т.п. (X, м.т./кг) рассчитывают по формуле:
1000ABV
1
A — среднее значение количества колоний бацилл турингиензис на чашках Петри, засеянных принятым в расчет разведенным смывом;
B — принятое в расчет разведение смыва (1, 10, 100 и т.п.);
V — объем засеянного на чашку Петри разведенного смыва, мл;
V — объем пробы воздуха, приведенный к нормальным условиям, 2 или навеска пробы растений, почвы, л или г;
1000 — коэффициент пересчета в куб. м или г в кг.
Концентрация бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе может быть представлена в весовых единицах (мг/куб. м, мг/кг), для чего в знаменатель формулы следует ввести коэффициент C — стандартное содержание бацилл турингиензис в препарате, м.т./мг.
Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работ с непатогенными культурами бактерий и других микроорганизмов.